Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów

W zdrowym ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), astrocyty odgrywają ważną rolę w regulacji przepływu krwi, metabolizmu energetycznego, funkcji synaptycznych i plastyczności oraz homeostazy zewnątrzkomórkowych jonów i neuroprzekaźników^1-3. Ponadto astrocyty reagują na różne szkodliwe bodźce i nieprawidłowe stany, takie jak uraz, infekcja, niedokrwienie lub neurodegeneracja poprzez astroglejozę reaktywną, która charakteryzuje się hipertrofią, proliferacją i funkcjonalną przebudową astrocytów^4,5.

Astroglejoza reaktywna może zainstruować reakcję zapalną i proces naprawy w tkance, a tym samym może wpływać na kliniczne wyniki interwencji terapeutycznych. W związku z tym astrocyty zyskały uwagę neurobiologów w ciągu ostatnich dziesięcioleci jako potencjalne cele interwencji terapeutycznych w przypadku różnych chorób wpływających na OUN.

Astrocyty zazwyczaj mają gwiaździsty kształt z dobrze zaznaczonymi gałęziami, które rozprzestrzeniają się wokół somy⁶. W chorobie mózgu gałęzie astrocytów stają się pofałdowane i wykazują spuchnięte końce⁷, na przykład w obecności beta-amyloidu (Aβ).

Ten artykuł przedstawia protokół analizy obrazów 3D astrocytów uzyskanych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zmierzono dwanaście różnych parametrów ilościowych dla każdego astrocytu: powierzchnie i objętości terytorium astrocytów (tkanka pokryta astrocytem), cała komórka (w tym gałęzie), ciało komórki i jądro; całkowita długość i liczba odgałęzień; intensywność fluorescencji przeciwciał stosowanych do wykrywania astrocytów; i gęstość astrocytów (liczba/1 000 μm²). W tym celu wykorzystaliśmy skrawki mózgu szczurów narażonych na wstrzyknięcie do hipokampa Aβ_1-40 z leczeniem genisteiną lub bez niej jako substancji przeciwzapalnej. Opisany protokół może być stosowany do analizy morfometrycznej różnych typów komórek in vitro lub in vivo w różnych warunkach.

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami określonymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych (NIH) zatwierdzonym przez Komitet Etyki Irańskiego Uniwersytetu Nauk Medycznych (Teheran, Iran).

1. Zwierzęta, chirurgia i preparaty próbek

UWAGA: Przygotuj tkankę mózgową do konfokalnej analizy mikroskopowej 3D.

1. Podziel zwierzęta losowo na dwie grupy: Aβ_1-40 – wstrzyknięcie (n = 8) i Aβ_1-40 – wstrzyknięcie z leczeniem genisteiną (n = 8); podawać genisteinę (10 mg/kg rozcieńczoną w podłożu, takim jak polietylenowy olej rycynowy) przez zgłębnik 1 godzinę przed zabiegiem.
2. Znieczulić zwierzęta ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg). Prawidłowe znieczulenie należy potwierdzić poprzez brak odruchu wycofania po uszczypnięciu palca u nogi. Podczas zabiegu należy stosować maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
3. Umieść zwierzęta w aparacie stereotaktycznym i ogol głowę. Zastosuj roztwór jodu, aby oczyścić skórę głowy przed nacięciem i utrzymuj miejsce operacji w sterylności podczas operacji, aby zmniejszyć ryzyko infekcji. Wstrzyknąć Aβ_1-40 stereotaktycznie (4 μl) do hipokampa na wysokości −3,5 mm za bregmą, ± 2 mm z boku do linii środkowej i −2,8 mm poniżej opony twardej, zgodnie z atlasem mózgu szczura⁸. Dla metody stereotaktycznej patrz poprzednia publikacja⁹.
4. Zapewnić obserwację/opiekę pooperacyjną do momentu, gdy zwierzęta będą w pełni świadome, aby zapewnić im komfort. Utrzymuj zwierzęta w cieple podczas rekonwalescencji i nie umieszczaj ich z powrotem w klatce z innymi zwierzętami aż do pełnego wyzdrowienia. Zwróć uwagę na wszelkie oznaki infekcji u zwierząt po operacji.
5. Znieczulenie zwierząt należy dokładnie przeprowadzić za pomocą ketaminy (150 mg/kg) trzy tygodnie po zabiegu. Wykonać stabilizację przezsercową poprzez perfuzję zwierząt 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 4% paraformaldehydu w 0,1 M PBS (pH = 7,4), a następnie usunąć i naprawić mózg zgodnie z opisem w¹⁰.
6. Po utrwaleniu mózgów w 4% paraformaldehydzie przez 2-3 dni w temperaturze 4 °C.
7. Osadź tkankę w blokach parafiny za pomocą sprzętu do zatapiania tkanek i unikaj niedopełniania lub przepełniania kasety, ponieważ może to zakłócać prawidłowe wyrównanie lub sekcję. Zwróć uwagę na orientację tkanki w bloku parafinowym.
   UWAGA: Na przykład hipokamp szczura znajduje się blisko tylnej części półkuli mózgowej. Dlatego tkanka powinna być osadzona w taki sposób, aby sekcja zaczynała się w tylnej części mózgu. Użyj atlasu Paxinos⁸ jako przewodnika, aby osiągnąć pożądaną strukturę anatomiczną.
8. Umieść mikrotom z dala od przeciągów powietrza lub drzwi, ponieważ ruchy powietrza utrudniają przenoszenie sekcji.
9. Użyj przekrojów o grubości ≥20 μm, ponieważ ta głębokość jest niezbędna do uzyskania obrazów Z-Stack kompletnych astrocytów. Nie używaj pierwszych kilku sekcji, ponieważ mogą one mieć niepożądaną grubość ze względu na rozszerzalność cieplną.
10. Umieść sekcje na powierzchni ciepłej wody (5 ± 2 °C, poniżej temperatury topnienia parafiny) na tyle długo, aby spłaszczyć sekcje.
    UWAGA: Nadmierne rozszerzenie przekroju może zaburzyć morfologię konstrukcji. Użyj małego pędzla, aby ostrożnie przenieść sekcje. Zbierz od dwóch do trzech sekcji na każdym slajdzie.
11. Przechowuj szkiełka w stojaku w pozycji pionowej i pozwól im wyschnąć w temperaturze 37 °C przez kilka godzin lub O/N.

2. Immunohistochemia

1. Odparafinować skrawki w ksylenie, 2 x 10 min, i ponownie nawodnić za pomocą gradientu alkoholu (99,8%, 95% i 70%, 10 min każdy) i PBS.
2. Inkubować z przeciwciałami przeciwko kwaśnemu białku fibrylarnemu gleju (GFAP) rozcieńczonym w stosunku 1:1,500 w PBS zawierającym 0,25% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,25% Triton X-100 i 3,5% normalnej surowicy (O/N w temperaturze 4 °C).
3. Myć sekcje w PBS przez 3 x 5 min.
4. Inkubować z drugorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z fosforanami alkalicznymi przez 1 godzinę (1:100, 21 °C, rozcieńczone w PBS).
5. Myj sekcje w PBS przez 3 x 5 min.
   UWAGA: Ważne jest, aby odpowiednio umyć skrawki po przeciwciałach wtórnych, aby zminimalizować barwienie tła.
6. Inkubuj sekcje w ciemności za pomocą Liquid Permanent Red Chromogen (15-20 min). Uwaga: Roztwór należy przygotować nie później niż 30 minut przed użyciem.
7. Myć sekcje w PBS przez 3 x 5 min.
8. Na koniec wybarwić jądra 4-6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI; 1:500, rozcieńczony w PBS) przed pokryciem. Przechowuj szkiełka w lodówce 24-48 godzin przed mikroskopią.

3. Mikroskopia konfokalna

UWAGA: Do oceny ilościowej (patrz poniżej), wybierz astrocyt z wyraźnie widocznym jądrem wybarwionym DAPI z minimalną liczbą nakładających się na siebie gałęzi, aby zmniejszyć ryzyko błędów. Tworzenie obrazów Z-Stack jest czasochłonne. Uzbrój się w cierpliwość i nie zatrzymuj się podczas przetwarzania. Pionowy konfokalny laserowy mikroskop skaningowy służy do tworzenia obrazów 3D z astrocytów.

1. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i wybierz obiektyw 63X.
2. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i kliknij Start systemu. Kliknij kartę Zlokalizuj. Przejdź do opcji Przypisz i wybierz GFP, aby dostosować odpowiednie światło.
3. Otwórz migawkę, aby odbijać światło. Znajdź rewolwer reflektorowy po prawej stronie migawki i wybierz kolor, który ma być odbijany przez astrocyty (zielony, czerwony lub fioletowy); Użyto tutaj koloru czerwonego (FSet20 wf).
   UWAGA: Nie zapomnij ustawić ostrości obrazu bezpośrednio w oku mikroskopu.
4. Aby znaleźć najlepszą ostrość, kliknij Wszystkie zamknięte, umieść pinezkę mikroskopu w trybie ekranu i kliknij kartę Akwizycja.
5. Kliknij Smart Setup na karcie Akwizycja; otworzy się okno. Wybierz odpowiedni fluorofor (tj. DAPI i Alexa Fluor 555, w bieżącym projekcie) z listy. Kolor jest wybierany automatycznie.
6. Kliknij Najlepszy sygnał i Zastosuj, a następnie kliknij Ustaw ekspozycję; komputer automatycznie ustawi parametry ekspozycji.
7. Aby zoptymalizować obraz, przejdź do okna Kanały. Odznacz Ścieżka2, podświetl Ścieżka1 i kliknij Na żywo. W razie potrzeby ustaw ostrość obrazu.
8. W oknie Channels (Kanały) dostosuj następujące; kliknij na 1AU, aby automatycznie zoptymalizować otwor. Bardzo ważne jest, aby wykonać ten krok, w przeciwnym razie obrazy konfokalne będą nieoptymalne. Dostosuj wzmocnienie, aby uzyskać najlepszą intensywność (utrzymuj to ustawienie poniżej 800, aby zredukować dodatkowy szum). Na koniec ustaw wzmocnienie cyfrowe między 2 a 3.
9. Odznacz Ścieżkę1, kliknij Ścieżkę2 i powtórz Krok 3.8 dla Ścieżki2. Następnie zatrzymaj Ścieżkę na żywo.
10. Przejdź do okna Tryb pozyskiwania. Popraw obraz, optymalizując rozmiar klatki i uśrednianie. Aby zmienić rozmiar ramki, przejdź do X*Y i wybierz 1,024 x 1,024. Wybierz niską prędkość, aby uzyskać lepszy obraz.
11. Przejdź do sekcji Uśrednianie i wybierz liczbę ≥4. Ta wartość uśrednienia wskazuje liczbę skanów, które zostaną uśrednione w celu uzyskania uzyskanego obrazu. Teraz kliknij przycisk Snap i zapisz przechwycony obraz 2D.
12. W przypadku obrazowania 3D zaznacz element Z-Stack w Smart Setup powodując otwarcie okna Z-Stack.
13. Ustaw pierwszą i ostatnią pozycję dla Z-Stack, czyli głębokość komórki. Najpierw kliknij Na żywo. Następnie użyj napędu ostrości mikroskopu, aby ustawić ostrość na najwyższym położeniu astrocytu w tkance, gdzie ma się rozpocząć Z-Stack. Kliknij Ustaw najpierw. Następnie skup się na najniższej pozycji astrocytu w tkance, gdzie skanowanie Z-Stack powinno zostać zatrzymane. Kliknij Ustaw ostatnie. Następnie zatrzymaj transmisję na żywo.
14. Wybierz interwał; w bieżącym badaniu stosuje się 1,01 μm; wyboru interwału można dokonać, klikając Optymalny, aby ustawić liczbę wycinków.
15. Kliknij Rozpocznij eksperyment. Zapisz obrazy po zakończeniu skanowania. Obraz ten zostanie wykorzystany do pomiaru następujących parametrów: powierzchni i objętości terytorium astrocytów, całego astrocytu, w tym gałęzi, ciała komórki i jądra.
16. Uzyskaj obraz 2D przy użyciu obiektywu 10X lub 20X zgodnie z opisem w krokach 3.6-3.11. Obraz ten może być wykorzystany do pomiaru intensywności fluorescencji, immunoreaktywności przeciwciał oraz gęstości astrocytów (liczba/1 000^μm2).

4. Gęstość astrocytów i intensywność fluorescencji GFAP⁺

1. Otwórz obraz 2D 20X. Kliknij Histo (hisogram) po lewej stronie okna obrazu.
2. Aby obliczyć gęstość astrocytów, wybierz trzy kolejne pola widzenia pod obiektywem 20X. Policz liczbę astrocytów, które wykazują klarowną somę z minimalnymi, zachodzącymi na siebie gałęziami na polach.
3. Aby określić ilościowo intensywność fluorescencji, wybierz odpowiednie narzędzie (prostokąt lub okrąg) w stopce okna obrazu i wybierz obszar do pomiaru. Zwróć uwagę, że wartość średnia i odchylenie standardowe pojawiają się automatycznie pod obrazem. W niniejszej pracy wykorzystano prostokątny obszar o wielkości 0,7^mm2 między prążkowiem a blaszką przyśrodkową zakrętu zębatego.

5. Gałęzie astrocytów

1. Aby określić ilościowo długość i całkowitą liczbę gałęzi, użyj obrazów 3D (uzyskanych z 20X) w oprogramowaniu do analizy obrazu. Narysuj linię ręcznie wzdłuż długości każdej gałęzi wybranego astrocytu. Następnie wybierz narzędzie pomiarowe, które jest wyspecjalizowane w pomiarze długości linii. Aby określić ilościowo liczbę gałęzi, wybierz narzędzie zliczające, aby policzyć liczbę oznaczonych elementów.

6. Objętość i powierzchnia

UWAGA: Ręczne oznaczanie konstrukcji w oprogramowaniu do analizy obrazów 3D wymaga skupienia i treningu. Poćwicz kilka razy przed rozpoczęciem eksperymentu.

1. Aby określić ilościowo objętość i powierzchnię jądra astrocytów, somy, ciała i terytorium komórki, przenieś obrazy 3D (uzyskane w krokach 3.1-3.16) do oprogramowania do analizy obrazów 3D, takiego jak Volocity 6.1.
2. Otwórz oprogramowanie i utwórz nową bibliotekę. Przeciągnij wszystkie obrazy do lewej szarej kolumny w nowej bibliotece. Następnie wybierz jeden obraz 3D. Po prawej stronie znajdują się różne kanały w różnych kolorach. Włącz jeden kanał zainteresowania; na przykład niebieski kanał dla DAPI podczas pomiaru jądra. Zmień jasność ręcznie, aby uzyskać optymalny kontrast.
3. Wybierz menu Narzędzia, przejdź do opcji Utwórz objętość i utwórz pojedynczy obraz 3D z obrazów stosu Z. Kliknij Właściwości w menu Edycja i upewnij się, że prezentowane są właściwości X, Y i Z; w przeciwnym razie niemożliwe jest przeprowadzenie analizy 3D.
4. Kliknij ikonę narzędzia RIO odręcznego na pasku narzędzi. Aby zmierzyć objętość i powierzchnię jądra astrocytów, narysuj linię wokół jądra oznaczonego DAPI\u2012.
5. Aby zmierzyć objętość i powierzchnię ciała komórki astrocytów, narysuj linię wokół somy z wyłączeniem gałęzi.
6. Aby zmierzyć objętość i powierzchnię całego astrocytu (ciała komórki, w tym gałęzi), narysuj linię wokół somy, podążając za powierzchnią wszystkich gałęzi.
7. Aby ocenić objętość i powierzchnię terytorium astrocytów, narysuj linię między końcami gałęzi.
   UWAGA: Naciśnij Delete na klawiaturze, aby usunąć niechciane rysunki.
8. Kliknij menu Measurements (Pomiary) w górnej części okna obrazu, aby utworzyć protokół pomiarowy; otworzy się okno zawierające różne narzędzia.
9. Przeciągnij pozycję Znajdź obiekty na górę okna (okienka). Nadaj opisową nazwę populacji 1, wybierz powiązany kolor i kliknij przycisk Zmierz. Otworzy się kolejne okno.
10. Wybierz parametr, np. objętość lub powierzchnię. Kliknij OK. Dane pojawią się w tabeli.
11. Aby zapisać dane, kliknij menu Pomiar i wybierz opcję Utwórz element pomiaru.
12. Wybierz Nowy element miary wywoływany w otwartym oknie. Następnie nadaj nazwę danym i kliknij OK.
13. Na koniec wyeksportuj dane do oprogramowania statystycznego, takiego jak Graph pad lub program Excel. Użyj testu t, aby przeanalizować dane, a następnie wykreśl wykresy 2D.

Ta sekcja przedstawia kilka przykładów jakościowych i ilościowych obserwacji uzyskanych przez analizę morfometryczną 3D. Pełne wyniki wszystkich 12 parametrów wymienionych wcześniej znajdują się w naszej poprzedniej publikacji10.

Obserwacje jakościowe

Astrocyty wykazywały cienkie lub grube gałęzie, które zwykle były długie u szczurów, którym wstrzyknięto Aβ1-40 (Rysunek 1). W korze mózgowej zaobserwowano kilka małych astrocytów w kształcie gwiazdy z krótkimi gałęziami, a zwarta sieć astrocytów wystąpiła w ciele modzelowatym.

Astrocyty w tkankach mózgowych zwierząt z Aβ1-40\u2012wstrzyknięciem, a następnie leczeniem genisteiną, wykazywały formę gwiaździstą z krótkimi i cienkimi gałęziami (Ryc. 2)10. Kilka astrocytów wykazywało atroficzny wygląd.

Gęstość astrocytów i intensywność fluorescencji GFAP+

Średnia liczba astrocytów/1,000μm2 była znacznie wyższa u szczurów z Aβ1-40\u2012iniekcją w porównaniu ze zwierzętami w grupie Aβ1-40\u2012iniekcji i leczenia genisteiną (P <0,0001). Ponadto intensywność fluorescencji GFAP+ była znacznie niższa w części mózgu z leczeniem genisteiną w porównaniu z nieleczonymi zwierzętami, którym wstrzyknięto Aβ1-40 (Figura 3).

Analiza morfometryczna objętości astrocytów

Objętość jądra astrocytów, ciała komórki, całego astrocytu i terytorium astrocytów znacznie zmniejszyła się w grupie leczonej genisteiną w porównaniu ze zwierzętami nieleczonymi. Wynik ten sugeruje, że genisteina złagodziła astroglejozę spowodowaną obecnością amyloidu (ryc. 4A-D).

Ryc. 1. Konfokalny obraz astrocytu. Pojedynczy astrocyt z grubymi i długimi gałęziami (grot strzały) i jądrem znakowanym DAPI (strzałka) w mózgu szczura poddanym wstrzyknięciu do hipokampa Aβ1-40. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 2. Konfokalny obraz astrocytu. Astrocyt z krótkimi gałęziami (grot strzały). W mózgu szczura poddanego wstrzyknięciu Aβ1-40 w hipokampie i wstępnemu leczeniu genisteiny podawanemu przez zgłębnik. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3. Intensywność fluorescencji GFAP+ znacznie zmniejszyła się u zwierząt z wstrzyknięciem Aβ1-40\u2012, które otrzymały genisteinę przed leczeniem. Wartości są średnie± SEM. Oceniono pięćdziesiąt astrocytów na zwierzę. P <0,05 uznano za istotne, a test T zastosowano do porównania danych między grupami z leczeniem lub bez leczenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Średnia objętość jądra (A), ciała komórki (B), astrocytu (w tym gałęzi; (C) i terytorium (D) w próbkach mózgu pobranych od szczurów poddanych wstrzyknięciu Aβ1-40, z lub bez wstępnego leczenia genisteiną. Genisteina znacząco poprawiła powiększenie jądra, ciała komórki, całego astrocytu i terytorium astrocytów (patrz odnośnik10). Wartości są średnie± SEM. Oceniono pięćdziesiąt astrocytów na zwierzę. P <0,05 uznano za istotne, a test T zastosowano do porównania danych między grupami przed i po leczeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Prace te były wspierane przez granty Rady Hrabstwa Östergötland (Szwecja) oraz Centrum Badań Komórkowych i Molekularnych na Irańskim Uniwersytecie Nauk Medycznych (Teheran, Iran).