Method Article

Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów

DOI:

10.3791/53113

⸱

December 11th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University, 2Neurophysiology Research Center, Shahed University, 3Cellular and Molecular Research Center, Iran University of Medical Sciences, 4School of Advanced Technologies in Medicine, Iran University of Medical Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrocyty w OUN zmieniają swoje właściwości funkcjonalne i strukturalne w odpowiedzi na szkodliwe bodźce. W artykule przedstawiono protokół oceny trójwymiarowej morfologii astrocytów w stanach chorobowych lub po interwencjach terapeutycznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako komórki glejowe w mózgu, astrocyty pełnią różne funkcjonalne role w ośrodkowym układzie nerwowym. W obecności szkodliwych bodźców astrocyty modyfikują swoje właściwości funkcjonalne i strukturalne, co nazywa się astroglejozą reaktywną. W niniejszej pracy przedstawiono protokół oceny właściwości morfologicznych astrocytów. Protokół ten obejmuje kwantyfikację 12 różnych parametrów, tj. powierzchni i objętości tkanki pokrytej przez astrocyt (terytorium astrocytów), całego astrocytu, w tym gałęzi, ciała komórki i jądra, a także całkowitej długości i liczby gałęzi, intensywności immunoreaktywności fluorescencyjnej przeciwciał stosowanych do wykrywania astrocytów oraz gęstości astrocytów (liczba/1 000 μm2). W tym celu stworzono trójwymiarowe (3D) konfokalne obrazy mikroskopowe, a do pomiarów wykorzystano oprogramowanie do analizy obrazu 3D, takie jak Volocity 6.3. Do przedstawienia metody wykorzystano tkankę mózgową szczura wystawioną na działanie amyloidu beta1-40 (Aβ1-40) z interwencją terapeutyczną lub bez niej. Protokół ten może być również stosowany do analizy morfometrycznej 3D innych komórek w warunkach in vivo lub in vitro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W zdrowym ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), astrocyty odgrywają ważną rolę w regulacji przepływu krwi, metabolizmu energetycznego, funkcji synaptycznych i plastyczności oraz homeostazy zewnątrzkomórkowych jonów i neuroprzekaźników1-3. Ponadto astrocyty reagują na różne szkodliwe bodźce i nieprawidłowe stany, takie jak uraz, infekcja, niedokrwienie lub neurodegeneracja poprzez astroglejozę reaktywną, która charakteryzuje się hipertrofią, proliferacją i funkcjonalną przebudową astrocytów4,5.

Astroglejoza reaktywna może zainstruować reakcję zapalną i proces naprawy w tkance, a tym samym może wpływać na kliniczne wyniki ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami określonymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych (NIH) zatwierdzonym przez Komitet Etyki Irańskiego Uniwersytetu Nauk Medycznych (Teheran, Iran).

1. Zwierzęta, chirurgia i preparaty próbek

UWAGA: Przygotuj tkankę mózgową do konfokalnej analizy mikroskopowej 3D.

  1. Podziel zwierzęta losowo na dwie grupy: Aβ1-40 – wstrzyknięcie (n = 8) i Aβ1-40 – wstrzyknięcie z leczeniem genisteiną (n = 8); podawać genisteinę (10 mg/kg rozcieńczoną w podłożu, takim jak polietylenowy olej rycynowy) przez zgłębnik 1 godzinę ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta sekcja przedstawia kilka przykładów jakościowych i ilościowych obserwacji uzyskanych przez analizę morfometryczną 3D. Pełne wyniki wszystkich 12 parametrów wymienionych wcześniej znajdują się w naszej poprzedniej publikacji10.

Obserwacje jakościowe

Astrocyty wykazywały cienkie lub grube gałęzie, które zwykle były długie u szczurów, którym wstrzyknięto Aβ1-40 (Rysunek 1). W korze mózgowej zaobserwowano kilka małych astrocytów.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnym protokole zastosowaliśmy morfometrię konfokalną 3D do oceny 12 różnych parametrów związanych z morfologią astrocytów. W tym celu wykorzystano tkankę hipokampa szczurów z astroglejozą wywołaną Aβ1-40\u2012, z lub bez wstępnego leczenia genisteiny jako środka przeciwzapalnego. Korzystając z obrazów 3D i oprogramowania morfometrycznego, byliśmy w stanie pokazać wpływ genisteiny na astroglejozę, czyli morfologię astrocytów.

Zmiany w wewnątrz- i zewnątrzkomó.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez granty Rady Hrabstwa Östergötland (Szwecja) oraz Centrum Badań Komórkowych i Molekularnych na Irańskim Uniwersytecie Nauk Medycznych (Teheran, Iran).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amyloid beta 1-40Sigma Aldrich79793Trzymaj w -70 ° C
GenisteinSigma Aldrich446-72-0trzymaj się -20 ° C
wielokolkolnicze przeciwciała królicze przeciwko fibrylarnemu białku kwasowemu glejowemuDAKOZ0334
alkaliczne przeciwciała anty-króliczą IgG świń sprzężone z fosforanamiDAKO
Płynny chromogen trwałyDAKOK0640
Płynny trwały bufor do czerwonego podłożaDAKOK0640
Cremophor ELSigma Aldrich27963Polietylenotleniowany olej rycynowy - Krok 1.1
LSM 700 Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowaCarl Zeiss
Volocity 6.3Perkin Elmer Inc.,
Analiza obrazu 2000Aparat streotaksyjny Tekno Optic
Tablet Stoelting
Graph pad Prism 5Graph pad software Inc.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  2. Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Astrocyte MorphologyConfocal Microscopy3D Image AnalysisVolocity SoftwareGFAP ImmunostainingFluorescence IntensityAstrocyte TerritoryNuclear VolumeBranch LengthCell Density

Related Articles