Analiza rozwoju unerwienia zarodków zębów za pomocą urządzeń do kohodowli mikroprzepływowej

Podsumowanie

Współkultury stanowią cenną metodę badania interakcji między nerwami a docelowymi tkankami i narządami. Systemy mikroprzepływowe umożliwiają kokulturację zwojów nerwowych i całych rozwijających się narządów lub tkanek w różnych pożywkach hodowlanych, stanowiąc w ten sposób cenne narzędzie do badania in vitro wzajemnych oddziaływań między neuronami a ich celami.

Streszczenie

Unerwienie odgrywa kluczową rolę w rozwoju, homeostazie i regeneracji narządów i tkanek. Jednak mechanizmy leżące u podstaw tych zjawisk nie są jeszcze dobrze poznane. W szczególności zaniedbywana jest rola unerwienia w rozwoju i regeneracji zębów.

Kilka badań in vivo dostarczyło ważnych informacji na temat wzorców unerwienia tkanek zębowych podczas procesów rozwoju i naprawy różnych modeli zwierzęcych. Jednak większość z tych podejść nie jest optymalna, aby podkreślić molekularne podstawy interakcji między włóknami nerwowymi a docelowymi narządami i tkankami.

Współkultury stanowią cenną metodę badania i manipulowania interakcjami między włóknami nerwowymi a zębami w kontrolowanym i izolowanym środowisku. W ostatnich dziesięcioleciach konwencjonalne kokultury z użyciem tej samej pożywki były przeprowadzane przez bardzo krótkie okresy (np. dwa dni) w celu zbadania atrakcyjnego lub odpychającego wpływu rozwijających się tkanek jamy ustnej i zębów na czuciowe włókna nerwowe. Wydłużenie okresu hodowli jest jednak konieczne w celu zbadania wpływu unerwienia na morfogenezę zębów i cytoróżnicowanie.

Systemy mikroprzepływowe pozwalają na kohodowle neuronów i różnych typów komórek w odpowiednich pożywkach hodowlanych. Niedawno wykazaliśmy, że zwoje nerwu trójdzielnego (TG) i zęby są w stanie przetrwać przez długi czas, gdy są hodowane wspólnie w urządzeniach mikroprzepływowych i że utrzymują w tych warunkach ten sam wzorzec unerwienia, który wykazują in vivo.

Na tej podstawie opisujemy, jak izolować i współhodować rozwijające się zwoje nerwu trójdzielnego i zarodki zębów w mikroprzepływowym systemie kohodowli. Protokół ten opisuje prosty i elastyczny sposób wspólnej hodowli zwojów/nerwów i tkanek docelowych oraz badania roli określonych cząsteczek w takich interakcjach w kontrolowanym i izolowanym środowisku.

Wprowadzenie

Unerwienie odgrywa kluczową rolę w rozwoju, homeostazie i regeneracji narządów i tkanek ^1,2. Ponadto unerwienie bierze udział w regulacji proliferacji, mobilizacji i różnicowania komórek macierzystych ^3-5. Rzeczywiście, ostatnie badania przeprowadzone w tkankach kompleksu ustno-twarzowego wykazały, że nerwy przywspółczulne są niezbędne do funkcjonowania nabłonkowych komórek progenitorowych podczas rozwoju i regeneracji gruczołów ślinowych ^6,7. Podobnie wykazano, że unerwienie jest niezbędne do rozwoju i utrzymania kubków smakowych ^8–11. Dlatego ważne jest, aby przeanalizować wciąż zaniedbywaną rolę unerwienia w rozwoju innych ważnych narządów i tkanek ustno-twarzowych, takich jak zęby.

Pomimo bogatego unerwienia zębów dorosłych i w przeciwieństwie do wszystkich innych organów i tkanek ciała, rozwijające się zęby zaczynają się unerwiać w najwcześniejszych stadiach posturodzeniowych. Zęby rozwijają się w wyniku sekwencyjnych i wzajemnych interakcji między ektodermą jamy ustnej a mezenchymą pochodzącą z grzebienia nerwowego czaszki. Interakcje te powodują powstawanie ameloblastów pochodzenia nabłonkowego i odontoblastów pochodzących z mezenchymy, które są odpowiedzialne za tworzenie odpowiednio szkliwa i zębiny ¹². Nerwy czuciowe ze zwojów nerwu trójdzielnego i nerwy współczulne ze zwojów szyjnych górnych unerwiają zęby stałe ^13–15. Podczas embriogenezy włókna nerwowe wychodzące ze zwojów nerwu trójdzielnego wystają w kierunku rozwijających się zarodków zęba i stopniowo je otaczają, ale nie przenikają do mezenchymy brodawki zębowej ¹³. Włókna nerwowe dostają się do mezenchymy miazgi zębowej w bardziej zaawansowanych stadiach rozwojowych, które korelują z różnicowaniem odontoblastów i odkładaniem się macierzy zębiny ¹⁶. Unerwienie miazgi zębowej następuje wkrótce po wyrzynaniu się zęba w jamie ustnej ¹³. Wcześniejsze badania wykazały, że różne semaforyny i neurotrofiny biorą udział w regulacji unerwienia podczas odontogenezy ^16-19. Wcześniejsze badania wyraźnie wykazały, że unerwienie jest warunkiem wstępnym tworzenia się zębów u ryb ²⁰. Nowsze badania wykazały, że homeostaza komórek macierzystych mezenchymy zębów w siekaczach myszy jest regulowana przez nerwy czuciowe poprzez wydzielanie jeża sonicznego (shh) ²¹. Niemniej jednak rola unerwienia w inicjacji, rozwoju i regeneracji zębów jest nadal wysoce kontrowersyjna u ssaków ^22–24.

Mnóstwo badań in vivo dostarczyło ważnych informacji na temat wzorców unerwienia tkanek zębowych podczas procesów rozwoju i naprawy różnych modeli zwierzęcych ^13,25,26. Jednak większość z tych podejść nie jest optymalna, aby podkreślić molekularne podstawy interakcji między włóknami nerwowymi a docelowymi narządami i tkankami. Kokultury stanowią cenną metodę badania i manipulowania interakcjami między włóknami nerwowymi a zębami w kontrolowanym i izolowanym środowisku ^26–29. Jednocześnie kokultura podlega różnym dostosowaniom technicznym. Na przykład nerwy i określone tkanki zęba (np. miazga zębowa, mieszek włosowy, nabłonek zębów) często wymagają różnych pożywek hodowlanych, aby zagwarantować przeżycie tkanek przez długi czas ^30–32.

W ostatnich dziesięcioleciach, konwencjonalne kokultury z użyciem tej samej pożywki były przeprowadzane przez bardzo krótkie okresy (np. dwa dni) w celu zbadania atrakcyjnego lub odpychającego wpływu rozwijających się tkanek jamy ustnej i zębowej na czuciowe włókna nerwowe ^27–29. Wydłużenie okresu hodowli jest jednak konieczne w celu zbadania wpływu unerwienia na morfogenezę i cytoróżnicowanie zębów oraz zbadania dynamiki rozgałęzień włókien nerwowych w narządach docelowych. W związku z tym niesąsiadujące ze sobą kokultury byłyby bardziej odpowiednie do przeprowadzania badań nad interakcjami między tkankami neuronalnymi i zębowymi.

Systemy mikroprzepływowe pozwalają na kohodowle neuronów i różnych typów komórek w odpowiednich pożywkach hodowlanych. W tych urządzeniach tkanki zębowe i neurony są oddzielone w różnych przedziałach, umożliwiając jednocześnie wzrost aksonów z ciał komórek nerwowych przez mikrokanały w kierunku przedziału zawierającego tkankę docelową ³³. Urządzenia mikroprzepływowe były już wykorzystywane do badania interakcji między neuronami a mikroglejem ^34,35, a także interakcji międzykomórkowych w nowotworach i neowaskularyzacji ³⁵. Co więcej, systemy te zostały wykorzystane do badania interakcji między zwojami korzeni grzbietowych a osteoblastami ³⁶.

Ostatnio wykazaliśmy, że zwoje nerwu trójdzielnego (TG) i zęby są w stanie przetrwać przez długi czas, gdy są hodowane wspólnie w urządzeniach mikroprzepływowych ³⁷. Ponadto wykazaliśmy, że zęby z różnych stadiów rozwojowych utrzymują w tych warunkach in vitro takie same odpychające lub przyciągające efekty unerwienia nerwu trójdzielnego, jakie wykazują in vivo ³⁷. Protokół ten dostarcza informacji na temat prostego, skutecznego i elastycznego sposobu wspólnej hodowli zwojów/nerwów i tkanek docelowych oraz badania roli określonych cząsteczek w takich interakcjach w kontrolowanym i izolowanym środowisku.

Protokół

Wszystkie myszy były utrzymywane i traktowane zgodnie ze szwajcarską ustawą o dobrostanie zwierząt i zgodnie z przepisami Kantonalnego Urzędu Weterynaryjnego w Zurychu.

1. Przygotowanie materiału preparacyjnego, pożywek hodowlanych, urządzeń mikroprzepływowych

1. Autoklaw kleszczy i nożyczek do mikropreparacji (121 °C, czas sterylizacji: 20 min) i przechowuj je w sterylnym pojemniku.
2. Wysterylizować szklane szkiełka nakrywkowe (24 mm x 24 mm) poprzez inkubację w 1 M HCl przez 24 godziny na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C. Przemyć je trzykrotnie sterylnym, destylowanym_H2Oi trzykrotnie etanolem 99%. Następnie wysuszyć szkiełka nakrywkowe w temperaturze 37 °C lub pod sterylnym kapturem. Na koniec przeprowadź autoklaw lub wystaw szkiełka nakrywkowe na działanie światła UV (30 min), aby zakończyć sterylizację. Szkiełka nakrywkowe można następnie przechowywać w etanolu 70%.
3. Ostrożnie wyjmij urządzenia AXIS Axon Isolation Devices z opakowania za pomocą sterylnych kleszczyków i umieść je na sterylnej szalce Petriego.
4. Za pomocą sterylnego stempla do biopsji (ø: 1 mm) należy wykonać jeden otwór na próbkę do hodowli (ryc. 1) w korespondencji komór hodowlanych.
   UWAGA: Nie przebijaj zbyt blisko mikrorowków, ponieważ mogą one ulec uszkodzeniu w wyniku zastosowanego nacisku.
5. Wysterylizuj urządzenia izolacyjne AXIS Axon, zanurzając je w etanolu 70%. Następnie należy wysuszyć urządzenia AXIS Axon Isolation Devices i szkiełka nakrywkowe całkowicie pod sterylnym kapturem przepływowym. Odczekaj co najmniej 3 godziny przed kontynuowaniem.
   UWAGA: niepełne suszenie spowoduje wadliwy montaż urządzeń mikroprzepływowych.
6. Umieść każde szkiełko nakrywkowe na szalce Petriego o średnicy 35 mm lub w studzience w 6-dołkowej płytce.
7. Umieść urządzenie AXIS Axon Isolation Device na szkiełku nakrywkowym i delikatnie, ale stanowczo dociśnij szczypcami z zagiętymi końcami, aby umożliwić pełne przyleganie między urządzeniem izolacyjnym a szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
8. W każdej komorze hodowlanej odpipetować 150 μl poli-D-lizyny (0,1 mg/ml w sterylnym, destylowanym_H2O). Umieść urządzenia mikroprzepływowe pod próżnią na 5 minut, aby usunąć całe powietrze z komór hodowlanych.
9. Jeśli w komorach nadal widać powietrze, należy ponownie odpipetować roztwór poli-D-lizyny do komór.
10. Inkubować urządzenia z poli-D-lizyną O/N w temperaturze 37 °C.
11. Przemyć komory trzykrotnie sterylnym, destylowanym_H2O.
12. Napełnić komory 150 μl roztworu roboczego lamininy (Sigma-Aldrich, 5 μg/ml, w pożywce PBS lub pożywce bez surowicy) i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
13. Przygotować 50 ml pożywki do hodowli zwojów nerwu trójdzielnego ³⁷ , w składzie: 48 ml pożywki neurobazalnej, 1 ml B-27, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 5 ng/ml czynnika wzrostu nerwów (NGF), 0,25 pM arabinozydu cytozyny.
14. Przygotować 50 ml pożywki do kultur zarodków zębów ³⁷, w składzie: 40 ml DMEM-F12, 10 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS, stężenie końcowe: 20%), 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 150 μg/ml kwasu askorbinowego.

2. Wytwarzanie i sekcja embrionów myszy

1. Określ wiek zarodka na podstawie czopa pochwowego (czop pochwowy: dzień rozwoju zarodka 0,5, E0,5) i potwierdź go za pomocą kryteriów morfologicznych. W tym protokole zazwyczaj używamy zarodków myszy E14.5-E17.5.
2. Oczyść obszar sekcji i stereoskop etanolem 70%.
3. Złożyć w ofierze ciężarną matkę przez zwichnięcie szyjki macicy. Zablokuj szyję myszy pierwszym i drugim palcem na siatce i zdecydowanie pociągnij ogon.
4. Wypreparuj skórę wokół dolnej części brzucha i otwórz brzuch za pomocą nożyczek. Zlokalizuj macicę: w tak późnych stadiach ciąży macica obficie wypełnia jamę brzuszną.
5. Wypreparuj macicę i umieść ją w probówce wypełnionej PBS na lodzie. Na lodzie tkankę można pozostawić na kilka godzin. Wyrzuć zwłoki matki zgodnie z wytycznymi instytucji
6. Wypreparuj zarodki z macicy i uwolnij je od tkanek pozazarodkowych. Umieścić zarodki w PBS na lodzie.
7. Odetnij głowę zarodkom za pomocą nożyczek i oddziel dolną szczękę od reszty głowy za pomocą nożyczek do mikropreparacji (ryc. 2A). Usuń dokładnie dolną szczękę, nie uszkadzając zwojów nerwu trójdzielnego; Ponieważ te ostatnie są zlokalizowane w bliskiej odległości od żuchwy, możliwe jest ich przypadkowe uszkodzenie. Zachowaj dolną szczękę i resztę głowy w zimnym PBS, na lodzie.
8. Aby wypreparować TG, weź głowę i umieść ją na szklanej szalce Petriego, uprzednio wypełnionej zimnym PBS. Za pomocą kleszczy usuń skórę i czaszkę. Następnie usuń kresomózgowie i móżdżek, umieszczając kleszcze poniżej kresomózgowia i podnieś; Kresomózgowie i móżdżek odwrócą się razem, pozostawiając odsłonięte dno czaszki.
9. Zlokalizuj zwoje nerwu trójdzielnego (pokazane na rysunku 2B). Użyj kleszczy, aby oddzielić TG od nerwów trójdzielnych. Wyeliminuj resztki wypustek nerwu trójdzielnego za pomocą igieł preparacyjnych jako noży. Umieść wypreparowane TG na szalce Petriego wypełnionej zimnym PBS i trzymaj je na lodzie.
10. Aby wypreparować zęby embrionalne, należy umieścić dolną szczękę, uprzednio oddzieloną od czaszki, na szklanej szalce Petriego, wypełnionej zimnym PBS. Używając igieł preparacyjnych jako noży, usuń język i skórę otaczającą szczękę. Oddziel lewą i prawą półszczękę, przecinając wzdłuż linii środkowej szczęki. Zarodki zębów są łatwo widoczne, jak pokazano na rysunku 1C. Odizoluj zarodki zębów za pomocą igieł preparacyjnych i usuń nadmiar tkanek niebędących zębami. Umieść wypreparowane zarodki zębów na szalce Petriego wypełnionej zimnym PBS i trzymaj je na lodzie.

3. Współkultury mikroprzepływowe

1. Po rozbiorze usuń lamininę z urządzeń mikroprzepływowych. Napełnij komory 200 μl odpowiedniego podłoża.
2. Za pomocą kleszczy delikatnie przenieś wypreparowany TG i zarodki zębów do otworów utworzonych przez dziurkowanie (ryc. 1D). Upewnij się, że zarodki zębów nie unoszą się na wodzie i toną, dopóki nie zetkną się ze szkiełkami nakrywkowymi.
3. Wyhodować próbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .}
4. Zmieniaj pożywkę co 48 godzin. Nie opróżniaj całkowicie komór i nie pipetuj bezpośrednio do komór hodowlanych. Całkowite opróżnienie komór spowodowałoby powstanie pęcherzyków powietrza w komorach; Bezpośrednie pipetowanie do komory spowodowałoby uszkodzenie aksonów. Aby uniknąć tych problemów, usuń pożywkę, kierując pipetę w stronę zewnętrznej strony studzienek; Podobnie, odpipetować świeżą pożywkę po stronie studzienek znajdujących się naprzeciwko komór.
5. W okresie hodowli kokultury można łatwo zobrazować za pomocą mikroskopii poklatkowej. Kokultury można utrzymywać przez ponad 10 dni.
6. Po okresie hodowli umyć komory, pipetując 150 μl PBS do jednego dołka na komorę i pozwalając PBS przepływać przez komory trzy razy.
7. Usunąć PBS i utrwalić próbki, pipetując 150 μl paraformaldehydu 4% (w PBS) w jednym dołku na komorę; inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
8. Przemyć komory dwukrotnie PBS, jak opisano w ppkt 3.6.
9. Kontynuuj dalszą analizę.

Wyniki

Wyniki te pokazują, że izolowane zwoje trójdzielne mogą rosnąć w jednej komorze urządzenia mikroprzepływowego i ponadto, że rozwój izolowanych zarodków zęba jest podtrzymywany przez długi czas w drugiej komorze urządzenia mikroprzepływowego. W dwóch komorach stosowane są różne pożywki hodowlane, a mikrowżobienia między nimi umożliwiają wzrost aksonów ze zwoju trójdzielnego w kierunku rozwijających się zarodków zębów. Rysunek 3 przedstawia wizualizację neurofilamentów za pomocą immunofluorescencji ^37...

Dyskusja

Dotychczasowe badania unerwienia zębów in vitro opierały się na konwencjonalnych kohodowlach zwojów nerwu trójdzielnego i tkanek lub komórek zęba ^26,28,29. Badania te przeprowadzono głównie w celu zbadania atrakcyjnego wpływu tych komórek lub tkanek na aksony czuciowe ³⁸. Chociaż przyniósł znaczny postęp w tej dziedzinie, poruszono kilka problemów technicznych. Zarodki zębów zaczynają się degenerować po kilku dniach posiewu ³⁷. Opierając się na tych obserwacjach, rosnące neurony ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Dostępne są mikrokanały o różnej długości
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Rekombinowana mysz beta-NGF	R& D Systems	1156-NG-100	Beta-NGF dla ludzi i szczurów (R& D Systems) są odpowiednikami
DMEM-F12	Gibco	11320-033