Ocena uczulenia behawioralnego wywołanego kokainą i uwarunkowanej preferencji miejsca u myszy

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu umożliwienie badaczom przeprowadzania eksperymentów mających na celu przetestowanie tych aspektów uzależnienia za pomocą testów warunkowej preferencji miejsca i uwrażliwienia lokomotorycznego.

Streszczenie

Uważa się, że satysfakcjonujące doświadczenia z narkotykami tworzą silne skojarzenia kontekstowe i zachęcają do wielokrotnego zażywania. Z kolei powtarzające się narażenie na narkotyki powoduje trwałe zmiany w funkcjonowaniu mózgu osób wrażliwych, a te trwałe zmiany prawdopodobnie służą utrzymaniu nieprzystosowawczych zachowań związanych z poszukiwaniem i zażywaniem narkotyków charakterystycznych dla uzależnienia^/uzależnienia. U gryzoni doświadczenie nagrody i powiązania kontekstowe są często mierzone za pomocą testu preferencji miejsca uwarunkowanego (CPP), w którym mierzy się preferencję dla kontekstu wcześniej sparowanego z lekiem. Z drugiej strony uczulenie behawioralne to wzrost zachowania wywołanego przez leki, które rozwija się stopniowo w miarę powtarzających się ekspozycji. Ponieważ zachowania uczulone mogą być często mierzone po kilku miesiącach abstynencji od narkotyków, w zależności od dawki i długości początkowej ekspozycji, są one uważane za obserwowalne korelaty trwałej plastyczności wywołanej przez lek. Naukowcy odkryli, że testy te są przydatne w określaniu substratów neurobiologicznych pośredniczących w aspektach uzależnienia, a także w ocenie potencjału różnych interwencji w zakłócaniu tych zachowań. Manuskrypt ten opisuje podstawowe, skuteczne protokoły CPP myszy i uwrażliwienia lokomotorycznego na kokainę.

Wprowadzenie

Badania mające na celu zrozumienie uzależnienia od narkotyków za pomocą modeli zwierzęcych muszą przyjmować różne podejścia, aby zająć się każdym z różnych elementów, które utrudniają sukces leczenia, w tym nagrodą/wzmocnieniem/motywacją oraz wycofaniem i nawrotem, a także ogólną uporczywością, która jeszcze bardziej komplikuje te problemy w uzależnieniu. Ponieważ uważa się, że satysfakcjonujące doświadczenia związane z zażywaniem narkotyków lub nadużywaniem motywują do ich późniejszego stosowania, badania koncentrujące się na powiązaniach z kontekstem narkotykowym mogą być szczególnie przydatne do zrozumienia mechanizmów mózgowych, które przyczyniają się do zażywania i poszukiwania narkotyków. Jeden z takich testów, warunkowa preferencja miejsca (CPP), jest wysokoprzepustową metodą porównywania różnic grupowych w wrażliwości nagrody. Tradycyjna interpretacja zadania obejmuje warunkowanie klasyczne lub Pawłowa, w którym bodziec warunkowy (CS) jest sparowany z bodźcem bezwarunkowym (UCS), a po wielu parach CS wywołuje takie samo zachowanie jak UCS (patrz^{jednak 39,40}). Teoretycznie zwierzęta uczą się kojarzyć stan interoceptywny (nagrodę lub niechęć) ze wskazówkami kontekstowymi. Względna intensywność awersyjna lub pożądawcza stanu interoceptywnego jest następnie oceniana poprzez określenie preferencji zwierzęcia dla wskazówek kontekstowych. Zastosowanie warunkowania miejsca do pomiaru powiązań między narkotykiem a nagrodą sięga co najmniej 1957 roku, do badania z użyciem morfiny na szczurach w labiryncie Y^3,4. W ciągu ostatnich kilku dekad różne wersje tej metody były szeroko stosowane do badania preferencji miejscowych i niechęci gryzoni do różnych bodźców i pozostaje ona szczególnie przydatna w badaniu powiązań wywołanych przez narkotyki lub nadużywanie. W badaniach nad uzależnieniem od narkotyków test został wykorzystany do oceny nagradzających właściwości wielu leków oraz udziału różnych układów mózgowych i białek w nagrodzie za lek (dla przeglądów, patrz^5-7,44). Chociaż istnieją lepsze metody oceny czynników, które przyczyniają się do uzależnienia od narkotyków, a mianowicie samodzielne podawanie leków, CPP jest prostym i znacznie bardziej dostępnym podejściem do pomiaru funkcji nagrody.

Większość obecnych protokołów dla warunkowej preferencji i awersji do miejsca (CPA) używa urządzenia, które pozwala gryzoniom na dostęp do dwóch odrębnych komór, albo przez drzwi, albo przez mniejsze komory łączące. Rozróżnienie między tymi dwiema komorami często opiera się co najmniej na wskazówkach wizualnych i dotykowych, w tym kolorze ścian i fakturze podłogi, ale czasami obejmuje inne elementy, takie jak wskazówki węchowe. "Stronnicze" projekty zazwyczaj próbują odwrócić istniejącą, wrodzoną preferencję dla jednej komory nad drugą, taką jak ta, którą gryzonie zwykle wykazują dla czarnej komory nad białą. "Bezstronne" projekty mają na celu stworzenie preferencji dla jednej z dwóch izb, które początkowo były równie atrakcyjne, poprzez losowe równoważenie przypisania do dowolnej izby w grupie. "Zrównoważony" projekt jest stosowany, gdy zwierzęta wykazują małe preferencje, ale jako grupa nie faworyzują tej samej komory. Celem tego ostatniego projektu jest uzyskanie 1) wyników preferencji przed testem dla (ewentualnej) komory sparowanej z kokainą, które nie różnią się znacząco między grupami eksperymentalnymi oraz 2) znikomej preferencji dla komory sparowanej kokainą w okresie poprzedzającym test, pozytywnej lub negatywnej⁸. Zrównoważona konstrukcja jest idealna do użytku z opisanymi komorami, które wykorzystują sprzeczne odchylenia dotyczące koloru ścian (na białym) i podłogi (drut na belce), co skutkuje mniej więcej równym rozkładem małych preferencji zarówno dla czarnej, jak i białej strony u różnych zwierząt. Obliczenia równoważące są szczegółowo opisane poniżej.

Podczas warunkowania, zwierzęta są wystawiane na działanie narkotyku i szybko umieszczane w jednym z tych dwóch środowisk na ograniczony okres czasu. Narażenie odbywa się zazwyczaj poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) lub czasami podskórne (s.c.), chociaż opracowano również paradygmaty samodzielnego podawania dożylnego (iv)⁹ i wlewów wewnątrzczaszkowych³⁸ w aparacie preferencji miejsca. Uzupełnieniem tych parowań są pary nielekowe (nośnikowe) o tej samej długości prowadzone w przeciwległej komorze, które mogą mieć miejsce w tym samym dniu co parowanie leków lub w oddzielnych dniach. Ogólnie rzecz biorąc, gdy pozwoli się im zbadać aparaturę po kondycjonowaniu, zwierzęta spędzą więcej czasu w miejscu, w którym otrzymały lek nagradzający (tj. taki, który ludzie i zwierzęta dobrowolnie sami podadzą), podczas gdy będą unikać miejsca, w którym podano im lek wywołujący chorobę (np. chlorek litu). Kilka badań poświęcono optymalizacji warunków preferencji miejsca dla różnych narkotyków stosowanych w narkotykach (przegląd, patrz⁷). Dawki kokainy (i.p.) dla myszy na ogół wahają się od 1 do 20 mg / kg, przy czym dawki mniejsze niż 5 mg / kg są często używane do analizowania wysokiej czułości w jednej grupie. W przypadku dorosłych myszy¹⁰ zwykle wymagane są dwie lub więcej par leków, a długość tych par jest ważnym czynnikiem. Bardzo niskie dawki kokainy wymagają natychmiastowego i krótkotrwałego kondycjonowania, prawdopodobnie dlatego, że ta metoda pozwala uchwycić najbardziej satysfakcjonujący okres ekspozycji. Opóźnione lub bardzo długie okresy warunkowania mogą skutkować brakiem preferencji, a nawet mogą wywoływać niechęć^11,12. Przedstawiono podstawową metodę uzyskiwania warunkowej preferencji miejsca do kokainy u dorosłych myszy.

Chociaż test CPP jest idealną metodą do oceny uczenia się związanego z nagrodą i pamięci skojarzeń związanych z kontekstem leku, uczulenie behawioralne jest prawdopodobnie łatwiejsze do przeprowadzenia i pozwala ocenić zmiany, które rozwijają się w trakcie wielokrotnego leczenia. Znane również jako tolerancja odwrotna, zachowania poddawane uczuleniu są stopniowo wzmacniane w trakcie powtarzających się ekspozycji na określony narkotyk, zwłaszcza psychostymulanty, a uczulenie krzyżowe występuje między niektórymi, ale nie wszystkimi, z tych leków. Jedna z pierwszych ocen uczulenia lokomotorycznego wywołanego kokainą, w szczególności u gryzoni, została opublikowana w 1976^roku13. Wiele laboratoriów wykazało, że uczulona lokomocja jest wykrywalna długo po odstawieniu leku, w zależności od pierwotnej długości, miejsca i dawki ekspozycji^14-17, a obecny protokół był używany do wykrywania uczulenia nawet przez 10 miesięcy po siedmiu dniach (30 mg / kg) leczenia kokainą u myszy¹⁸. Test może być wykonywany przy użyciu technologii fotowiązki lub śledzenia wideo, w aparatach o różnych rozmiarach i kształtach, co ułatwia jego wykonanie wielu laboratoriom. Solidny charakter, prostota i trwałość uczulenia lokomotorycznego sprawia, że jego ocena jest idealnym elementem badania podstawowych mechanizmów długotrwałych zmian w zachowaniu wywołanym przez leki.

Jak zostało rozwinięte w dyskusji, ważnym czynnikiem podczas przeprowadzania testu uczulającego lokomotorycznie jest to, czy lek jest podawany w środowisku domowym czy w klatce testowej. Aby wykorzystać silne uczulenie, które występuje, gdy podawanie leku odbywa się poza klatką domową, w tym protokole zastosowano tę metodę. Zaobserwowano jednak, że gdy zwierzęta nie są odpowiednio przyzwyczajone do nowego środowiska przed ekspozycją na lek, w pierwszym dniu występuje efekt sufitu wywołany nowością, który może częściowo lub całkowicie maskować postępujący charakter uczulenia. Jest prawdopodobne, że reprezentuje to synergiczne działanie lokomotoryczne leku wraz z nowością i chociaż mechanizmy leżące u podstaw takich efektów mogą być interesujące, opisana metoda ma na celu zmniejszenie roli nowości i umożliwienie bardziej niezależnego pomiaru efektów działania leku. Chociaż oczekuje się, że metoda ta będzie przydatna w ocenie innych leków uczulających na ruch ruchowy, przede wszystkim oceniono jej skuteczność z kokainą u myszy C57BL/6.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Szpitalu McLean. UWAGA: Poniższy protokół opisuje pojedyncze podejście do CPP i uczulenia lokomotorycznego, którego wiele szczegółów różni się od innych skutecznych protokołów (np. testy fazy jasnej i ciemnej, dawkowanie sekwencyjne i przerywane itp.). Nowicjusze mogą chcieć zacząć od tych protokołów lub po prostu użyć ich jako przewodników, dostosowując zmiany z literatury w oparciu o pytania eksperymentalne. Opisano zautomatyzowane metody pomiaru; Możliwe jest jednak użycie środków niezautomatyzowanych do każdego testu (tj. nagrywania wideo, ręcznej oceny).

1. Preferencja miejsca warunkowego

1. Wyposażenie i wyposażenie pomieszczenia:
   1. Z myszami eksperymentalnymi należy obchodzić się przez 1-3 minuty każdego dnia, przez co najmniej 3-5 dni przed badaniem.
      UWAGA: Myszy, z którymi nigdy nie miały do czynienia, mogą odczuwać stres związany z wyjęciem z komory, co może zakłócać lub zmieniać kondycję.
   2. Zaopatrzyć się w cztery lub więcej trzykomorowych aparatów CPP, najlepiej wyposażonych w wiązki światła do automatycznego zbierania danych¹⁸. Upewnij się, że każda komora ma dwie większe, wizualnie i dotykowo odrębne komory łączące się z mniejszą, neutralną komorą za pomocą drzwi, które można podnieść/opuścić w celu kontroli dostępu. Pokrywy w każdej komorze powinny otwierać się w celu włożenia/wyjęcia myszy i być zamontowane z małymi, indywidualnie sterowanymi (ściemnianymi) lampkami (po jednym na komorę).
      UWAGA: Konstrukcje komór CPP różnią się i mogą być zakupione komercyjnie lub skonstruowane przez badaczy. W przypadku "zrównoważonego" projektu zalecanym schematem jest jedna większa komora z białymi ścianami i podłogą z siatki drucianej, a druga z czarnymi ścianami i podłogą barową. Środkowa komora powinna mieć szare ściany i solidną szarą podłogę z pleksi. Dla wyjaśnienia, komory te będą określane jako "białe", "czarne" i "środkowe". Pokrywki powinny być przezroczyste z pleksi. Możliwe są również alternatywne konfiguracje komór (jedno- lub dwukomorowe), które zostały omówione w innym miejscu (patrz Dyskusja).
   3. Ustaw pomieszczenie tak, jak będzie podczas testów: wyłącz lub ustaw światła górne na najciemniejsze ustawienie i zamknij drzwi. Użyj światłomierza wewnątrz każdej komory i ustaw światła pokrywy tak, aby środkowe komory były nieco jaśniejsze (15-20 luksów) niż czarne i białe komory (6-10 luksów), aby zniechęcić myszy do spędzania tam czasu.
      UWAGA: Jeśli średni czas spędzony w środku jest taki sam lub dłuższy niż w czarnej lub białej komorze, jeszcze bardziej zwiększ kontrast oświetlenia opisany w kroku 1.1.3. Alternatywnie, użyj mniej atrakcyjnej podłogi na środku. (np. ~220 otworów o średnicy 0.5 cm, równomiernie rozmieszczonych w pleksi 6 x 3.5 x 1/4"), jednak unikaj czynienia tej komory awersyjną. Pilotuj wszelkie zmiany, aby upewnić się, że spadki w średnim czasie nie są spowodowane spadkami w całkowitej liczbie eksploracji (przepraw).
   4. Zaprogramuj automatyczne zbieranie danych ("procedura", Rysunek 1A) lub ręcznie zbieraj dane zgodnie z poniższymi parametrami. Ustaw próby tak, aby rozpoczynały się po pierwszym zerwaniu wiązki w dowolnej komorze kondycjonowania. Ustaw sesje "testowe" tak, aby trwały 20 minut i śledziły czas spędzony i przerwy w wiązce w każdej komorze. Ustaw sesje "kondycjonowania" na 30 minut i (opcjonalnie) do pomiaru przerw wiązki w każdej komorze. Ustaw wszystkie światła komory tak, aby świeciły się podczas próby.
   5. Przygotuj pełną objętość roztworu kokainy wymaganą do przeprowadzenia eksperymentu. Rozpuścić chlorowodorek kokainy w 0,9% NaCl (sól fizjologiczna), opierając końcowe stężenie na objętości wstrzyknięcia 0,1 ml/10 g masy ciała (np. dla dawki 5 mg/kg stężenie roztworu wynosi 0,5 mg/ml). Mieszanina wirowa przez 30-45 sekund, sterylny filtr (filtry strzykawkowe 0,2 μm) i przechowywać w temperaturze RT.
2. Testowanie:
   UWAGA: Ogólny harmonogram CPP to PRZED TESTEM, KONDYCJONOWANIE, a następnie PO TEŚCIE. Test wstępny można oddzielić od kondycjonowania o 1-3 dni; jednak kondycjonowanie i dzień po badaniu powinny odbywać się w następujących po sobie dniach (rysunek 2A). Czas ten powinien być taki sam dla wszystkich kohort biorących udział w tym samym eksperymencie.
   1. Przeprowadza się badanie w fazie świetlnej zwierząt przy użyciu tej samej aparatury dla każdego zwierzęcia przez kilka dni.
   2. Każdego dnia próbnego (tj. dni testów i kondycjonowania) przenieś myszy do przedpokoju behawioralnego i pozwól im siedzieć bez przeszkód w domowych klatkach przez 1-1,5 godziny przed próbą. Wybierz miejsce, w którym myszy mogą być szybko przenoszone z klatki do aparatury, przy minimalnych zakłóceniach, po rozpoczęciu badania. Włącz wszystkie urządzenia tak, aby były obecne wszelkie odgłosy związane z testem (np. wentylatory sprzętu).
   3. Dokładnie wyczyść każde urządzenie (ściany wewnętrzne, podłogę i tace) łagodnymi chusteczkami dezynfekującymi na bazie alkoholu, eteru glikolu lub amoniaku przed i po każdej myszy (używaj tego samego rodzaju środka czyszczącego przez cały czas trwania eksperymentu). Nie zaniedbuj spodniej części podłogi.
   4. Sprawdź, czy światła w pomieszczeniu są odpowiednio ustawione (wyłączone lub przyciemnione) na początku każdego dnia.
   5. Postępuj zgodnie z poniższymi krokami w zależności od tego, czy jest to dzień "testowy" czy "kondycyjny":
      1. W 1. i 6. dniu próbnym (tj. w teście wstępnym i końcowym) należy ustawić drzwi międzykomorowe w pozycji otwartej (rys. 2B).
      2. Załaduj "testowy" program komputerowy i wprowadź identyfikatory zwierząt (Rysunek 1A), a następnie wydaj polecenie uruchomienia (Rysunek 1B), jeśli ma to zastosowanie.
      3. Delikatnie opuść każdą mysz do środkowej komory przypisanego jej aparatu, skierowaną w stronę tylnej ściany, i delikatnie zamknij pokrywę. Po załadowaniu wszystkich komór opuść pomieszczenie testowe i zminimalizuj hałas.
      4. Pozostaw myszy w każdym aparacie do czasu zamknięcia/zakończenia prób dla wszystkich myszy (ryc. 1C). Eksportowanie danych wersji próbnej.
   6. Tuż przed badaniem wstępnym lub po nim należy zważyć zwierzęta. Ciężarki te służą do obliczania dawki podczas kondycjonowania.
   7. Aby przygotować się do prób kondycjonowania, oblicz "preferencje" każdej myszy przed testem dla czarnej i białej komory, odejmując czas spędzony w każdej z nich od drugiej (tj. "minus biały" i "biały minus"; patrz Rysunek 3, Kolumny 9 i 10).
   8. Ponieważ myszy o silnych preferencjach początkowych utrudniają równoważenie, ustal akceptowalny limit punktów preferencji (np. <33% całkowitego czasu próby) i wyklucz z obliczeń myszy, które go przekraczają. Stosuj liberalny limit (<66% całkowitego czasu badania), aby zmaksymalizować włączenie, gdy po zakończeniu testów prawdopodobne jest wyczerpanie (np. z powodu niezamierzonych manipulacji chirurgicznych).
      UWAGA: Myszy przekraczające limit mogą być nadal testowane, z próbą utrzymania ich preferencji przed testem. Później myszy te można wykluczyć z analizy, jeśli to konieczne, aby zrównoważyć wyniki przed testem. Jeśli ekstremalne odchylenia przed badaniem (tj. >800 sekund) nieproporcjonalnie wpływają na jedną grupę, rozważ zmianę środowiska kondycjonowania i/lub użycie innych testów.
   9. Wybierz czarną lub białą komorę jako komorę parowania leków dla każdej myszy, jednocześnie sumując odpowiednie wyniki preferencji przed testem w każdej grupie, mając na uwadze następujące priorytety:
      UWAGA: Zadbaj o zrównoważenie wyników między grupami w każdej kohorcie, a także we wszystkich poprzednich kohortach.
      1. Zadbaj o to, aby sumy dla wszystkich grup były jak najbardziej równe.
      2. Spraw, aby sumy były jak najbardziej bliskie zeru (tj. wybierz preferowaną stronę dla niektórych myszy i niepreferowaną stronę dla innych). Jeśli suma bliska zeru jest niemożliwa dla danej grupy, ponownie dostosuj wszystkie inne, aby ściśle odpowiadały najlepszemu możliwemu do uzyskania wynikowi dla grupy ograniczającej, faworyzując lekko ujemne sumy grupowe nad dodatnimi.
      3. O ile to możliwe, utrzymuj przydziały komór czarnych i białych oraz preferowanych i niepreferowanych dla par leków, nawet w każdej grupie.
      4. Ponieważ nie zawsze jest możliwe osiągnięcie powyższych celów, skoryguj wszelkie odchylenia, biorąc pod uwagę przeciwstawne względy równoważenia w późniejszych kohortach; staraj się jednak unikać tworzenia kohort o bardzo różnych średnich preferencjach przed testem.
   10. W dniach kondycjonowania 2-5 należy ustawić drzwi międzykomorowe w pozycji zamkniętej (Rysunek 2C).
   11. Przygotować indywidualne strzykawki z roztworem kokainy (dzień 2 i 4) lub soli fizjologicznej (dzień 3 i 5), zgodnie z opisem w kroku 1.1.5 i w oparciu o masę ciała zmierzoną przed badaniem.
       UWAGA: Dawka powinna być dobrana z uwzględnieniem oczekiwań doświadczalnych, rozważań wymienionych we Wstępie oraz potencjalnego wpływu na podłogę i sufit. Często najlepiej jest przeprowadzić niezależne eksperymenty z użyciem co najmniej dwóch różnych dawek.
   12. Załaduj program komputerowy "kondycjonujący" i wprowadź identyfikatory zwierząt (Rysunek 1A), a następnie wydaj polecenie uruchomienia (Rysunek 1B), jeśli ma to zastosowanie.
   13. Skark i wstrzyknąć każdą mysz (i.p.), natychmiast opuszczając ją do odpowiedniej czarnej lub białej komory przydzielonego im aparatu zwróconej przodem do tylnej ściany, a następnie delikatnie zamknij pokrywę. Po załadowaniu wszystkich komór opuść pomieszczenie testowe i zminimalizuj hałas.
   14. Usuń myszy z ich komory tak blisko dokładnie 30 minut, jak to możliwe (tj. pierwsze myszy są usuwane z ich komór, podczas gdy inne myszy nadal kondycjonują). Usuwaj zwierzęta tak cicho, jak to możliwe, bez hałasu.
3. analiza statystyczna:
   1. Wybierz metodę analizy. Albo odejmij czas spędzony po stronie sparowanej solą fizjologiczną podczas testu końcowego od czasu spędzonego po stronie sparowanej kokainą podczas testu końcowego (kokaina - sól fizjologiczna, sec) lub użyj czasu spędzonego w komorze sparowanej z narkotykami po teście minus czas spędzony przed testem w komorze sparowanej z narkotykiem.
      UWAGA: w przypadku korzystania z pierwszej metody należy również narysować wykresy liniowe średniego czasu spędzonego w środkowej, sparowanej soli fizjologicznej i komorze lekowej podczas testów wstępnych i końcowych dla każdej grupy. W porównaniu z testem wstępnym, test końcowy powinien wykazać wydłużony czas po stronie sparowanej lekiem i skrócony czas spędzony po stronie sparowanej solą fizjologiczną (patrz Rysunek 6, dół i Dyskusja w celu wyjaśnienia).
   2. W zależności od charakteru i liczby porównywanych grup, użyj testu t, jedno- lub dwuczynnikowego ANOVA, w zależności od potrzeb, ewentualnie z analizą post-hoc, aby przeanalizować jeden z wyżej przedstawionych wyników odejmowania.
      UWAGA: Wyniki preferencji kokainy są zwykle zmienne, a ponadto mogą być negatywne (tj. wskazywać na niechęć do strony sparowanej z narkotykami). Myszy, które wykazują awersję, nie powinny być usuwane (chyba że są statystycznie odstające), ponieważ ten wynik jest normalny i prawdopodobnie ważny dla określenia różnic między grupami. Spodziewaj się, że potrzebna będzie próba o wielkości od 12 do 30 zwierząt na grupę, w zależności od wielkości efektu leczenia.

2. Uwrażliwienie lokomotoryczne

1. Wyposażenie i aranżacja pomieszczenia
   1. Uzyskaj matrycę fotowiązki 4 x 8 (X x Y) (wymiary zewnętrzne 11,5" x 20"). Zbuduj otwartą komorę wykonaną z czarnej pleksiglasu (wymiary wewnętrzne 22 1/6" x 13 3/4" x 9 3/8"), aby pomieścić tablicę (Rysunek 4A).
   2. Przygotuj pomieszczenie testowe tak, aby podczas testowania można było używać czerwonego światła (montowanego na suficie lub na ścianie).
   3. Przygotuj oddzielne sesje programowe do codziennych prób habituacji i iniekcji.
      1. Ustaw próby habituacji na 30-60 minut, a próby iniekcyjne na 60-120 minut (ryc. 5B). Zalecana długość każdego z nich to 60 min. Utrzymuj spójną długość badania w wielu kohortach w ramach tego samego eksperymentu.
      2. Ustaw próby tak, aby rozpoczynały nagrywanie po pierwszym zerwaniu wiązki, które następuje po zainicjowaniu sygnału startu (rysunek 5B). W przypadku próby iniekcyjnej należy ustawić sygnał startu tak, aby skrzynki mogły być uruchamiane pojedynczo (nie zgodnie), jeśli to możliwe.
      3. Ustaw przerwy wiązki tak, aby były rejestrowane w zdefiniowanych przez użytkownika "pojemnikach", najlepiej 5 minut każdy (Rysunek 5B).
   4. Przygotuj pełną objętość roztworu kokainy wymaganą do przeprowadzenia eksperymentu. Rozpuścić chlorowodorek kokainy w 0,9% NaCl (sól fizjologiczna), opierając końcowe stężenie na objętości wstrzyknięcia 0,1 ml/10 g masy ciała (np. dla dawki 5 mg/kg stężenie roztworu wynosi 0,5 mg/ml). Mieszanina wirowa przez 30-45 sekund, sterylny filtr (filtry strzykawkowe 0,2 μm) i przechowywać w temperaturze RT.
2. Testowanie
   UWAGA: Początkowa faza testów trwa 10-11 kolejnych dni. Myszy otrzymują dwie codzienne próby: habituację (bez wstrzyknięć) i wstrzyknięcie. Podawaj sól fizjologiczną przez pierwsze trzy do czterech dni (patrz Dyskusja na temat znaczenia przyzwyczajenia do soli fizjologicznej) i kokainę przez następne siedem, stosując tę samą dawkę (np. 15 mg/kg/dobę).
   1. Każdego dnia aklimatyzuj myszy w ich domowych klatkach do behawioralnego przedpokoju na 30 minut do 1 godziny.
   2. Przygotować czyste, standardowe, przezroczyste akrylowe klatki wielkości myszy z bardzo cienką warstwą świeżej ściółki (np. wiórów sosnowych), tak aby w razie potrzeby nie zasłaniać promieni świetlnych (Rysunek 4C i D).
   3. Umieść klatki przy osi Y układu fotowiązki w pobliżu jednego końca, tak aby pięć wiązek było równomiernie rozmieszczonych na całej jego długości. Belki osi X nie są używane w tym teście (rysunek 4C i D).
   4. Weź myszy z ich domowej klatki, w losowej kolejności, skark i zważ je. Wyjmij każdą mysz z łodzi wagowej za podstawę ogona (z podporą) i umieść bezpośrednio w przypisanej im klatce lokomotywowej. Przykryj każdą klatkę standardową pokrywą z filtrem.
   5. Przygotować indywidualne strzykawki z roztworem soli fizjologicznej lub kokainy, jak opisano w kroku 2.1.7, w oparciu o masę ciała w danym dniu. Zacznij od dawki 15 lub 20 mg/kg mc. i rozważ drugie doświadczenie, w którym zastosujesz wyższą lub niższą dawkę (patrz Dyskusja na temat istotnych czynników).
   6. Po zakończeniu prób habituacji dla wszystkich klatek, załaduj program iniekcji.
   7. Pojedynczo wyjmuj myszy z klatki testowej, kark i wstrzyknij im (i.p.). Przed umieszczeniem myszy z powrotem w klatce testowej należy szybko zainicjować sygnał startowy dla tej klatki (Rysunek 5C, na dole).
   8. Po zakończeniu wszystkich prób iniekcji należy zwrócić myszy do ich klatek domowych i pomieszczeń mieszkalnych.
   9. W razie potrzeby pozwól myszom przejść serię okresów odstawienia i prowokacji lekowych, takich jak: taka sama dawka jak oryginalna, połowa dawki, podwójna dawka, a następnie sól fizjologiczna, pozostawiając siedem dni przed prowokacją tą samą dawką i trzy do siedmiu dni przed każdym dodatkowym prowokacją. Niezależnie od wyboru wyzwań, utrzymuj podobne okresy karencji we wszystkich kohortach w ramach eksperymentu.
      UWAGA: Jeśli pierwotna dawka jest duża (np. 30 mg/kg mc. lub większa), należy pominąć podwójną dawkę lub zastąpić ją niższą. Prowokacja solą fizjologiczną ujawnia jakąkolwiek uwarunkowaną aktywację lokomotoryczną przez samo środowisko sparowane z kokainą, a w tym procesie, ilość uwrażliwionej lokomocji, która jest zależna od kokainy (patrz Dyskusja).
3. analiza statystyczna
   1. Wybierz porcję (porcje) każdego badania, które zostanie wykorzystane do analizy. Większość lokomocji wywołanej kokainą u gryzoni występuje w ciągu pierwszych ~15-30 minut po wstrzyknięciu leku. W zależności od zaangażowanych zmiennych rozważ analizę skumulowanej lokomocji dla wielu okien czasowych (np. pierwszych 15, 30, 60 i/lub 120 minut) lub skup się na niezależnych segmentach próby.
   2. Korzystając z wybranego przedziału czasowego, zsumuj przerwy wiązki dla każdego zwierzęcia w ciągu dnia dla prób habituacji i iniekcji osobno, a następnie uśrednij sumy dla każdej grupy. Wykreśl średnie i błędy standardowe średniej (S.E.M.) na wykresie liniowym ze wszystkich dni. Ponieważ leczenie może zmienić sposób, w jaki myszy reagują na lek wcześnie i/lub późno w każdym codziennym badaniu, należy również wykreślić średnie przerwy w wiązce grupowej o 5 minut w trakcie każdego codziennego badania.
      UWAGA: Wykreślenie średnich dziennych aktywności dla prób habituacji i iniekcji (np. pierwsze 15 minut) sprawia, że sztucznie wydaje się, że lokomocja jest tłumiona przez wstrzyknięcie soli fizjologicznej, ale pamiętaj, że aktywność (najprawdopodobniej) spadła do tego poziomu pod koniec habituacji każdego dnia.
   3. Analizuj kolejne dni leczenia solą fizjologiczną i lekami oddzielnie przy użyciu powtarzanych pomiarów (RM) ANOVA z czynnikiem dnia/godziny u osób wewnątrzobiektowych i z uwzględnieniem wszelkich czynników międzyobiektowych w projekcie, w zależności od potrzeb. Użyj testu t lub jednoczynnikowej ANOVA, aby zbadać różnice grupowe w dniu 1 kokainy (ostra ekspozycja) oraz wieloczynnikowej ANOVA w przypadku wyzwań. W razie potrzeby śledź istotność za pomocą testów post-hoc lub jednowymiarowych ANOVA.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki testu CPP przedstawiono na Rysunku 6 z wykorzystaniem myszy szczepu C57BL/6N typu dzikiego w wieku około dziewięciu tygodni. Projekt badania oparto na mieszanym modelu factorialnym 2 x 3, gdzie zmienną wewnątrzobiektową był Test (przed i po), a zmienną międzyobiektową Leczenie (solanka oraz kokaina w dawkach 5 i 10 mg/kg). Analiza RM ANOVA wykazała istotną interakcję między Testem a Leczeniem (F_2,20=3.68, p<0.05), co zinterpretowano in lieu istotnych efektów ...

Dyskusja

Protokół ten demonstruje metody warunkowej preferencji miejsca i uwrażliwienia lokomotorycznego, z których każda może być wykorzystana przez przeciętne laboratorium do oceny aspektów plastyczności behawioralnej wywołanej przez leki. Podobnie jak w przypadku większości testów behawioralnych, istnieją dodatkowe warte rozważenia kwestie wykraczające poza podstawowy protokół. Po pierwsze, każdą z tych technik można wyobrazić sobie jako mającą dwie fazy, indukcję i ekspresję. "Indukcja" obejmuje rozwój zachowania – w przypadk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorowodorek kokainy USP	Mallinckrodt Pharmaceuticals	0406-1520	Zakup i stosowanie (substancja kontrolowana Schedule II) do celów badawczych wymaga zgodności i licencji zgodnie z prawem stanowym i federalnym.
Preferencja warunkowego miejsca,  Aparat trzykomorowy z ręcznymi drzwiami i światłami do myszy	Med-Associates Inc.	MED-CPP-MS & MED-CPP-3013	Nasze laboratorium używało tych pudełek, jednak dostępnych i akceptowalnych jest wiele alternatywnych pudełek.
PAS-Home Cage Activity Monitoring Photobeam Arrays	San Diego Instruments	2325-0223 i 7500-0221	Nasze laboratorium mieści te tablice w specjalnie zbudowanych komorach, jak opisano w tekście. Dostępne są alternatywy.
Jednorazowe chusteczki dezynfekujące Sani-Cloth	PDI	13872