Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

Podsumowanie

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Streszczenie

Komunikacja międzykomórkowa jest integralną częścią złożonego systemu, który pomaga w utrzymaniu podstawowych aktywności komórkowych. W rezultacie nieprawidłowe działanie takiej sygnalizacji może prowadzić do wielu zaburzeń. Aby zrozumieć sygnalizację międzykomórkową, konieczne jest zbadanie przestrzennego i czasowego charakteru cząsteczek wydzielanych z komórki bez zakłócania lokalnego środowiska. Opracowano różne testy do badania wydzielania białek, jednak metody te są zwykle oparte na sondach fluorescencyjnych, które zakłócają odpowiednie szlaki sygnałowe. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, wymagana jest technika bez etykietowania.

W tym artykule opisujemy wytwarzanie i zastosowanie technologii LSPRi, zlokalizowanej powierzchniowo rezonansu plazmonowego, zdolnej do wykrywania wydzielin białkowych z pojedynczej komórki. Nanostruktury plazmoniczne są litograficznie wzorowane na standardowym szklanym szkiełku nakrywkowym i mogą być wzbudzane za pomocą światła widzialnego na dostępnych na rynku mikroskopach świetlnych. Tylko niewielka część szkiełka nakrywkowego jest pokryta nanostrukturami, dlatego technika ta dobrze nadaje się do łączenia popularnych technik, takich jak fluorescencja i obrazowanie w jasnym polu.

W tym protokole zastosowano podejście multidyscyplinarne, które obejmuje nanowytwarzanie czujników i późniejszą biofunkcjonalizację, kinetykę wiązania, charakterystykę liganda i analitu, integrację chipa i żywych komórek oraz analizę mierzonego sygnału. Ogólnie rzecz biorąc, technologia ta umożliwia ogólne, bezznacznikowe podejście do mapowania wydzielin komórkowych i korelowania ich z reakcjami pobliskich komórek.

Wprowadzenie

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla regulacji wielu czynności fizjologicznych, zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórki. Mogą być wydzielane różne białka i pęcherzyki, które następnie uruchamiają złożone procesy komórkowe, takie jak różnicowanie, gojenie się ran, odpowiedź immunologiczna, migracja i proliferacja. ^1-5 Nieprawidłowe działanie międzykomórkowych szlaków sygnałowych jest związane z wieloma zaburzeniami, w tym rakiem, miażdżycą i cukrzycą, by wymienić tylko kilka.

Optymalny test wydzielania komórek powinien być zdolny do przestrzennego i czasowego mapowania wydzielanego białka bez zakłócania odpowiednich szlaków sygnałowych. W ten sposób można wywnioskować związki przyczynowo-skutkowe między profilami stężeń a odpowiedzią komórek przyjmujących. Niestety, wiele z najczęściej stosowanych technik fluorescencyjnych nie spełnia tych kryteriów. Fluorescencyjne białka fuzyjne mogą być używane do znakowania analitu w komórce, ale mogą zakłócać szlak wydzielniczy lub, jeśli są wydzielane, powodują rozproszoną poświatę na zewnątrz komórki, która jest trudna do oszacowania. Fluorescencyjne testy immunologiczne oparte na kanapkach są najczęściej stosowanymi technikami wykrywania wydzielin komórkowych, ale zazwyczaj wymagają izolacji pojedynczych komórek. ^6-11 Ponadto wprowadzenie przeciwciała wykrywającego zazwyczaj zatrzymuje lub kończy eksperyment, a rozmiar znaczników przeciwciał, 150 kDa dla IgG, stanowi przeszkodę w dalszej sygnalizacji.

Z powodu tych przeszkód lepiej jest użyć techniki bezznacznikowej do obrazowania wydzielin białkowych, a wśród istniejących technologii bez znaczników, doskonałe są czujniki powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) i zlokalizowanego powierzchniowego rezonansu plazmonowego (LSPR). ^12-17 Czujniki te są szeroko stosowane do badań wiązania analitów białek, egzosomów i innych biomarkerów. ^18-24 W przypadku LSPR nanostruktury plazmoniczne mogą być litograficznie wzorowane na szklanych szkiełkach nakrywkowych i wzbudzane za pomocą światła widzialnego za pomocą standardowych konfiguracji mikroskopii szerokokątnej. Ze względu na ich ślad w nanoskali, większość szklanego podłoża jest dostępna dla popularnych technik obrazowania, takich jak mikroskopia jasnego pola i mikroskopia fluorescencyjna, dzięki czemu sondy te dobrze nadają się do integracji z mikroskopią żywych komórek. ^25-28 Pokazaliśmy pomiar w czasie rzeczywistym wydzielania przeciwciał z komórek hybrydoma przy użyciu funkcjonalizowanych złotych nanostruktur plazmonicznych o rozdzielczościach przestrzennych i czasowych odpowiednio 225 ms i 10 μm. Podstawowa konfiguracja układu scalonego jest zilustrowana na rysunku 1. ²⁸ Ścieżka światła wyjściowego mikroskopu jest podzielona między kamerę CCD używaną do obrazowania i spektrometr sprzężony optycznie ze światłowodem do ilościowego określania ułamkowego zajętości danego układu nanostruktur (rysunek 2).

Protokół przedstawiony w tym artykule opisuje eksperymentalny projekt pomiaru w czasie rzeczywistym wydzielin pojedynczych komórek, jednocześnie monitorując reakcję komórek za pomocą standardowej mikroskopii jasnego pola. Multidyscyplinarne podejście obejmuje wytwarzanie nanostruktur, funkcjonalizację nanostruktur w celu wiązania analitów o wysokim powinowactwie, optymalizację powierzchni zarówno pod kątem minimalizacji niespecyficznego wiązania, jak i charakteryzowania stałych szybkości kinetycznej przy użyciu komercyjnego instrumentu do powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR), integrację linii komórkowych z podłożem oraz analizę obrazów i danych spektralnych. Przewidujemy, że technika ta stanie się technologią umożliwiającą czasoprzestrzenne mapowanie wydzielin komórkowych i ich związków przyczynowych z komórkami odbiorczymi.

Protokół

1. Wytwarzanie nanostruktur

1. Jako podłoża do nanowytwarzania należy wybrać szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm i przybliżonej grubości 170 μm (nr 1,5).
2. Zanurzyć szkiełka nakrywkowe w roztworze piranii (kwas siarkowy i nadtlenek wodoru w stosunku 3:1) na co najmniej 6 godzin. Umyć szkiełko nakrywkowe nasączone piranią dużą ilością ultraczystej dejonizowanej wody destylowanej (DDW) o mocy 18,2 MΩ.
   UWAGA: Kwas piranii reaguje gwałtownie z materiałami organicznymi i należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością.
3. Osadzanie cienkiej warstwy chromu o długości fali 10 nm na szkiełkach nakrywkowych poprzez odparowanie wiązką elektronów, aby uniknąć efektów ładunku podczas modelowania i obrazowania nanostruktur.
4. Wirować pierwszą warstwę dwuwarstwowego rezystu składającego się z kopolimeru mleczanu etylu i metakrylanu metylu (MMA_EL6) z prędkością 2 000 obr./min przez 45 sekund, a następnie piec w temperaturze 150 °C. Wirować drugą warstwę polimetakrylanu metylu (950PMMA_A2) przy 3 000 obr./min przez 45 sekund, a następnie piec w temperaturze 180 °C.
5. Wzór rezystu dwuwarstwowego za pomocą litografii wiązką elektronów (EBL) przy napięciu 25 kV przy dawce powierzchniowej 300 μC/^cm2. Wywołać w alkoholu izopropylowym (IPA)/ketonie metylowo-izobutylowym (MIBK): 2/1 i przepłukać w IPA.
6. Nałożenie folii Ti (5 nm) / Au (80 nm) na podłoże za pomocą parownika z wiązką elektromagnetyczną.
7. Po osadzeniu złota zdejmij dwuwarstwę kopolimeru, mocząc podłoże w acetonie przez 4 godziny.
8. Sprawdź podłoże za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM), aby potwierdzić kształt i rozmiar nanostruktury, usuń pozostały chrom z podłoża za pomocą mokrego wytrawiania za pomocą wytrawiacza CR-7 przez 60 sekund w temperaturze pokojowej, a następnie spłucz w DDW.
9. Zaprojektuj odstępy między środkami macierzy wynoszące 33 μm, aby pozostawić miejsce na obrazowanie komórek między macierzami. Ułóż nanostruktury w formacie 20 x 20 dla każdej matrycy o rozstawie 300 nm za pomocą czytnika e-beam. Każdy chip zawiera 300 matryc o typowym wymiarze nanostruktury o wysokości 80±2,5 nm i średnicy 70±2,5 nm.
10. Zbadaj podzbiór macierzy za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) w celu sprawdzenia rozmiaru i jednorodności.
11. Przymocuj pierścień nośny, zwykle silikonowy, z tyłu szkiełka nakrywkowego za pomocą żywicy epoksydowej utwardzanej promieniami UV.

2. Czyszczenie wiórów i zastosowanie samodzielnie zmontowanej warstwy

1. Do czyszczenia i regeneracji zrębków popiół plazmowy o mocy 40 W w mieszaninie 300 mTorr 5% wodoru, 95% argonu przez 45 sekund po czyszczeniu komory przez 5 min w tych samych warunkach.
2. Funkcjonalizować nanostruktury złota natychmiast po spopieleniu plazmowym poprzez zanurzenie chipa w dwuskładnikowym etanolowym roztworze tiolowym składającym się ze stosunku 3:1 SH-(CH₂)_{8-EG 3-OH} (SPO) i składnika z aminową lub karboksylową grupą funkcyjną, a mianowicie SH-(CH₂)_{11-EG 3-NH 2} (SPN) lub SH-(CH₂)_{11-EG 3-COOH} (SPC).
3. Pozostaw chip w roztworze tiolu O/N, aby utworzyć samoorganizującą się monowarstwę (SAM).
4. Opłucz chip etanolem i osusz gazowym azotem.
5. W razie potrzeby należy przechowywać sfunkcjonalizowany chip do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.
6. Gdy składnik SPN lub SPC jest gotowy do użycia, należy reagować z ligandem, stosując skład chemiczny w zależności od wybranego liganda (patrz poniżej).
   Uwaga: Chipy mogą być regenerowane i ponownie funkcjonalizowane dziesiątki razy. Dany chip może być używany przez okresy od 6 miesięcy do ponad roku. Widma mierzone na danej matrycy są niezawodnie odtwarzane po wielokrotnych regeneracjach przez spopielanie plazmowe, a następnie biofunkcjonalizacji. ²⁹

3. Funkcjonalizacja powierzchni i charakterystyka kinetyczna

Uwaga: Użyj funkcjonalizowanego chipa w komercyjnym instrumencie SPR, aby scharakteryzować kinetyczne stałe szybkości między ligandem a analitem, a także do zbadania odporności SAM na niespecyficzne wiązanie. Istnieje szeroki zakres natężeń przepływu i konstrukcji mikroprzepływowych, które pozwalają na wydajną funkcjonalizację powierzchni. Ponieważ dysponujemy dostępnym na rynku SPR, ustandaryzowaliśmy się wokół zalecanych natężeń przepływu. Zwracamy uwagę, że te natężenia przepływu są typowe dla wszystkich instrumentów SPR, a więc nie są restrykcyjne. Instrument SPR nie jest koniecznością, ponieważ cała funkcjonalizacja może być wykonana bezpośrednio na chipie LSPR, ale zmniejszył nasze obciążenie pracą, ponieważ jest to instrument multipleksowany, podczas gdy nasza konfiguracja mikroprzepływowa LSPR nie jest.

1. Funkcjonalizuj komercyjny chip z gołego złota za pomocą SAM zgodnie z opisem w sekcji 2.
2. W przypadku stosowania SAM na bazie SPC, aktywować grupę karboksylową mieszaniną 1:1 133 mM 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i 33 mM N-hydroksysukcynimidu (NHS) w DDW przez 10 minut.
3. Sprzęż aktywowaną grupę karboksylową z badanym przeciwciałem/ligandem przez 300 sekund przy natężeniu przepływu 30 μl/min. Zazwyczaj przygotuj ligandy w buforze fosforanowym o pH 6, ale może się to różnić w zależności od cząsteczki.
4. Po koniugacji liganda przepływać 0,1 M etanoloaminy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako etap dezaktywatora przez 300 sekund z szybkością 30 μl/min. Etanoloamina pomaga w zminimalizowaniu niespecyficznego wiązania.
5. Wprowadzić badany analit przy natężeniu przepływu 100 μl/min przy użyciu różnych stężeń i obliczyć stałe szybkości kinetycznej za pomocą oprogramowania do analizy kinetycznej.
6. Jeśli niespecyficzne wiązanie jest problematyczne, zwiększ stosunek SPO do SPC lub SPN.

4. Ustawienia ogólne LSPR

1. Ustawienia mikroskopu:
   1. Użyj lampy halogenowej o mocy 100 W, aby oświetlić próbkę firmy Koehler. Użyj filtra długoprzepustowego (zwykle odcięcia 593 nm) na ścieżce światła, aby wyeliminować długości fal, które nie przyczyniają się do przesunięcia rezonansu (ilustracja 2).
   2. Do zbierania danych LSPRi należy użyć mikroskopu odwróconego z obiektywem zanurzeniowym z olejkiem 40X (1,4 NA) i chłodzoną termoelektrycznie 16-bitową kamerą CCD.
   3. Umieść rozdzielacz wiązki w porcie wyjściowym mikroskopu, aby jednocześnie uzyskać obrazy i widma.
   4. Ustawić stolik mikroskopu z kontrolowaną temperaturą na 37 °C i równoważyć przez 4 godziny.
   5. Dołącz dodatkowy zestaw inkubacyjny do mikroskopu, aby regulować stężenie CO₂ i wilgotność odpowiednio na poziomie 5% i 95%.
2. Przygotowanie i montaż wiórów:
   1. Funkcjonalizować układ LSPR zgodnie z opisem w sekcji 2 z optymalnymi dwuskładnikowymi współczynnikami SAM określonymi na podstawie eksperymentów SPR.
   2. Załaduj chip do specjalnie wykonanego uchwytu mikroprzepływowego w następujący sposób. Umieść żeton na aluminiowym dnie. Umieść chip między tą dolną częścią a silikonową uszczelką i przezroczystą plastikową górną częścią. Użyj 4, aby clamp zespół.
   3. W przypadku typowej aplikacji tiolu na bazie SPC, nałóż kroplą 300 μl mieszaniny 1:1 133 mM EDC i 33 mM NHS w DDW, aby aktywować grupy karboksylowe składnika tiolowego SPC.
   4. Odczekaj 10 minut i ręcznie spłucz powierzchnię 10 mM PBS.
   5. Sprzęgnąć aktywowaną grupę karboksylową z ligandem (zwykle przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała) będącym przedmiotem zainteresowania, pokrywając kroplami 300 μl roztworu liganda.
   6. Odczekaj 30 minut i ręcznie spłucz 10 mM PBS.
   7. Ułóż 300 μl 0,1 M etanoloaminy w PBS na chipie, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie. Odczekaj 10 min.
   8. Przemyć etanoloaminę PBS zawierającym 0,005% Tween 20 (PBS-T20).
   9. Umieść kawałek kwarcu nad chipem, aby zmniejszyć wahania danych związanych ze zmieniającą się łąkotką.
   10. Utrzymuj chip mokry za pomocą bufora PBS-T20 podczas montażu na mikroskopie.
   11. Umieść zespół chipa LSPR w podgrzewanym stage sample holder i podłącz rurkę mikroprzepływową.
   12. Podłącz rurki mikroprzepływowe do zespołu i bufora przepływowego (lub pożywki wolnej od surowicy do badań komórkowych) aż do osiągnięcia stanu ustalonego.
   13. Pozwól, aby zespół i mikroskop osiągnęły równowagę przez co najmniej 2 godziny.
   14. Ustaw układ za pomocą joysticka tak, aby centralny układ był wyrównany ze światłowodem do spektroskopii. Dane spektroskopowe są pobierane za pomocą spektrometru i oprogramowania do analizy spektralnej.
   15. Utrzymuj ostrość matryc przez cały czas trwania eksperymentu, korzystając z programowego autofokusa, Zeiss Definite Focus lub równoważnego urządzenia z autofokusem.

5. Obrazowanie LSPR wydzielin anty-c-myc z komórek hybrydoma 9E10

Uwaga: Linia komórkowa hybrydoma użyta do tego badania wyraża przeciwciało anty-c-myc konstytutywnie i dlatego nie wymaga chemicznego wyzwalacza

1. Funkcjonalizuj nanostruktury za pomocą peptydu c-myc. Ma to wartość K_D wynoszącą 1,77 nM dla przeciwciał anty-c-myc wydzielanych przez klonowane komórki hybrydoma 9E10.
2. Hodować komórki hybrydoma w kompletnej pożywce wzrostowej z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% antybiotykiem w kolbie T75 w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO₂ . Utrzymuj gęstość komórek 4 ×10⁵ komórek/ml.
3. Do badań wydzielania komórek, komórki osadkowe z kolby T75 przez odwirowanie, przemyć dwukrotnie pożywką wolną od surowicy RPMI-1640 (SFM) w celu usunięcia wydzielanych przeciwciał i dostosować gęstość komórek do 4 ×10⁶ komórek/ml.
4. Zbierz komórki i przetestuj ich żywotność przed wprowadzeniem ich do chipów LSPR.
5. Wprowadzić 50 μl roztworu komórkowego ręcznie na chipy LSPR za pomocą mikropipety. Po kilku minutach od 25 do 50 komórek przylega do powierzchni chipów LSPR.
6. Zmyj pozostałe komórki w roztworze świeżym SFM za pomocą systemu perfuzji mikroprzepływowej.
7. Do obrazowania należy wybrać matryce LSPR, które znajdują się blisko siebie, w granicach 10 μm, ale nie nakładają się na komórki.
8. Aby upewnić się, że sygnał jest specyficzny dla wydzielanych przeciwciał anty-c-myc, należy wprowadzić pożywkę do hodowli komórkowej z obecnymi przeciwciałami i bez nich, jak również z przeciwciałami, ale z miejscami wiązania zablokowanymi przez obecność nasyconego stężenia peptydu c-myc w roztworze.
9. Skalibrować czujniki na końcu każdego cyklu roztworem nasycającym przeciwciała anty-c-myc (250 nM). Pomaga to w normalizacji odpowiedzi czujników i określeniu ułamkowego zajętości na podstawie profilu biofunkcjonalizacji każdego biegu.
10. Skoryguj dryft w kierunku X i Y za pomocą oprogramowania do wyrównywania obrazu.

Wyniki

W typowym badaniu wydzielania żywych komórek odbywa się wiele sposobów zbierania danych. Rysunek 3 przedstawia nakładkę obrazu LSPRi, który podkreśla kwadratowe tablice, oraz obrazu oświetlonego światłem przechodzącym, który podkreśla komórkę w lewym dolnym rogu. Dane są zwykle zbierane przez okres 3 godzin, po których wprowadza się nasycony roztwór analitu do obliczenia normalizacji opisanego poniżej. Obrazowanie fluorescencyjne można również zintegrować z procedurą gromadzenia danych poprzez automatyczne przełączanie kostki filtra. Na rycinie 4 komórka wybarwiona barwnikiem błony fluorescencyjnej rodaminą DHPE wykazuje przedłużenia podobne do lamellipodiów (strzałki). Jeśli takie rozszerzenia nakładałyby się na matryce, dałyby fałszywie dodatni wynik wydzielania białka. Posiadanie wielu trybów obrazowania może pomóc w identyfikacji takich zdarzeń.

Rysunek 5 pokazuje dane spektrometryczne przed i po wprowadzeniu roztworu nasycającego (400 nM) komercyjnie zakupionych przeciwciał anty-c-myc do funkcjonalizowanych macierzy c-myc. W tym eksperymencie nie było żadnych komórek. Widmo wykazuje zarówno przesunięcie ku czerwieni, jak i wzrost intensywności. Różnica między obszarami pod dwiema krzywymi powoduje wzrost intensywności obrazu matrycowego w trybie LSPRi w kamerze CCD. Opracowano nieliniową metodę analizy danych metodą najmniejszych kwadratów w celu wywnioskowania ułamkowego zajmowania ligandów związanych z powierzchnią na podstawie widm. ^30,31

Na końcu eksperymentu, wartości intensywności nasycenia (tj. ułamkowe obłożenie ≈ 1) są używane do obliczenia znormalizowanej odpowiedzi dla każdej tablicy przy użyciu następującego wzoru:

Gdzie są odpowiednio znormalizowane natężenie w punkcie czasowym t, początkowe natężenie na początku eksperymentu, końcowe nasycenie intensywności i zmierzona intensywność tablicy w punkcie czasowym t.

Znormalizowane wartości z dwóch tablic są pokazane na rysunku 6. Jedna matryca znajdowała się w odległości nie większej niż 10 μm od badanej komórki, podczas gdy druga, używana jako kontrola, znajdowała się w odległości 130 μm od komórki. Nagły wzrost znormalizowanej odpowiedzi macierzy znajdującej się najbliżej komórki w stosunku do płaskiej odpowiedzi macierzy kontrolnej wskazuje na zlokalizowany wybuch wydzielanych przeciwciał.

Rysunek 1. Konstrukcja czujnika. Rysunek przedstawiający geometrię typowego eksperymentu z wydzielaniem żywych komórek. Komórka (niebieska sferoida) jest osadzana na chipie LSPR, który zawiera szereg biofunkcjonalizowanych nanostruktur złota. W powiększonym widoku mierzy się wydzielanie komórek będących przedmiotem zainteresowania, w tym przypadku przeciwciał pokazanych jako cząsteczki w kształcie litery Y, gdy wiążą się one z powierzchnią funkcjonalizowanych nanostruktur. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Konfiguracja optyczna. Oświetlone światło z lampy halogenowej jest najpierw filtrowane przez filtr długoprzepustowy (LP). Światło jest spolaryzowane liniowo (P1) i oświetla próbkę za pomocą obiektywu 40X/1,4 NA. Rozproszone światło jest zbierane przez obiektyw i przepuszczane przez skrzyżowany polaryzator (P2). Rozdzielacz wiązki 50/50 (BS) jest umieszczany w zebranej ścieżce światła w celu jednoczesnej analizy spektroskopowej i obrazowej. U góry po prawej: Obraz z mikroskopii sił atomowych 9 pojedynczych nanostruktur oddzielonych podziałką 300 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Badanie LSPRi na żywych komórkach. Połączony obraz w świetle przechodzącym i LSPRi przedstawiający pojedynczą komórkę hybrydomy (na dole po lewej) otoczoną przez 12 matryc. Jest to obraz o zwiększonym kontraście. Podziałka wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Badanie fluorescencji żywych komórek. Fluorescencyjny obraz w sztucznych kolorach pojedynczej komórki hybrydoma wybarwionej rodaminą DHPE, która jest barwnikiem błonowym. W trybie obrazowania fluorescencyjnego matryce nie są ogólnie widoczne, jednak pobliska sieć jest tutaj widoczna jako kwadrat w prawym dolnym rogu. Można zauważyć, że komórka jest oddzielona od tablicy, chociaż rozszerzenia przypominające macki (prawdopodobnie filopodia lub lamellipodia) rozciągają się na zewnątrz komórek (strzałki). Podziałka skali wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Modalność spektralna. Widma uzyskane z funkcjonalizowanej macierzy c-myc przed i po wprowadzeniu 400 nM roztworu przeciwciał anty-c-myc. W tym badaniu nie stwierdzono obecności żadnych komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Wydzielanie pojedynczej komórki. Odpowiedź tablicy znajdującej się w odległości 15 μm od pojedynczej komórki i znajdującej się w odległości 130 μm (kontrola). Podziałka wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Technika obrazowania LSPR opisana w tej pracy ma wiele zalet w porównaniu z bardziej tradycyjnymi metodologiami wykrywania wydzielin komórkowych. Po pierwsze, rozdzielczość czasowa naszej techniki jest rzędu sekund, podczas gdy komercyjna alternatywa, test immunologiczny znany jako EliSpot, ma typową rozdzielczość czasową od 2 do 3 dni. ^7,32 W rezultacie byliśmy w stanie rozwiązać nagłe zmiany w tempie wydzielania białka, takie jak te pokazane na rycinie 6. Po drugie, rozmieszczenie macierzy w chipie pozwala na śledzenie wydzielanego sygnału w przestrzeni i czasie, co umożliwia bardziej rygorystyczne porównania z modelami wydzielania komórek opartymi na dyfuzji. Ponadto tablice, takie jak tablica kontrolna pokazana na rysunku 6 , mogą być używane do odejmowania globalnych zmian w obrazie, które zwykle wynikają z czynników instrumentalnych, takich jak dryf ostrości. Po trzecie, nasza technika nie wymaga modyfikacji komórek. W razie potrzeby eksperyment może zawierać powszechnie używane znaczniki, takie jak białka fluorescencyjne, ale jeśli istnieje obawa, że takie znaczniki mogą negatywnie wpływać na żywotność komórek lub homeostazę, bezznacznikowy charakter naszego podejścia ich nie wymaga. Po czwarte, korzystając z danych spektroskopowych, wykazaliśmy, że można obliczyć informacje ilościowe dotyczące frakcyjnego zajmowania ligandów związanych z powierzchnią.

Istnieje wiele alternatywnych metod wytwarzania nanocząstek metalicznych dla EBL. Odkryliśmy jednak, że EBL zapewnia znaczną elastyczność w optymalizacji nanostruktury i wymiarów matrycy, aby jak najlepiej dopasować się do optyki i badanych komórek. Niezwykle ważny jest również fakt, że wióry można łatwo zregenerować poprzez spopielanie plazmowe. W ten sposób typowy chip może być używany dziesiątki razy. Szczegóły biofunkcjonalizacji muszą zostać zmodyfikowane pod kątem konkretnego zastosowania. Przedstawiony tutaj protokół sprzężał powierzchnię ze stosunkowo małymi ligandami peptydu c-myc. Większe ligandy, takie jak całe przeciwciała, zazwyczaj wymagają większych odstępów, a tym samym wyższego stosunku SPO do SPN/SPC. Niezależnie od tego, dobrze uformowana warstwa SAM jest niezbędna do zapobiegania niespecyficznemu wiązaniu w eksperymentach z żywymi komórkami. Ogólnie rzecz biorąc, anality o większej masie cząsteczkowej są łatwiej wykrywane przez LSPR. Tak więc, w postaci pojedynczej komórki, technika ta może nie być odpowiednia do wykrywania wydzielania małych białek, takich jak cytokiny.

Obecna konfiguracja została wykorzystana do badania pojedynczych komórek nieprzylegających. Istnieje znaczna liczba wydzielanych białek sygnałowych i pęcherzyków, do których wyniki przedstawione w tej pracy mają bezpośrednie zastosowanie. Na przykład antygen rakowo-embrionalny (CEA), który od dziesięcioleci jest markerem diagnostycznym raka. Wiadomo, że komórki raka jelita grubego wydzielają CEA w tempie tysięcy cząsteczek / komórkę / godzinę, a masa cząsteczkowa wynosi 180 kDa, co przekracza masę przeciwciał IgG. Uważa się, że CEA jest zaangażowane w autokrynne i parakrynne szlaki sygnałowe, ale czasoprzestrzenny charakter tych wydzielin nigdy nie został zmierzony. Nasza technika może bezpośrednio odpowiedzieć na te pytania sygnalizacyjne. Rozszerzeniem tych prac będzie pomiar czasoprzestrzennego charakteru wydzielania CEA z pojedynczych komórek. ³³ Przyszłe prace będą również koncentrować się na integracji LSPRi z dwu- i trójwymiarowymi hodowlami komórkowymi komórek przylegających. Dzięki zastosowaniu multipleksowanych macierzy zdolnych do równoległego wykrywania wielu wydzielanych białek, technika ta może otworzyć nowe okno na wydzieliny komórkowe i ich wpływ na sąsiednie komórki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
25  mm średnica szklane szkiełka nakrywkowe Bioscience	Tools	CSHP-No1.5-25	170± 5 & mikro; m jest optymalny
Polimetakrylan metylu	Microchem	PMMA 950 A4
Mleczan etylu Metakrylan metylu	Microchem	MMA EL6
Parownik wiązki elektronów	Temescal	FC-2000
Litografia wiązką elektronów	Raith	Series 150
Etanol	Sigma-Aldrich	459836
Aceton	Sigma-Aldrich	320110
CR-7 wytrawiacz chromowy	Cyantek	CR-7
Skaningowy mikroskop elektronowy	Zeiss	Ultra 55
Mikroskop sił atomowych	Veeco	Nanoscope III
System spopielania plazmowego	Technics	Series 85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)	Prochimia	TH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)	Prochimia	TH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)	Prochimia	TH 002-m11.n3-0.2
rezonansu plazmonowego	Biorad	XPR36
Chip z gołego złota	Chip Biorad	GLC	Plazma spoinowana w celu usunięcia monowarstwy
1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu	Thermo	22980
N-hydroksysukcynimid (NHS)	Thermo	24510
Pentyloamina-Biotyna	Thermo	21345
Etanoloamina	Sigma-Aldrich	E9508
Neutraawidyna	Thermo	31000
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Thermo	28374
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287
Mikroskop odwrócony	Zeiss	Axio Observer	Mikroskop jest wyposażony w obiektyw zanurzeniowy z olejkiem 40X; Inkubacja CO2 i wilgotności od Pecon GmbH
Kamera CCD	Hamamatsu	Orca R2	Chłodzony termoelektrycznie (16 bitów)
spektrometr	Ocean Optics	QE65Pro
Spectrasuite	Ocean Optics	wersja1.4
peptyd c-myc HyNic Tag	Solulink	SP-E003
monoklonalne przeciwciało	anty-c-mycSigma-Aldrich	M4439
Hybridoma linia komórkowa	ATCC	CRL-1729
Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy (100 razy;)	Sigma-Aldrich	A5955
Pożywka wolna od surowicy RPMI 1640	Invitrogen	Numer katalogowy: 11835-030
Płodowa surowica bydlęca	ATCC	30-2020
Rodamina DHPE	Life Technologies	L-1392