Method Article

Analiza rozwoju unerwienia zarodków zębów za pomocą urządzeń do kohodowli mikroprzepływowej

DOI:

10.3791/53114

August 14th, 2015

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Współkultury stanowią cenną metodę badania interakcji między nerwami a docelowymi tkankami i narządami. Systemy mikroprzepływowe umożliwiają kokulturację zwojów nerwowych i całych rozwijających się narządów lub tkanek w różnych pożywkach hodowlanych, stanowiąc w ten sposób cenne narzędzie do badania in vitro wzajemnych oddziaływań między neuronami a ich celami.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unerwienie odgrywa kluczową rolę w rozwoju, homeostazie i regeneracji narządów i tkanek. Jednak mechanizmy leżące u podstaw tych zjawisk nie są jeszcze dobrze poznane. W szczególności zaniedbywana jest rola unerwienia w rozwoju i regeneracji zębów.

Kilka badań in vivo dostarczyło ważnych informacji na temat wzorców unerwienia tkanek zębowych podczas procesów rozwoju i naprawy różnych modeli zwierzęcych. Jednak większość z tych podejść nie jest optymalna, aby podkreślić molekularne podstawy interakcji między włóknami nerwowymi a docelowymi narządami i tkankami.

Współkultury stanowią cenną metodę badania i manipulowania interakcjami między włóknami nerwowymi a zębami w kontrolowanym i izolowanym środowisku. W ostatnich dziesięcioleciach konwencjonalne kokultury z użyciem tej samej pożywki były przeprowadzane przez bardzo krótkie okresy (np. dwa dni) w celu zbadania atrakcyjnego lub odpychającego wpływu rozwijających się tkanek jamy ustnej i zębów na czuciowe włókna nerwowe. Wydłużenie okresu hodowli jest jednak konieczne w celu zbadania wpływu unerwienia na morfogenezę zębów i cytoróżnicowanie.

Systemy mikroprzepływowe pozwalają na kohodowle neuronów i różnych typów komórek w odpowiednich pożywkach hodowlanych. Niedawno wykazaliśmy, że zwoje nerwu trójdzielnego (TG) i zęby są w stanie przetrwać przez długi czas, gdy są hodowane wspólnie w urządzeniach mikroprzepływowych i że utrzymują w tych warunkach ten sam wzorzec unerwienia, który wykazują in vivo.

Na tej podstawie opisujemy, jak izolować i współhodować rozwijające się zwoje nerwu trójdzielnego i zarodki zębów w mikroprzepływowym systemie kohodowli. Protokół ten opisuje prosty i elastyczny sposób wspólnej hodowli zwojów/nerwów i tkanek docelowych oraz badania roli określonych cząsteczek w takich interakcjach w kontrolowanym i izolowanym środowisku.

Introduction

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unerwienie odgrywa kluczową rolę w rozwoju, homeostazie i regeneracji narządów i tkanek 1,2. Ponadto unerwienie bierze udział w regulacji proliferacji, mobilizacji i różnicowania komórek macierzystych 3-5. Rzeczywiście, ostatnie badania przeprowadzone w tkankach kompleksu ustno-twarzowego wykazały, że nerwy przywspółczulne są niezbędne do funkcjonowania nabłonkowych komórek progenitorowych podczas rozwoju i regeneracji gruczołów ślinowych 6,7. Podobnie wykazano, że unerwienie jest niezbędne do rozwoju i utrzymania kubków smakowych 811. Dlatego ważne jest, aby przeanalizować wciąż ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie myszy były utrzymywane i traktowane zgodnie ze szwajcarską ustawą o dobrostanie zwierząt i zgodnie z przepisami Kantonalnego Urzędu Weterynaryjnego w Zurychu.

1. Przygotowanie materiału preparacyjnego, pożywek hodowlanych, urządzeń mikroprzepływowych

  1. Autoklaw kleszczy i nożyczek do mikropreparacji (121 °C, czas sterylizacji: 20 min) i przechowuj je w sterylnym pojemniku.
  2. Wysterylizować szklane szkiełka nakrywkowe (24 mm x 24 mm) poprzez inkubację w 1 M HCl przez 24 godziny na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C. Przemyć je trzykrotnie sterylnym, destylowanymH2Oi trzykrotnie etanolem 99%. Na....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te wyniki pokazują, że izolowane zwoje nerwu trójdzielnego mogą rosnąć w jednym przedziale urządzenia mikroprzepływowego, a ponadto, że rozwój izolowanych zarodków zębów jest podtrzymywany przez długi okres czasu w drugim przedziale urządzenia mikroprzepływowego. W dwóch przedziałach stosuje się różne pożywki hodowlane, a mikrorowki między dwoma przedziałami umożliwiają przedłużenie aksonu od zwoju trójdzielnego w kierunku rozwijających się zarodków zęba. Rycina 3 przedstawia wizualizację neurofilamentu .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dotychczasowe badania unerwienia zębów in vitro opierały się na konwencjonalnych kohodowlach zwojów nerwu trójdzielnego i tkanek lub komórek zęba 26,28,29. Badania te przeprowadzono głównie w celu zbadania atrakcyjnego wpływu tych komórek lub tkanek na aksony czuciowe 38. Chociaż przyniósł znaczny postęp w tej dziedzinie, poruszono kilka problemów technicznych. Zarodki zębów zaczynają się degenerować po kilku dniach posiewu 37. Opierając się na tych obserwacjach, rosnące neurony .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca została sfinansowana przez Uniwersytet w Zurychu. Autorzy pragną podziękować Estreli Neto i dr Meriem Lamghari za pomoc w ustaleniu warunków kokultury.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AXIS Axon Isolation DevicesMilliporeAX15010-TCDostępne są mikrokanały o różnej długości
LamininSigma AldrichL2020
NeurobasalGibco21103-049
B27Gibco17504
Rekombinowana mysz beta-NGFR& D Systems1156-NG-100Beta-NGF dla ludzi i szczurów (R& D Systems) są odpowiednikami
DMEM-F12Gibco11320-033

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).
  2. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tooth Germ InnervationMicrofluidic Co cultureTrigeminal GangliaTooth Germ IsolationNeurite OutgrowthImmunofluorescence StainingLight MicroscopyCulture Medium ChangeAxonal ChambersMicro Grooves

Related Articles