Nieprzewidywalny protokół przewlekłego łagodnego stresu w celu wywołania objawów depresyjnych, zmian w zachowaniu i negatywnych skutków zdrowotnych u gryzoni

Podsumowanie

Protokół nieprzewidywalnego chronicznego łagodnego stresu (UCMS) jest sprawdzoną metodą badania zmian behawioralnych i fizjologicznych związanych z przewlekłym stresem i objawami depresyjnymi. Osiem tygodni od nałożenia protokołu UCMS wywołuje zmiany w zachowaniu i złe wyniki zdrowotne u gryzoni obu płci.

Streszczenie

Przewlekły, nierozwiązany stres jest głównym czynnikiem ryzyka rozwoju depresji klinicznej. Chociaż opisano wiele przedklinicznych modeli depresji wywołanej stresem, protokół nieprzewidywalnego przewlekłego łagodnego stresu (UCMS) jest uznanym modelem translacyjnym do wywoływania objawów behawioralnych powszechnie związanych z depresją kliniczną, takich jak anhedonia, zmienione zachowanie pielęgnacyjne i wyuczona bezradność u gryzoni. Protokół UCMS wywołuje również zmiany fizjologiczne (np. hiperkortyzolemia, nadciśnienie) i neurologiczne (np. anhedonia, wyuczona bezradność), które są klinicznie związane z depresją. Co ważne, objawy depresyjne wywołane przez UCMS można złagodzić poprzez przewlekłe, ale nie ostre, leczenie powszechnymi SSRI. W związku z tym protokół UCMS ma wiele zalet w porównaniu z protokołami ostrego stresu lub protokołami, które wykorzystują bardziej ekstremalne czynniki stresogenne. Nasz protokół obejmuje losową, codzienną ekspozycję na 7 różnych czynników stresogennych: wilgotną ściółkę, usuwanie ściółki, przechylanie klatki, zmianę cykli światła/ciemności, stresy społeczne, kąpiel w płytkiej wodzie oraz dźwięki/zapachy drapieżników. Poddając gryzonie 3-4 godziny dziennie tym łagodnym stresorom przez 8 tygodni, wykazujemy zarówno znaczące zmiany w zachowaniu, jak i słabe wyniki zdrowotne układu sercowo-naczyniowego. Podejście to pozwala na dogłębne zbadanie zmian neurologicznych, behawioralnych i fizjologicznych związanych z przewlekłą depresją wywołaną stresem, a także na testowanie nowych potencjalnych środków terapeutycznych lub strategii interwencyjnych.

Wprowadzenie

Depresyjna choroba psychiczna to złożone zaburzenie neurologiczne, które jest obecnie uznawane za główną przyczynę niepełnosprawności i obciążenia chorobami na całym świecie. NIMH podaje, że około 12% Amerykanów cierpi na depresję kliniczną, przy czym dwa razy więcej kobiet cierpi na nią w porównaniu^{z mężczyznami1}. W samych Stanach Zjednoczonych depresja odpowiada za miliardy dolarów bezpośrednich kosztów opieki zdrowotnej i szacunkowo 193 miliardy dolarów więcej kosztów pośrednich (obniżone zarobki i utrata produktywności)². Objawy depresji obejmują anhedonię, zmiany w cyklach masy ciała i snu, zmniejszoną aktywność fizyczną i higienę osobistą, poczucie beznadziejności lub winy i/lub nawracające myśli o śmierci lub samobójstwie. W ciągu ostatniej dekady badania epidemiologiczne i kliniczne wykazały, że depresja jest niezależnym czynnikiem ryzyka zachorowalności i śmiertelności z powodu chorób sercowo-naczyniowych (CVD)³ i jest predyktorem poważniejszego rokowania w patologiach sercowo-naczyniowych, w tym miażdżycy, nadciśnieniu, zawale mięśnia sercowego i chorobie wieńcowej, niezależnie od wcześniejszej historii jawnej choroby sercowo-naczyniowej⁴. Pomimo coraz częstszego występowania i niekorzystnego wpływu depresji na zdrowie publiczne, etiologia i związana z nią patofizjologia tej choroby są słabo poznane, a niejednorodność zaburzenia spowodowana różnymi czynnikami (np. składnikami genetycznymi, biologicznymi i środowiskowymi) utrudnia określenie diagnozy klinicznej.

Dowody wskazują, że nierozwiązywalny stres psychologiczny jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do rozwoju chorób depresyjnych i może być również silnym czynnikiem chorobotwórczym łączącym depresję i CVD, częściowo z powodu zakłócenia i rozregulowania osi^5,6 podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA). Dysfunkcja osi HPA jest głównym mechanizmem, który został powiązany ze zmianami behawioralnymi i fizjologicznymi obserwowanymi w depresji oraz rozwojem kilku czynników ryzyka chorób sercowo-naczyniowych, w tym dyslipidemii, otyłości i cukrzycy⁷. Opracowano wiele przedklinicznych modeli depresji w celu odtworzenia mechanizmu zmienionej aktywności osi HPA charakterystycznej dla depresji klinicznej; Takie modele zapewniają sprawdzone metody badania zmian behawioralnych, neurologicznych i fizjologicznych związanych z przewlekłym i ostrym stresem u zwierząt. Trafność zwierzęcego modelu choroby opiera się na trafności etiologii i progresji projektu modelu oraz jego zdolności do rekapitulacji cech anatomicznych, neurofizjologicznych i behawioralnych obserwowanych w chorobie ludzkiej. Ponadto przedkliniczne odpowiedzi na leczenie (takie jak SSRI) powinny dawać wyniki podobne do obserwowanych w warunkach klinicznych.

Kilka zwierzęcych modeli depresji wywołanej stresem jest obecnie wykorzystywanych w badaniach, takich jak wyuczona bezradność, stres we wczesnym okresie życia i stres związany z porażką społeczną. Jednak każdy z tych modeli ma nieodłączne wady, które zmniejszają ich skuteczność translacyjną⁸. W ciągu ostatnich dziesięcioleci protokół nieprzewidywalnego przewlekłego łagodnego stresu (UCMS) stał się jednym z najbardziej istotnych pod względem translacyjnym modeli do badania patofizjologii depresji u gryzoni9^. Model ten opiera się na podstawowej koncepcji, że przewlekłe narażenie na stresory zaburza systemy reakcji na stres i ostatecznie prowadzi do rozwoju zaburzeń depresyjnych. Podczas protokołu UCMS zwierzęta są codziennie narażone na losową serię łagodnych stresorów środowiskowych i społecznych. Kluczowym czynnikiem, który zwiększa przydatność tego modelu w sytuacjach ludzkich, jest wysoki stopień nieprzewidywalności i niekontrolowaności stresorów, a także czas, w którym są one wprowadzane. Ponadto protokół UCMS wykorzystuje tylko łagodne stresory, zamiast polegać na wczesnym okresie życia lub agresywnych bodźcach fizycznych. W okresie ekspozycji na UCMS rozwijają się zachowania depresyjne, które są porównywalne z objawami klinicznymi, w tym zmniejszona reakcja na nagrody (anhedonia), zmiany w aktywności fizycznej i zachowaniach śledczych (bezradność i rozpacz), pogorszenie stanu sierści i zmieniona aktywność seksualna¹⁰. Prawie wszystkie możliwe do wykazania objawy depresji zostały zgłoszone przy użyciu tego modelu, a badania wykazały, że zachowania te utrzymują się przez kilka tygodni po ustaniu stresu. Ponadto, te zachowania depresyjne wywołane przez UCMS mogą być stopniowo czczone przez przewlekłe, ale nie ostre, leczenie określonymi lekami przeciwdepresyjnymi, co sugeruje podobne neurologiczne skutki poprawy terapeutycznej, które ściśle odzwierciedlają działanie kliniczne i zmienną skuteczność tych środków u ludzi^11,14-18 . W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis protokołu UCMS i opisujemy typowe wyniki behawioralne i naczyniowe u myszy.

Protokół

Wszystkie procedury opisane poniżej zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Zachodniej Wirginii.

1. Wybór modelu zwierzęcego

UWAGA: Najczęściej używane gatunki w modelu UCMS to szczury Sprague, Dawley i Wistar oraz mysz BALB/cJ; inne modele mysie wykazały ograniczoną skuteczność (DBA/2, C57BL/6). Należy jednak dokładnie rozważyć konkretny szczep myszy lub szczura, ponieważ podłoże genetyczne i podatność na stresory środowiskowe różnią się znacznie między gatunkami i wykazano, że są to kluczowe czynniki wpływające na wyniki badania^11,14,15,19.

1. Należy użyć zwierząt w odpowiednim wieku (np. jeśli pożądany punkt końcowy ma być oceniany u 17-tygodniowego szczura, szczury muszą rozpocząć protokół UCMS w wieku ~9 tygodni), ponieważ protokół ten zajmuje co najmniej 7-9 tygodni, aby w pełni wywołać objawy depresyjne.
2. Zwierzęta jednotrzymankowe poddawane UCMS w klatkach i obiektach zatwierdzonych przez IACUC, z karmą i standardową karmą dostępną ad libitum (chyba że protokół szczegółowy stanowi inaczej).
3. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby upewnić się, że elementy sterujące znajdują się w cichym pomieszczeniu o minimalnej aktywności, aby zmniejszyć skutki wszelkich możliwych nieznanych stresorów środowiskowych.

2. Protokół nieprzewidywalnego chronicznego łagodnego stresu

UWAGA: Zwierzęta poddawane UCMS są transportowane codziennie (>5 dni w tygodniu) do czystego pomieszczenia używanego do manipulacji UCMS. Każdego dnia zwierzęta są narażone na 1 lub 2 z wymienionych poniżej czynników stresogennych. Stresory są wykonywane według losowego harmonogramu, a każdy stres jest podawany przez co najmniej 3-4 godziny (patrz> Tabela 1).

1. Zwilż ściółkę, wlewając 10-20 uncji czystej wody do każdej standardowej klatki. Dostosuj ilość wody odpowiednio do wielkości klatki, aby w pełni zwilżyć ściółkę, ale nie spowodować gromadzenia się wody. Trzymaj zwierzęta w wilgotnej klatce przez 3-4 godziny.
2. Usuń ściółkę z każdej klatki na 3-4 godziny, po czym zwierzęta są przenoszone do innego stresora wymagającego pustej klatki (płytka kąpiel, przechylenie klatki) lub umieszczane w czystej klatce ze świeżą ściółką.
3. Klatki można przechylać pod kątem około 45° (bez ściółki) przez 3-4 godziny. Klatki można przechylać za pomocą solidnego przedmiotu, który pozostanie na miejscu, gdy zwierzę będzie się poruszać w klatce.
4. Zamień normalne 12-godzinne/12-godzinne cykle światła/ciemności na sekwencje po 30 minut trwające 8 godzin. Następnie przywróć zwierzęta do normalnego cyklu.
5. Przenieś każde zwierzę z jego klatki domowej do klatki sąsiedniego zwierzęcia, która została usunięta na 3 godziny.
6. Usuń całą ściółkę z każdej klatki i dodaj wodę na głębokość ~0,25 cala dla myszy lub ~0,5 cala dla szczurów przez około 4 godziny. Użyj wody cieplejszej niż RT (~30 °C), aby zminimalizować potencjał hipotermii. Krótko osuszyć zwierzęta miękkim ręcznikiem po zakończeniu kontaktu z wodą przed umieszczeniem w czystych klatkach.
7. Wystaw zwierzęta na zapachy/dźwięki drapieżników, dodając losowo rozmieszczone kępki futra lub moczu (10-20 ml) z naturalnego gatunku drapieżnika do klatki na 3-4 godziny. Alternatywnie, baw się warczeniem lub odgłosami drapieżników z naturalnych gatunków drapieżników w pobliżu klatek przez 3 godziny.
8. Pod koniec każdego dziennego okresu stresu umieść wszystkie zwierzęta w czystych klatkach i oddaj je do pomieszczenia inwentarskiego.

3. Wyniki monitorowania zwierząt/pielęgnacji

1. Codziennie sprawdzaj każde zwierzę pod kątem rozwoju ran lub owrzodzeń, które mogą wymagać leczenia weterynaryjnego. Zwierzęta, u których doznały łagodnych urazów, mogą kontynuować postępowanie w protokole UCMS za zgodą lekarza weterynarii.
   1. Dwóch badaczy przeszkolonych w ocenie pielęgnacji sierści sprawdza każde zwierzę i przypisuje tygodniowy wynik sierści w skali od 0 do 1. Wynik ten jest określany poprzez przypisanie indywidualnych punktów (0 – czysty, 1 – brudny) do każdego z 8 regionów ciała – głowy, szyi, sierści grzbietowej, sierści brzusznej, ogona, kończyn przednich, kończyn tylnych i okolic narządów płciowych. Ci sami badacze mają wykonywać to zadanie przez cały protokół UCMS, aby zachować spójność w przypisywaniu punktów powłoki.
   2. Każde zwierzę, u którego dochodzi do gwałtownego spadku masy ciała (tj. >15%) powinno zostać zgłoszone personelowi weterynaryjnemu i musi zostać usunięte z protokołu.

4. Testy behawioralne i pomiary wyników

UWAGA: Kilka metod oceny może być użytych do ilościowego określenia zmian w zachowaniu na podstawie protokołu UCMS u gryzoni.

1. Łączny wynik w pielęgnacji sierści.
   1. Jak opisano powyżej, każdemu zwierzęciu przypisywany jest tygodniowy wynik pielęgnacji sierści
   .
2. Test rozpryskiwania sacharozy:
   1. Umieść zwierzę w czystej klatce wyłożonej wacikiem lub ręcznikiem, aby zapobiec przyleganiu pościeli do sierści. Rozpyl 10% roztwór sacharozy na głowę i sierść grzbietową każdego zwierzęcia i rejestruj całkowite zachowanie pielęgnacyjne przez 5 minut.
   2. Aktywność pielęgnacyjna (zdefiniowana jako czyszczenie sierści poprzez lizanie lub drapanie) jest mierzona opóźnieniem (czas bezczynności między pierwszym spryskaniem a rozpoczęciem pielęgnacji) i częstotliwością (liczba razy pielęgnacji określonej części ciała).
3. Test preferencji sacharozy:
   1. Przyzwyczaj zwierzęta do picia 1% roztworu sacharozy (w/v) na 72 godziny przed badaniem, a następnie zapewnij ekspozycję na dwie butelki (1% roztwór sacharozy kontra woda z kranu w różnych butelkach). Po przyzwyczajeniu należy zapewnić zwierzętom ad libitum dostęp do roztworu sacharozy i wody z kranu przez 3 godziny. Po 3 godzinach zapisz wielkość spożycia roztworu sacharozy i wody z kranu i oblicz preferencję sacharozy jako: [(spożycie sacharozy)/(zużycie wody + spożycie sacharozy)]×100.
4. Test zawieszenia ogona (tylko myszy):
   1. Zawieś myszy za ogon na stabilnym pręcie (20 cm od podłogi) za pomocą taśmy klejącej (2 cm od końca ogona). Rekordowy czas bezruchu powyżej 5 minut. Myszy są uważane za nieruchome tylko wtedy, gdy zwisają biernie i całkowicie nieruchomo.
5. Test wymuszonego pływania:
   1. Umieść zwierzęta w pojemniku (o średnicy ~15-20 cm dla myszy; o średnicy ~55-60 cm dla szczurów) wypełnionym wodą o temperaturze 26 ± 0,5 °C. Zapisz opóźnienie do pierwszego napadu mobilności i czas spędzony w bezruchu podczas 5-minutowego okresu testowania. Pod koniec badania umieścić mokre zwierzę w klatce na poduszce grzewczej (30–35 °C) z normalną ściółką, przykrytą chłonnym ręcznikiem papierowym do wyschnięcia.
6. Podwyższony labirynt Plus:
   1. Pozwól każdemu zwierzęciu swobodnie eksplorować labirynt przez 5 minut. Zapisz całkowitą liczbę wejść do każdego ramienia i całkowity czas spędzony w każdym ramieniu, zgodnie z kryteriami a priori ²⁰.
7. Aktywność lokomotoryczna:
   1. Rejestruj poziomy aktywności, zdefiniowane jako ogólny ruch, drobne ruchy, ruchy wychowawcze i brak aktywności, zarówno w ostrym (30 min), jak i przewlekłym (12 godzin) okresie. Zrób to za pomocą klatki domowej lub nowego środowiska, w zależności od indywidualnego środowiska (chociaż spójność powinna być zachowana) w czasie rzeczywistym przez obserwatora lub post-hoc poprzez odtwarzanie i analizowanie nagrań z kamery.

5. Rozszerzenie/Odmiana protokołu UCMS

1. Podać odpowiednie środki terapeutyczne lub wyzwania w celu zbadania ich zdolności do osłabienia rozwoju wyników wywołanych UCMS (jeśli rozpoczęto wcześnie) lub do odwrócenia ciężkości ustalonych wyników wywołanych UCMS (jeśli rozpoczęto późno). Zależy to od indywidualnego laboratorium lub protokołu¹¹.

6. Oceny wyników końcowych

1. Po zakończeniu protokołów UCMS i testów behawioralnych, wykorzystaj zwierzęta w kolejnych eksperymentach w sposób, który odnosi się do konkretnych hipotez, celów lub zadań danego laboratorium.
   UWAGA: Na przykład może to obejmować reakcje sercowo-naczyniowe, zapalne lub endokrynologiczne na przewlekły stres. Alternatywnie, na tym etapie można wprowadzić interwencje terapeutyczne, aby ocenić ich skuteczność i podstawy mechanistyczne.

Wyniki

Przykładowy harmonogram na tydzień po procedurze UCMS jest pokazany w Tabeli 1. Każdego tygodnia stresory były losowo przydzielane, aby zapobiec aklamacji i zapewnić nieprzewidywalność wyzwania związanego ze stresem każdego dnia.

Miary zachowań depresyjnych

Po 8 tygodniach UCMS, zaszły znaczące zmiany zarówno w wynikach behawioralnych, jak i fizjologicznych u przewlekle zestresowanych gryzoni w stosunku do ich niezestresowanych szczepów kontrolnych....

Dyskusja

Obszerne dowody kliniczne i epidemiologiczne wskazują, że przewlekły stres jest jednym z najsilniejszych czynników wywołujących depresję. Powtarzające się narażenie na stresory może zwiększać indywidualną podatność na depresję i inne zaburzenia neuropsychiatryczne w wyniku psychologicznych i fizycznych wymagań w ciele, które kumulują się z czasem. Wykorzystanie zwalidowanych przedklinicznych modeli zwierzęcych stanowi cenne narzędzie translacyjne do badania depresji i chorób współistniejących. Po pierwsze, idealny model ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tymczasowe klatki dla zwierząt z pokrywami			Dostarczane przez placówkę opieki nad zwierzętami
Ściółka			Dostarczane przez placówkę opieki nad zwierzętami
Futro lub mocz			Dostarczane przez placówkę opieki nad zwierzętami
Butelki			Dostarczane przez placówkę opieki nad zwierzętami Butla
z podziałką 1 000 ml	zmienna		zmienna Jest to opcjonalne.  Każdy pojemnik, z którego można nalać znaną ilość wody, będzie odpowiedni
Drewniane klocki wycięte ze	zmiennych		2x4 Zmienne 8-calowe odcinki są cięte, aby ułatwić procedury pochylania klatki
Miękkie ręczniki			Dostarczone przez Twoją instytucję
Mała butelka z rozpylaczem	Pojemność	100-200 ml Walmart jest wystarczająca, używana do testu rozprysku sacharozy