Artykuł metodologiczny

Metody hamowania produkcji pyomelaniny bakteryjnej i określania odpowiedniego wzrostu wrażliwości na stres oksydacyjny

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53105

⸱

31 sierpnia 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Wisconsin Milwaukee

W tym artykule

Podsumowanie

Bakteryjna produkcja pyomelaniny powoduje zwiększoną odporność na stres oksydacyjny i zjadliwość. Przedstawiamy techniki, które można wykorzystać do określenia zahamowania produkcji pyomelaniny i oznaczenia wynikającego z tego wzrostu wrażliwości na stres oksydacyjny u bakterii, a także określenia minimalnego stężenia hamującego antybiotyk (MIC).

Streszczenie

Pyomelanina to zewnątrzkomórkowy czerwono-brązowy pigment wytwarzany przez kilka gatunków bakterii i grzybów. Pigment ten pochodzi ze szlaku katabolizmu tyrozyny i przyczynia się do zwiększenia odporności na stres oksydacyjny. Wytwarzanie pyomelaniny w Pseudomonas aeruginosa jest zmniejszone w sposób zależny od dawki poprzez traktowanie 2-[2-nitro-4-(trifluorometylo)benzoilo]-1,3-cykloheksanodionem (NTBC). Opisujemy metodę miareczkowania wykorzystującą wiele stężeń NTBC w celu określenia stężenia leku, który zmniejszy lub zniesie produkcję pyomelaniny u bakterii. Metoda miareczkowania daje łatwy do oszacowania wynik, jakim jest widoczne zmniejszenie produkcji pigmentu wraz ze wzrostem stężenia leku. Opisano również metodę mikromiareczkowania na płytkach do oznaczania minimalnego stężenia hamującego antybiotyk (MIC) u bakterii. Metoda ta zużywa minimalną ilość zasobów i można ją łatwo skalować w celu przetestowania wielu antybiotyków na jednej płytce mikromiareczkowej dla jednego szczepu bakterii. Test MIC można dostosować do badania wpływu związków niebędących antybiotykami na wzrost bakterii w określonych stężeniach. Na koniec opisujemy metodę badania wrażliwości bakterii na stres oksydacyjny poprzez włączenieH2O2do płytek agarowych i wykrycie wielu rozcieńczeń bakterii na płytkach. Na wrażliwość na stres oksydacyjny wskazuje zmniejszenie liczby i wielkości kolonii dla różnych rozcieńczeń na płytkach zawierającychH2O2w porównaniu z kontrolą bez H2O2. Test punktowy stresu oksydacyjnego wykorzystuje minimum zasobów i niskie stężeniaH2O2. Co ważne, ma również dobrą odtwarzalność. Ten punktowy test płytkowy można dostosować do badania wrażliwości bakterii na różne związki poprzez włączenie związków do płytek agarowych i scharakteryzowanie powstałego wzrostu bakterii.

Wprowadzenie

Pseudomonas aeruginosa to bakteria Gram-ujemna, która wytwarza różne pigmenty, w tym pyomelaninę, czerwono-brązowy pigment, który pomaga zapewnić ochronę przed stresem oksydacyjnym1-4 i wiąże różne związki, w tym antybiotyki aminoglikozydowe5-7. Wytwarzanie pyomelaniny jest spowodowane defektem szlaku katabolizmutyrozyny 4,8, albo poprzez delecje lub mutacje genu kodującego homogentyzynatę 1,2-dioksygenazę (HmgA)1,9, albo przez brak równowagi w różnych enzymach w szlaku10. Homogentyzat gromadzi się w wyniku inaktywacji HmgA i jest wydzielany i utleniany, tworząc pyomelaninę11. Wytwarzanie pyomelaniny można znieść lub zmniejszyć w sposób zależny od dawki poprzez leczenie herbicydem 2-[2-nitro-4-(trifluorometylo)benzoilo]-1,3-cykloheksanodion (NTBC)12, który hamuje dioksygenazę 4-hydroksyfenylopirogronianową (Hpd) w szlaku katabolizmu tyrozyny13. Hpd jest niezbędny do tworzenia homogentyzystanu, a zatem pyomelaniny11.

Opisujemy szczegółowo trzy techniki, które były ważne w naszych badaniach nad leczeniem NTBC szczepów P. aeruginosa wytwarzających pyomelaninę. Techniki te obejmują miareczkowanie NTBC w celu określenia stężeń, które zniosą lub zmniejszą produkcję pyomelaniny w laboratoryjnych i klinicznych szczepach wytwarzających pyomelaninę, określenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) antybiotyków, gdy bakterie są traktowane NTBC oraz wynikającą z tego wrażliwość na stres oksydacyjny podczas leczenia NTBC.

Test miareczkowania, który opracowaliśmy, służy dwóm celom. Po pierwsze, test pozwoli użytkownikowi określić, czy NTBC może znieść lub zmniejszyć produkcję pyomelaniny w badanej bakterii i w jakich stężeniach. Umożliwi to użytkownikowi określenie wrażliwości na NTBC, ponieważ różne szczepy bakterii mogą mieć różną wrażliwość na ten związek, jak zaobserwowano u P. aeruginosa12. Po drugie, test miareczkowania NTBC pozwoli użytkownikowi określić odpowiednie stężenie NTBC do wykorzystania w kolejnych testach, takich jak testy MIC antybiotyku i odpowiedzi na stres oksydacyjny, jeśli celem jest zniesienie lub zmniejszenie produkcji pyomelaniny i określenie skutków redukcji pigmentu.

Test miareczkowania działa, ponieważ widoczna różnica w produkcji pyomelaniny może być widoczna w szczepach traktowanych NTBC, a różnice w produkcji pyomelaniny są zależne od dawki12. Dodatkowo technika ta może być stosowana do badania innych związków, które mogą eliminować lub zwiększać produkcję pigmentu u bakterii.

Antybiotykowe wartości MIC są używane do określania wrażliwości bakterii na antybiotyki. Istnieje kilka metod określania MIC, w tym płytki rozcieńczające agar i rozcieńczenia bulionu14. Rozcieńczanie bulionu można przeprowadzić w małych probówkach lub na 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania. Opisana w niniejszym dokumencie metoda oznaczania MIC na mikropłytkach pozwoli użytkownikowi na testowanie szerokiej gamy antybiotyków przy użyciu minimalnych zasobów. Test zapewnia powtarzalność, a także elastyczność w liczbie antybiotyków i szczepów badanych tą metodą. Dodatkowo, dzięki włączeniu NTBC do testu, użytkownik może określić, czy eliminacja lub zmniejszenie produkcji pyomelaniny zmienia wrażliwość na antybiotyki u bakterii wytwarzających pyomelaninę.

Odpowiedź bakterii na stres oksydacyjny może być testowana na kilka sposobów. Najpowszechniejszymi opisanymi metodami są albo żywe zliczanie bakterii poddanych stresowi oksydacyjnemu przez pewien okresczasu1, albo testy dyfuzji dyskowej stresu oksydacyjnego15. Metody te mają tendencję do wykorzystywania wysokich stężeń stresorów oksydacyjnych do badania skutków stresu oksydacyjnego u bakterii, a wyniki mogą być dość różne między kontrpróbami biologicznymi. Test zliczania żywotnego ma również tendencję do używania większej liczby płytek agarowych niż inne metody. Opisany przez nas test punktowy na płytkach wykorzystuje niskie stężeniaH2O2i pozwala użytkownikowi przetestować reakcję wielu szczepów na stres oksydacyjny przy użyciu minimalnej liczby płytek. Test jest również konsekwentnie powtarzalny między kontrpróbami technicznymi i biologicznymi. Ponieważ pyomelanina bierze udział w odporności na stres oksydacyjny, włączenie NTBC do testu pozwala użytkownikowi określić wpływ eliminacji produkcji pyomelaniny na odporność na stres oksydacyjny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych, antybiotyków i 2-[2-nitro-4-(trifluorometylo)benzoilo]-1,3-cykloheksanodion (NTBC)

  1. Przygotować bulion LB (1% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,25% NaCl w H2O) i podwielokrotność do odpowiednich objętości. Sterylizuj w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotować 100 ml agaru LB (1% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,25% NaCl, 1,5% agaru w H2O) w kolbach o pojemności 250 ml. Sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że agar jest stopiony przed przelaniem do talerzy.
    UWAGA: Kolby zawierające 100 ml agaru LB dają 4 płytki. Ilość agaru LB można zmienić, aby odpowiadała liczbie płytek potrzebnych do testu.
  3. Zrób PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)16. Sterylizować w autoklawie lub filtracji i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotuj roztwory podstawowe antybiotyków dla gentamycyny, kanamycyny i tobramycyny.
    1. Przygotować odpowiednie stężenia podstawowe antybiotyków dla szczepów P. aeruginosa zawierających 100 mg/ml gentamycyny, 30 mg/ml kanamycyny i 10 mg/ml tobramycyny. Antybiotyki rozpuścić w wodzie, przefiltrować, wysterylizować (0,2 μm) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Zmieniać antybiotyki i ich stężenia w zależności od badanej bakterii.
  5. Przygotować roztwory podstawowe NTBC. Rozpuścić 10 mg NTBC w 400 μl DMSO. Daje to stężenie 75,9 mM NTBC. Roztwory podstawowe NTBC należy przechowywać w temperaturze -20 °C. W razie potrzeby rozmrozić roztwory w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Różne źródła NTBC różnią się rozpuszczalnością. Określ odpowiedni pojazd, w którym należy rozpuścić NTBC w oparciu o zalecenia producenta i odpowiednio dostosuj krok 1.5.

2. Miareczkowanie NTBC szczepów bakteryjnych

  1. Przygotuj nocne kultury szczepów, które mają być testowane. Dodaj 2 ml bulionu LB do probówek 16 x 150 mm (po jednej na szczep) i zaszczepij 1 izolowaną kolonią z każdego szczepu. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem na rotatorze do hodowli tkankowych w inkubatorze powietrznym.
  2. Następnego dnia przygotuj miareczkowanie NTBC w bulionie LB. Użyj początkowego zakresu od 0 do 900 μM NTBC, ponieważ różne szczepy mają różną czułość na NTBC.
    1. Dodaj 1 ml bulionu LB do 4 do 5 probówek (16 x 150 mm) na szczep.
    2. Dodać roztwór podstawowy NTBC (75,9 mM) do probówek (16 x 150 mm) w różnych stężeniach. Patrz tabela 1, aby zapoznać się ze stężeniami NTBC i odpowiadającymi im objętościami zapasów, które należy dodać do 1 ml bulionu LB.
  3. Zmierz OD600 kultur z nocy. Umyj kultury przed wykonaniem odczytów OD600, aby wyeliminować pyomelaninę obecną w pożywce.
    1. Umyć kultury przez odwirowanie 1 ml kultury w mikrowirówce o stężeniu 16 000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant i wszelkie luźno granulowane komórki za pomocą mikropipetora i ponownie zawiesić osad z komórek stałych w 1 ml LB.
  4. Zaszczepić probówki miareczkowania przy OD600 0,05. Oblicz ilość umytej kultury potrzebnej do zaszczepienia probówek.
    UWAGA: Do inokulacji należy użyć umytych kultur, ponieważ pyomelanina nie powinna być obecna.
  5. Inkubować probówki miareczkowe przez około 24 godziny w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem za pomocą rotatora kultur tkankowych w inkubatorze powietrznym.
  6. Sfotografuj probówki do miareczkowania i porównaj produkcję pigmentu w obrębie szczepów i między nimi, aby określić ilość NTBC do użycia w testach MIC i stresu oksydacyjnego. Użyj odczytów OD600, aby określić ilość pyomelaniny w supernatancie do hodowli bezkomórkowych i określić gęstość komórek.
    UWAGA: Stosunek OD600 pyomelaniny w supernatancie hodowli do komórek można obliczyć w celu ilościowego określenia różnic w produkcji pyomelaniny po traktowaniu NTBC.

3. Test minimalnego stężenia hamującego antybiotyk (MIC) na płytkach 96-dołkowych

  1. Przygotuj nocne hodowle szczepów, które mają być testowane w LB z NTBC.
    i bez niego. UWAGA: Ten protokół jest opisany przy użyciu reprezentatywnego poziomu 300 μM NTBC. Odpowiedni poziom NTBC, który należy zastosować, określa się w kroku 2.6.
    1. Dodać 300 μM NTBC do 2 ml LB. Dodać równoważną objętość nośnika (DMSO) do 2 ml LB dla stanu braku NTBC.
    2. Za pomocą sterylnych wykałaczek zaszczep probówki jedną izolowaną kolonią bakterii. Dla każdego szczepu będzie jedna kultura z NTBC i jedna kultura bez NTBC. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem za pomocą rotatora do hodowli tkankowych w inkubatorze powietrznym.
  2. Następnego dnia wykonaj główne roztwory LB + NTBC i LB + DMSO w celu skonfigurowania testu MIC. Dodać NTBC w stężeniu 600 μM, ponieważ zostanie on rozcieńczony dwukrotnie po dodaniu inokulum, uzyskując końcowe stężenie 300 μM.
    1. Aby przetestować jeden antybiotyk dla jednego szczepu, dodaj 600 μM NTBC do 2 ml LB i wymieszaj, aby uzyskać roztwór główny NTBC. Dodać równoważną objętość nośnika (DMSO) do 2 ml LB i wymieszać, aby uzyskać roztwór główny NTBC. Użyj tych roztworów do tworzenia roztworów podstawowych antybiotyków, a także do ustawiania serii rozcieńczeń na płytkach 96-dołkowych.
      UWAGA: Preparaty roztworów wzorcowych dają dodatkowy roztwór, który uwzględnia błędy pipetowania. Roztwory główne można skalować w górę lub w dół w zależności od potrzeb, w zależności od liczby testowanych antybiotyków i szczepów.
  3. Przygotować roztwory antybiotyków w roztworach głównych LB + NTBC lub LB + DMSO.
    UWAGA: Stężenie antybiotyku w tych roztworach powinno być dwukrotnie wyższe od końcowego pożądanego stężenia. Należy przygotować wystarczającą ilość roztworu, aby przenieść 100 μl do czterech dołków w 96-dołkowej płytce.
    1. Przygotować roztwór podstawowy gentamycyny +/- NTBC o stężeniu 64 μg/ml. Aby przygotować ten roztwór, dodaj 0,288 μl bulionu gentamycyny (100 mg/ml) do 450 μl LB + NTBC lub LB + DMSO roztwór główny.
      UWAGA: Maksymalne stężenie gentamycyny dla P. aeruginosa PAO1 wynosi 32 μg/ml.
    2. Przygotować roztwór podstawowy kanamycyny +/- NTBC o stężeniu 256 μg/ml. Aby przygotować ten roztwór, dodaj 3,84 μl wywaru kanamycyny (30 mg/ml) do 450 μl roztworów głównych LB + NTBC lub LB + DMSO.
      UWAGA: Maksymalne stężenie kanamycyny dla P. aeruginosa PAO1 wynosi 128 μg/ml.
    3. Przygotować roztwór podstawowy tobramycyny +/- NTBC o stężeniu 8 μg/ml. Aby przygotować ten roztwór, dodaj 0,36 μl tobramycyny (10 mg/ml) do 450 μl roztworów głównych LB + NTBC lub LB + DMSO.
      UWAGA: Dla P. aeruginosa PAO1 maksymalne stężenie tobramycyny wynosi 4 μg/ml.
      UWAGA: Antybiotyki i ich stężenia można dostosować do badanych bakterii.
  4. Dodaj 100 μl każdego 2x roztworu antybiotyku do czterech dołków w 96-dołkowej płytce. Umieść te roztwory w rzędzie A. Na przykład gentamycyna powinna być umieszczona w A1 do A4, kanamycyna powinna być umieszczona w A5 do A8, a tobramycyna powinna być umieszczona w A9 do A12. Rysunek 1A przedstawia schemat zestawu płytek 96-dołkowych.
    UWAGA: Na jednej płytce można testować wiele antybiotyków, ale tylko jeden szczep powinien być testowany na płytce, aby wyeliminować możliwość zanieczyszczenia krzyżowego przez inne szczepy.
  5. Dodać 50 μl roztworu głównego LB + NTBC lub LB + DMSO do rzędów od B do H płytki 96-dołkowej. Upewnij się, że jedna tabliczka to LB + NTBC, a jedna płyta to LB + DMSO. Zobacz rysunek 1A.
    1. Użyj LB + NTBC dla antybiotyków w LB + NTBC. Użyj LB + DMSO dla antybiotyków w LB + DMSO.
  6. Za pomocą mikropipety wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia antybiotyków, przenosząc 50 μl roztworu z rzędu A do rzędu B. Wymieszać roztwór, zmienić końcówki pipet i przenieść 50 μl roztworu z rzędu B do rzędu C. Powtórzyć dla pozostałych rzędów. Po rozcieńczeniu rzędu G usunąć 50 μl roztworu z tego rzędu i wyrzucić. Użyj rzędu H jako środka zapobiegającego rozwojowi bakterii. Patrz rysunek 1B.
    UWAGA: Każda studzienka w rzędach od A do G zawiera teraz 50 μl antybiotyku w LB + NTBC lub LB + DMSO w stężeniu 2X wyższym niż końcowe pożądane stężenie. Rząd H zawiera LB + NTBC lub LB + DMSO bez antybiotyków.
  7. Zmierz OD600 kultur z nocy. Umyj wszystkie kultury przed wykonaniem odczytów OD600, aby wyeliminować pyomelaninę obecną w pożywce.
    1. Umyć kultury przez odwirowanie 1 ml kultury w mikrowirówce o stężeniu 16 000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant za pomocą mikropipetora i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml LB.
  8. Rozcieńczyć nocne kultury do 2,75x105 jtk/ml w LB.
    UWAGA: Załóżmy, że jedna jednostka OD600 jest odpowiednikiem 1x109 CFU/ml dla P. aeruginosa. Konwersje OD do CFU/ml mogą być różne u innych bakterii.
  9. Dodać 50 μl rozcieńczonej kultury bakteryjnej do odpowiedniego dołka.
    UWAGA: Kultury wyhodowane w NTBC należy dodać do studzienek zawierających NTBC, a kultury wyhodowane w DMSO należy dodać do studzienek zawierających DMBO. Zobacz rysunek 1B.
    1. Dodaj bakterie do trzech studzienek dla każdego szczepu i stężenia antybiotyku. Dodać 50 μl LB do czwartej studzienki, aby działała jako kontrola zanieczyszczenia bakteryjnego. Zobacz rysunek 1B.
    2. Użyj wielokanałowego mikropipetora do zaszczepienia studzienek. Upewnij się, że końcówki pipet znajdują się blisko dna studzienek podczas dodawania inokulum, aby zapobiec zanieczyszczeniu sąsiednich studzienek.
      UWAGA: Dodanie kultury bakteryjnej do studzienek spowoduje dwukrotne rozcieńczenie stężenia antybiotyku i NTBC.
  10. Przykryć 96-dołkowe płytki parafilmem i inkubować przez około 24 godziny w temperaturze 37 °C. Inkubować płytki 96-dołkowe statycznie w inkubatorze powietrznym.
  11. Sprawdź płytki pod kątem rozwoju bakterii w studzienkach. MIC to najniższe stężenie antybiotyku, w którym nie obserwuje się wzrostu bakterii dla wszystkich trzech kontrprób każdego szczepu.
    1. Zbadaj wzrokowo płytkę pod kątem wzrostu lub odczytaj za pomocą czytnika płytek ustawionego na OD600.

4. Test punktowy płytki do odpowiedzi na stres oksydacyjny

  1. Ustawić nocne hodowle szczepów, które mają być testowane w LB z NTBC i bez NTBC, jak opisano w kroku 3.1.
  2. Następnego dnia przygotuj płytki agarowe LB zawierająceH2O2jako stresor oksydacyjny. Dobrym punktem wyjścia jest zakres stężeńH2O2od 0 do 1 mM.
    1. Stopić kolby agarowe LB. Schłodzić podłoże do temperatury około 50 °C w temperaturze pokojowej.
    2. DodaćH2O2bezpośrednio do schłodzonego podłoża w żądanych stężeniach. Zakręć kolbami do wymieszania. Patrz tabela 2 dla stężeńH2O2i objętości stężonegoH2O2do dodania. Wartości te są oparte na 100 ml agaru LB.
    3. Wlać płytki natychmiast po dodaniuH2O2i podpalić powierzchnię, aby usunąć pęcherzyki. Wydajność wynosi 4 płytki na 100 ml agaru LB. Oznaczyć płytki stężeniem H2O2
      4. .
    4. Umieść płytki bez przykrycia w biologicznym okapie przepływowym z wentylatorem pracującym przez 30 minut, aby usunąć nadmiar wilgoci z płyt.
      UWAGA: Talerze należy zużywać tego samego dnia, w którym zostały przygotowane. Niezastosowanie się do tego może skutkować niespójnymi danymi.
      UWAGA: Stresory oksydacyjne, takie jak parakwat, można zastąpićH2O2w tym teście. Stężenia stosowane dla innych stresorów oksydacyjnych mogą różnić się od stężeń stosowanych dlaH2O2.
  3. Umyć i zmierzyć OD600 kultur nocnych zgodnie z opisem w kroku 3.7.
  4. Znormalizować OD600 wszystkich nocnych kultur do najniższej wartości dla badanego zestawu szczepów. P. aeruginosa ma na ogół OD600 około 2,5, gdy jest uprawiana przez noc w LB + NTBC lub LB + DMSO.
    1. Określić objętość kultury potrzebną do rozcieńczenia kultury do najniższego OD600 w całkowitej objętości 1 ml. Na przykład, jeśli kultura ma OD600 równe 3, a najniższa OD600 dla zestawu szczepów wynosi 2,5, wykonaj następujące obliczenia: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml kultury zostanie umieszczone w probówce do mikrofuge.
    2. Oblicz ilość LB + NTBC (300 μM) lub LB + DMSO potrzebną do doprowadzenia objętości kultury do 1 ml. W przykładzie w kroku 4.4.1 ilość LB + NTBC lub LB + DMSO dodana do kultury wynosiłaby 0,167 ml (1 ml całkowita objętość – 0,833 ml kultury). Przygotować roztwory podstawowe LB + NTBC i LB + DMSO do użycia do tych rozcieńczeń w oparciu o objętość potrzebną do rozcieńczenia wszystkich szczepów.
    3. Wymieszaj kulturę i LB + NTBC lub LB + DMSO przez wirowanie.
  5. Aby utrzymać kultury w stałym stężeniu NTBC lub DMSO, należy wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia znormalizowanych kultur nocnych w PBS + NTBC lub PBS + DMSO.
    1. Wykonaj roztwory podstawowe PBS + NTBC i PBS + DMSO. Dla jednego zestawu rozcieńczeń dla jednego szczepu zmieszać 300 μM NTBC lub równoważną objętość DMSO z PBS, aby uzyskać całkowitą objętość 720 μl. Skaluj te zapasy w górę lub w dół w zależności od liczby testowanych szczepów.
    2. Oznacz probówki do mikrofuge dla 10-1 do 10-7 seryjnych rozcieńczeń. Dodać 90 μl PBS + NTBC lub PBS + DMSO do odpowiednich probówek. Użyj PBS + NTBC dla odmian uprawianych w LB + NTBC i użyj PBS + DMSO dla odmian uprawianych w LB + DMSO.
    3. Dodać 10 μl kultury do odpowiedniej probówki do rozcieńczania 10:1. Wymieszać przez wirowanie i przenieść 10 μl rozcieńczenia 10-1 do probówki z rozcieńczalaniem 10-2. Powtarzać, aż wszystkie rozcieńczenia zostaną wykonane. Zmieniaj końcówki pipet między rozcieńczeniami.
  6. Umieścić 5 μl rozcieńczeń od 10-3 do 10-7 na płytkach LB + H2O2 dwukrotnie dla każdego szczepu. Użyć jednej końcówki pipety, jeśli plamki są pokryte od najbardziej rozcieńczonego do najmniej rozcieńczonego (10-7 do 10-3). Nie przechylaj ani nie przechylaj płytki, dopóki płyn nie wyschnie w talerzu.
  7. Inkubować płytki przez 24-48 godzin w temperaturze 37 °C (inkubator powietrzny), w zależności od szczepu.
    UWAGA: P. aeruginosa PAO1 będzie miał dobrej wielkości kolonie na LB po 24 godzinach inkubacji. Szczepy należy inkubować, aż uzyskają kolonie mniej więcej tej samej wielkości co PAO1.
  8. Sfotografuj płyty za pomocą kamery CCD umieszczonej nad transluminatorem. Opcjonalnie edytuj zdjęcia pod kątem kontrastu i przytnij je do tego samego rozmiaru. Policz liczbę kolonii w każdym miejscu, aby określić zmiany wrażliwości na stres oksydacyjny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Miareczkowanie NTBC

Miareczkowania NTBC zostały wykorzystane do ustalenia, czy NTBC jest w stanie zredukować produkcję pyomelaniny w P. aeruginosa, a także do zidentyfikowania stężenia NTBC, które eliminuje lub redukuje produkcję pyomelaniny w celu zastosowania w dodatkowych testach. Poziomy produkowanej pyomelaniny mogą różnić się w poszczególnych powtórzeniach, jednak ogólne trendy pozostają stałe. Test miareczkowania NTBC można również zmodyfikować w celu przetestowania innych zwią...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda miareczkowania NTBC opisana w tym protokole pozwoli użytkownikowi określić, czy NTBC może zmniejszyć lub wyeliminować produkcję pyomelaniny u bakterii oraz określić wymagane stężenie NTBC. Najbardziej krytycznym krokiem w teście miareczkowania NTBC jest określenie zakresu stężeń NTBC do zastosowania w teście. Różne szczepy P. aeruginosa mają różną wrażliwość na NTBC, a szczepy laboratoryjne mogą być bardziej wrażliwe na NTBC niż izolaty kliniczne12 (ryc. 2). W związku z tym kon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Darze Frank i Carrie Harwood za ich hojny wkład w rozwój szczepów. University of Wisconsin Milwaukee Research Foundation posiada patent nr 8,354,451; z oświadczeniami szeroko ukierunkowanymi na leczenie lub hamowanie postępu zakażenia mikroorganizmem u pacjenta poprzez podawanie związku hamującego dioksygenazę 4-hydroksyfenylopirogronianu, takiego jak 2-[2-nitro-4-(trifluorometylo)benzoilo]-1,3-cykloheksanodion (NTBC). Wynalazcami są Graham Moran i Pang He. Badania te były wspierane przez National Institutes of Health (R00-GM083147). Biblioteka mutantów transpozonów P. aeruginosa Uniwersytetu Waszyngtońskiego jest obsługiwana przez NIH P30 DK089507.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-[2-nitro-4-(trifluorometylo)benzoilo]-1,3-cykloheksanodion (NTBC)Sigma-AldrichSML0269-50mgZwany również nityzynonem.  Rozpuszczalny w DMSO.
H2O2Sigma-Aldrich216763-100ML30 % wag. % w H2O.  Stabilizowane.
GentamycynaGold BioG-400-100rozpuszczalna w H2O.  Filtruj sterylizację.
KanamycinFisher ScientificBP906-5Rozpuszczalny w H2O.  Filtruj sterylizację.
TobramycynaSigma-AldrichT4014-100MGRozpuszczalny w H2O.  Filtruj sterylizację.

Bibliografia

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092(2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Miareczkowanie NTBCtest stresu oksydacyjnegotest MICwra liwo bakteryjnanadtlenek wodoruoporno na antybiotykimetoda nak adania kropelrozcie czenia seryjnePseudomonas aeruginosa

Powiązane artykuły