Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53113

⸱

11 grudnia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University, 2Neurophysiology Research Center, Shahed University, 3Cellular and Molecular Research Center, Iran University of Medical Sciences, 4School of Advanced Technologies in Medicine, Iran University of Medical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Astrocyty w OUN zmieniają swoje właściwości funkcjonalne i strukturalne w odpowiedzi na szkodliwe bodźce. W artykule przedstawiono protokół oceny trójwymiarowej morfologii astrocytów w stanach chorobowych lub po interwencjach terapeutycznych.

Streszczenie

Jako komórki glejowe w mózgu, astrocyty pełnią różne funkcjonalne role w ośrodkowym układzie nerwowym. W obecności szkodliwych bodźców astrocyty modyfikują swoje właściwości funkcjonalne i strukturalne, co nazywa się astroglejozą reaktywną. W niniejszej pracy przedstawiono protokół oceny właściwości morfologicznych astrocytów. Protokół ten obejmuje kwantyfikację 12 różnych parametrów, tj. powierzchni i objętości tkanki pokrytej przez astrocyt (terytorium astrocytów), całego astrocytu, w tym gałęzi, ciała komórki i jądra, a także całkowitej długości i liczby gałęzi, intensywności immunoreaktywności fluorescencyjnej przeciwciał stosowanych do wykrywania astrocytów oraz gęstości astrocytów (liczba/1 000 μm2). W tym celu stworzono trójwymiarowe (3D) konfokalne obrazy mikroskopowe, a do pomiarów wykorzystano oprogramowanie do analizy obrazu 3D, takie jak Volocity 6.3. Do przedstawienia metody wykorzystano tkankę mózgową szczura wystawioną na działanie amyloidu beta1-40 (Aβ1-40) z interwencją terapeutyczną lub bez niej. Protokół ten może być również stosowany do analizy morfometrycznej 3D innych komórek w warunkach in vivo lub in vitro.

Wprowadzenie

W zdrowym ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), astrocyty odgrywają ważną rolę w regulacji przepływu krwi, metabolizmu energetycznego, funkcji synaptycznych i plastyczności oraz homeostazy zewnątrzkomórkowych jonów i neuroprzekaźników1-3. Ponadto astrocyty reagują na różne szkodliwe bodźce i nieprawidłowe stany, takie jak uraz, infekcja, niedokrwienie lub neurodegeneracja poprzez astroglejozę reaktywną, która charakteryzuje się hipertrofią, proliferacją i funkcjonalną przebudową astrocytów4,5.

Astroglejoza reaktywna może zainstruować reakcję zapalną i proces naprawy w tkance, a tym samym może wpływać na kliniczne wyniki interwencji terapeutycznych. W związku z tym astrocyty zyskały uwagę neurobiologów w ciągu ostatnich dziesięcioleci jako potencjalne cele interwencji terapeutycznych w przypadku różnych chorób wpływających na OUN.

Astrocyty zazwyczaj mają gwiaździsty kształt z dobrze zaznaczonymi gałęziami, które rozprzestrzeniają się wokół somy6. W chorobie mózgu gałęzie astrocytów stają się pofałdowane i wykazują spuchnięte końce7, na przykład w obecności beta-amyloidu (Aβ).

Ten artykuł przedstawia protokół analizy obrazów 3D astrocytów uzyskanych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zmierzono dwanaście różnych parametrów ilościowych dla każdego astrocytu: powierzchnie i objętości terytorium astrocytów (tkanka pokryta astrocytem), cała komórka (w tym gałęzie), ciało komórki i jądro; całkowita długość i liczba odgałęzień; intensywność fluorescencji przeciwciał stosowanych do wykrywania astrocytów; i gęstość astrocytów (liczba/1 000 μm2). W tym celu wykorzystaliśmy skrawki mózgu szczurów narażonych na wstrzyknięcie do hipokampa Aβ1-40 z leczeniem genisteiną lub bez niej jako substancji przeciwzapalnej. Opisany protokół może być stosowany do analizy morfometrycznej różnych typów komórek in vitro lub in vivo w różnych warunkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami określonymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych (NIH) zatwierdzonym przez Komitet Etyki Irańskiego Uniwersytetu Nauk Medycznych (Teheran, Iran).

1. Zwierzęta, chirurgia i preparaty próbek

UWAGA: Przygotuj tkankę mózgową do konfokalnej analizy mikroskopowej 3D.

  1. Podziel zwierzęta losowo na dwie grupy: Aβ1-40 – wstrzyknięcie (n = 8) i Aβ1-40 – wstrzyknięcie z leczeniem genisteiną (n = 8); podawać genisteinę (10 mg/kg rozcieńczoną w podłożu, takim jak polietylenowy olej rycynowy) przez zgłębnik 1 godzinę przed zabiegiem.
  2. Znieczulić zwierzęta ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg). Prawidłowe znieczulenie należy potwierdzić poprzez brak odruchu wycofania po uszczypnięciu palca u nogi. Podczas zabiegu należy stosować maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
  3. Umieść zwierzęta w aparacie stereotaktycznym i ogol głowę. Zastosuj roztwór jodu, aby oczyścić skórę głowy przed nacięciem i utrzymuj miejsce operacji w sterylności podczas operacji, aby zmniejszyć ryzyko infekcji. Wstrzyknąć Aβ1-40 stereotaktycznie (4 μl) do hipokampa na wysokości −3,5 mm za bregmą, ± 2 mm z boku do linii środkowej i −2,8 mm poniżej opony twardej, zgodnie z atlasem mózgu szczura8. Dla metody stereotaktycznej patrz poprzednia publikacja9.
  4. Zapewnić obserwację/opiekę pooperacyjną do momentu, gdy zwierzęta będą w pełni świadome, aby zapewnić im komfort. Utrzymuj zwierzęta w cieple podczas rekonwalescencji i nie umieszczaj ich z powrotem w klatce z innymi zwierzętami aż do pełnego wyzdrowienia. Zwróć uwagę na wszelkie oznaki infekcji u zwierząt po operacji.
  5. Znieczulenie zwierząt należy dokładnie przeprowadzić za pomocą ketaminy (150 mg/kg) trzy tygodnie po zabiegu. Wykonać stabilizację przezsercową poprzez perfuzję zwierząt 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 4% paraformaldehydu w 0,1 M PBS (pH = 7,4), a następnie usunąć i naprawić mózg zgodnie z opisem w10.
  6. Po utrwaleniu mózgów w 4% paraformaldehydzie przez 2-3 dni w temperaturze 4 °C.
  7. Osadź tkankę w blokach parafiny za pomocą sprzętu do zatapiania tkanek i unikaj niedopełniania lub przepełniania kasety, ponieważ może to zakłócać prawidłowe wyrównanie lub sekcję. Zwróć uwagę na orientację tkanki w bloku parafinowym.
    UWAGA: Na przykład hipokamp szczura znajduje się blisko tylnej części półkuli mózgowej. Dlatego tkanka powinna być osadzona w taki sposób, aby sekcja zaczynała się w tylnej części mózgu. Użyj atlasu Paxinos8 jako przewodnika, aby osiągnąć pożądaną strukturę anatomiczną.
  8. Umieść mikrotom z dala od przeciągów powietrza lub drzwi, ponieważ ruchy powietrza utrudniają przenoszenie sekcji.
  9. Użyj przekrojów o grubości ≥20 μm, ponieważ ta głębokość jest niezbędna do uzyskania obrazów Z-Stack kompletnych astrocytów. Nie używaj pierwszych kilku sekcji, ponieważ mogą one mieć niepożądaną grubość ze względu na rozszerzalność cieplną.
  10. Umieść sekcje na powierzchni ciepłej wody (5 ± 2 °C, poniżej temperatury topnienia parafiny) na tyle długo, aby spłaszczyć sekcje.
    UWAGA: Nadmierne rozszerzenie przekroju może zaburzyć morfologię konstrukcji. Użyj małego pędzla, aby ostrożnie przenieść sekcje. Zbierz od dwóch do trzech sekcji na każdym slajdzie.
  11. Przechowuj szkiełka w stojaku w pozycji pionowej i pozwól im wyschnąć w temperaturze 37 °C przez kilka godzin lub O/N.

2. Immunohistochemia

  1. Odparafinować skrawki w ksylenie, 2 x 10 min, i ponownie nawodnić za pomocą gradientu alkoholu (99,8%, 95% i 70%, 10 min każdy) i PBS.
  2. Inkubować z przeciwciałami przeciwko kwaśnemu białku fibrylarnemu gleju (GFAP) rozcieńczonym w stosunku 1:1,500 w PBS zawierającym 0,25% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,25% Triton X-100 i 3,5% normalnej surowicy (O/N w temperaturze 4 °C).
  3. Myć sekcje w PBS przez 3 x 5 min.
  4. Inkubować z drugorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z fosforanami alkalicznymi przez 1 godzinę (1:100, 21 °C, rozcieńczone w PBS).
  5. Myj sekcje w PBS przez 3 x 5 min.
    UWAGA: Ważne jest, aby odpowiednio umyć skrawki po przeciwciałach wtórnych, aby zminimalizować barwienie tła.
  6. Inkubuj sekcje w ciemności za pomocą Liquid Permanent Red Chromogen (15-20 min). Uwaga: Roztwór należy przygotować nie później niż 30 minut przed użyciem.
  7. Myć sekcje w PBS przez 3 x 5 min.
  8. Na koniec wybarwić jądra 4-6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI; 1:500, rozcieńczony w PBS) przed pokryciem. Przechowuj szkiełka w lodówce 24-48 godzin przed mikroskopią.

3. Mikroskopia konfokalna

UWAGA: Do oceny ilościowej (patrz poniżej), wybierz astrocyt z wyraźnie widocznym jądrem wybarwionym DAPI z minimalną liczbą nakładających się na siebie gałęzi, aby zmniejszyć ryzyko błędów. Tworzenie obrazów Z-Stack jest czasochłonne. Uzbrój się w cierpliwość i nie zatrzymuj się podczas przetwarzania. Pionowy konfokalny laserowy mikroskop skaningowy służy do tworzenia obrazów 3D z astrocytów.

  1. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i wybierz obiektyw 63X.
  2. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i kliknij Start systemu. Kliknij kartę Zlokalizuj. Przejdź do opcji Przypisz i wybierz GFP, aby dostosować odpowiednie światło.
  3. Otwórz migawkę, aby odbijać światło. Znajdź rewolwer reflektorowy po prawej stronie migawki i wybierz kolor, który ma być odbijany przez astrocyty (zielony, czerwony lub fioletowy); Użyto tutaj koloru czerwonego (FSet20 wf).
    UWAGA: Nie zapomnij ustawić ostrości obrazu bezpośrednio w oku mikroskopu.
  4. Aby znaleźć najlepszą ostrość, kliknij Wszystkie zamknięte, umieść pinezkę mikroskopu w trybie ekranu i kliknij kartę Akwizycja.
  5. Kliknij Smart Setup na karcie Akwizycja; otworzy się okno. Wybierz odpowiedni fluorofor (tj. DAPI i Alexa Fluor 555, w bieżącym projekcie) z listy. Kolor jest wybierany automatycznie.
  6. Kliknij Najlepszy sygnał i Zastosuj, a następnie kliknij Ustaw ekspozycję; komputer automatycznie ustawi parametry ekspozycji.
  7. Aby zoptymalizować obraz, przejdź do okna Kanały. Odznacz Ścieżka2, podświetl Ścieżka1 i kliknij Na żywo. W razie potrzeby ustaw ostrość obrazu.
  8. W oknie Channels (Kanały) dostosuj następujące; kliknij na 1AU, aby automatycznie zoptymalizować otwor. Bardzo ważne jest, aby wykonać ten krok, w przeciwnym razie obrazy konfokalne będą nieoptymalne. Dostosuj wzmocnienie, aby uzyskać najlepszą intensywność (utrzymuj to ustawienie poniżej 800, aby zredukować dodatkowy szum). Na koniec ustaw wzmocnienie cyfrowe między 2 a 3.
  9. Odznacz Ścieżkę1, kliknij Ścieżkę2 i powtórz Krok 3.8 dla Ścieżki2. Następnie zatrzymaj Ścieżkę na żywo.
  10. Przejdź do okna Tryb pozyskiwania. Popraw obraz, optymalizując rozmiar klatki i uśrednianie. Aby zmienić rozmiar ramki, przejdź do X*Y i wybierz 1,024 x 1,024. Wybierz niską prędkość, aby uzyskać lepszy obraz.
  11. Przejdź do sekcji Uśrednianie i wybierz liczbę ≥4. Ta wartość uśrednienia wskazuje liczbę skanów, które zostaną uśrednione w celu uzyskania uzyskanego obrazu. Teraz kliknij przycisk Snap i zapisz przechwycony obraz 2D.
  12. W przypadku obrazowania 3D zaznacz element Z-Stack w Smart Setup powodując otwarcie okna Z-Stack.
  13. Ustaw pierwszą i ostatnią pozycję dla Z-Stack, czyli głębokość komórki. Najpierw kliknij Na żywo. Następnie użyj napędu ostrości mikroskopu, aby ustawić ostrość na najwyższym położeniu astrocytu w tkance, gdzie ma się rozpocząć Z-Stack. Kliknij Ustaw najpierw. Następnie skup się na najniższej pozycji astrocytu w tkance, gdzie skanowanie Z-Stack powinno zostać zatrzymane. Kliknij Ustaw ostatnie. Następnie zatrzymaj transmisję na żywo.
  14. Wybierz interwał; w bieżącym badaniu stosuje się 1,01 μm; wyboru interwału można dokonać, klikając Optymalny, aby ustawić liczbę wycinków.
  15. Kliknij Rozpocznij eksperyment. Zapisz obrazy po zakończeniu skanowania. Obraz ten zostanie wykorzystany do pomiaru następujących parametrów: powierzchni i objętości terytorium astrocytów, całego astrocytu, w tym gałęzi, ciała komórki i jądra.
  16. Uzyskaj obraz 2D przy użyciu obiektywu 10X lub 20X zgodnie z opisem w krokach 3.6-3.11. Obraz ten może być wykorzystany do pomiaru intensywności fluorescencji, immunoreaktywności przeciwciał oraz gęstości astrocytów (liczba/1 000μm2).

4. Gęstość astrocytów i intensywność fluorescencji GFAP+

  1. Otwórz obraz 2D 20X. Kliknij Histo (hisogram) po lewej stronie okna obrazu.
  2. Aby obliczyć gęstość astrocytów, wybierz trzy kolejne pola widzenia pod obiektywem 20X. Policz liczbę astrocytów, które wykazują klarowną somę z minimalnymi, zachodzącymi na siebie gałęziami na polach.
  3. Aby określić ilościowo intensywność fluorescencji, wybierz odpowiednie narzędzie (prostokąt lub okrąg) w stopce okna obrazu i wybierz obszar do pomiaru. Zwróć uwagę, że wartość średnia i odchylenie standardowe pojawiają się automatycznie pod obrazem. W niniejszej pracy wykorzystano prostokątny obszar o wielkości 0,7mm2 między prążkowiem a blaszką przyśrodkową zakrętu zębatego.

5. Gałęzie astrocytów

  1. Aby określić ilościowo długość i całkowitą liczbę gałęzi, użyj obrazów 3D (uzyskanych z 20X) w oprogramowaniu do analizy obrazu. Narysuj linię ręcznie wzdłuż długości każdej gałęzi wybranego astrocytu. Następnie wybierz narzędzie pomiarowe, które jest wyspecjalizowane w pomiarze długości linii. Aby określić ilościowo liczbę gałęzi, wybierz narzędzie zliczające, aby policzyć liczbę oznaczonych elementów.

6. Objętość i powierzchnia

UWAGA: Ręczne oznaczanie konstrukcji w oprogramowaniu do analizy obrazów 3D wymaga skupienia i treningu. Poćwicz kilka razy przed rozpoczęciem eksperymentu.

  1. Aby określić ilościowo objętość i powierzchnię jądra astrocytów, somy, ciała i terytorium komórki, przenieś obrazy 3D (uzyskane w krokach 3.1-3.16) do oprogramowania do analizy obrazów 3D, takiego jak Volocity 6.1.
  2. Otwórz oprogramowanie i utwórz nową bibliotekę. Przeciągnij wszystkie obrazy do lewej szarej kolumny w nowej bibliotece. Następnie wybierz jeden obraz 3D. Po prawej stronie znajdują się różne kanały w różnych kolorach. Włącz jeden kanał zainteresowania; na przykład niebieski kanał dla DAPI podczas pomiaru jądra. Zmień jasność ręcznie, aby uzyskać optymalny kontrast.
  3. Wybierz menu Narzędzia, przejdź do opcji Utwórz objętość i utwórz pojedynczy obraz 3D z obrazów stosu Z. Kliknij Właściwości w menu Edycja i upewnij się, że prezentowane są właściwości X, Y i Z; w przeciwnym razie niemożliwe jest przeprowadzenie analizy 3D.
  4. Kliknij ikonę narzędzia RIO odręcznego na pasku narzędzi. Aby zmierzyć objętość i powierzchnię jądra astrocytów, narysuj linię wokół jądra oznaczonego DAPI\u2012.
  5. Aby zmierzyć objętość i powierzchnię ciała komórki astrocytów, narysuj linię wokół somy z wyłączeniem gałęzi.
  6. Aby zmierzyć objętość i powierzchnię całego astrocytu (ciała komórki, w tym gałęzi), narysuj linię wokół somy, podążając za powierzchnią wszystkich gałęzi.
  7. Aby ocenić objętość i powierzchnię terytorium astrocytów, narysuj linię między końcami gałęzi.
    UWAGA: Naciśnij Delete na klawiaturze, aby usunąć niechciane rysunki.
  8. Kliknij menu Measurements (Pomiary) w górnej części okna obrazu, aby utworzyć protokół pomiarowy; otworzy się okno zawierające różne narzędzia.
  9. Przeciągnij pozycję Znajdź obiekty na górę okna (okienka). Nadaj opisową nazwę populacji 1, wybierz powiązany kolor i kliknij przycisk Zmierz. Otworzy się kolejne okno.
  10. Wybierz parametr, np. objętość lub powierzchnię. Kliknij OK. Dane pojawią się w tabeli.
  11. Aby zapisać dane, kliknij menu Pomiar i wybierz opcję Utwórz element pomiaru.
  12. Wybierz Nowy element miary wywoływany w otwartym oknie. Następnie nadaj nazwę danym i kliknij OK.
  13. Na koniec wyeksportuj dane do oprogramowania statystycznego, takiego jak Graph pad lub program Excel. Użyj testu t, aby przeanalizować dane, a następnie wykreśl wykresy 2D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono przykłady obserwacji jakościowych i ilościowych uzyskanych w drodze analizy morfometrycznej 3D. Pełne wyniki dla wszystkich 12 wspomnianych wcześniej parametrów znajdują się w naszej poprzedniej publikacji10.

Obserwacje jakościowe

Astrocytom towarzyszyły cienkie lub grube wypustki, które zazwyczaj były długie u szczurów po wstrzyknięciu Aβ1-40 (Rysunek 1). W korze mózgu zaobserwowano nieliczne małe as...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W obecnym protokole zastosowaliśmy morfometrię konfokalną 3D do oceny 12 różnych parametrów związanych z morfologią astrocytów. W tym celu wykorzystano tkankę hipokampa szczurów z astroglejozą wywołaną Aβ1-40\u2012, z lub bez wstępnego leczenia genisteiny jako środka przeciwzapalnego. Korzystając z obrazów 3D i oprogramowania morfometrycznego, byliśmy w stanie pokazać wpływ genisteiny na astroglejozę, czyli morfologię astrocytów.

Zmiany w wewnątrz- i zewnątrzkomó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Prace te były wspierane przez granty Rady Hrabstwa Östergötland (Szwecja) oraz Centrum Badań Komórkowych i Molekularnych na Irańskim Uniwersytecie Nauk Medycznych (Teheran, Iran).

Podziękowania

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Amyloid beta 1-40Sigma Aldrich79793Trzymaj w -70 ° C
GenisteinSigma Aldrich446-72-0trzymaj się -20 ° C
wielokolkolnicze przeciwciała królicze przeciwko fibrylarnemu białku kwasowemu glejowemuDAKOZ0334
alkaliczne przeciwciała anty-króliczą IgG świń sprzężone z fosforanamiDAKO
Płynny chromogen trwałyDAKOK0640
Płynny trwały bufor do czerwonego podłożaDAKOK0640
Cremophor ELSigma Aldrich27963Polietylenotleniowany olej rycynowy - Krok 1.1
LSM 700 Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowaCarl Zeiss
Volocity 6.3Perkin Elmer Inc.,
Analiza obrazu 2000Aparat streotaksyjny Tekno Optic
Tablet Stoelting
Graph pad Prism 5Graph pad software Inc.

Bibliografia

  1. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  2. Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
  3. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
  4. Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  6. Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
  7. Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
  8. Paxinos, G., Watson, C. A stereotaxic atlas of the rat brain. , Academic. New York. (1998).
  9. Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079(2012).
  10. Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526(2013).
  11. Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
  12. Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
  13. Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Morfologia astrocyt wmikroskopia konfokalnaanaliza obraz w 3Doprogramowanie Volocityimmunostaining GFAPintensywno fluorescencjiterytorium astrocytuobj to j drad ugo ga zig sto kom rek
Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.