Artykuł metodologiczny

Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53120

⸱

23 listopada 2015

 ,  ,  ,  , 
1Materials Science and Technology, Naval Research Laboratory, 2Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Streszczenie

Komunikacja międzykomórkowa jest integralną częścią złożonego systemu, który pomaga w utrzymaniu podstawowych aktywności komórkowych. W rezultacie nieprawidłowe działanie takiej sygnalizacji może prowadzić do wielu zaburzeń. Aby zrozumieć sygnalizację międzykomórkową, konieczne jest zbadanie przestrzennego i czasowego charakteru cząsteczek wydzielanych z komórki bez zakłócania lokalnego środowiska. Opracowano różne testy do badania wydzielania białek, jednak metody te są zwykle oparte na sondach fluorescencyjnych, które zakłócają odpowiednie szlaki sygnałowe. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, wymagana jest technika bez etykietowania.

W tym artykule opisujemy wytwarzanie i zastosowanie technologii LSPRi, zlokalizowanej powierzchniowo rezonansu plazmonowego, zdolnej do wykrywania wydzielin białkowych z pojedynczej komórki. Nanostruktury plazmoniczne są litograficznie wzorowane na standardowym szklanym szkiełku nakrywkowym i mogą być wzbudzane za pomocą światła widzialnego na dostępnych na rynku mikroskopach świetlnych. Tylko niewielka część szkiełka nakrywkowego jest pokryta nanostrukturami, dlatego technika ta dobrze nadaje się do łączenia popularnych technik, takich jak fluorescencja i obrazowanie w jasnym polu.

W tym protokole zastosowano podejście multidyscyplinarne, które obejmuje nanowytwarzanie czujników i późniejszą biofunkcjonalizację, kinetykę wiązania, charakterystykę liganda i analitu, integrację chipa i żywych komórek oraz analizę mierzonego sygnału. Ogólnie rzecz biorąc, technologia ta umożliwia ogólne, bezznacznikowe podejście do mapowania wydzielin komórkowych i korelowania ich z reakcjami pobliskich komórek.

Wprowadzenie

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla regulacji wielu czynności fizjologicznych, zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórki. Mogą być wydzielane różne białka i pęcherzyki, które następnie uruchamiają złożone procesy komórkowe, takie jak różnicowanie, gojenie się ran, odpowiedź immunologiczna, migracja i proliferacja. 1-5 Nieprawidłowe działanie międzykomórkowych szlaków sygnałowych jest związane z wieloma zaburzeniami, w tym rakiem, miażdżycą i cukrzycą, by wymienić tylko kilka.

Optymalny test wydzielania komórek powinien być zdolny do przestrzennego i czasowego mapowania wydzielanego białka bez zakłócania odpowiednich szlaków sygnałowych. W ten sposób można wywnioskować związki przyczynowo-skutkowe między profilami stężeń a odpowiedzią komórek przyjmujących. Niestety, wiele z najczęściej stosowanych technik fluorescencyjnych nie spełnia tych kryteriów. Fluorescencyjne białka fuzyjne mogą być używane do znakowania analitu w komórce, ale mogą zakłócać szlak wydzielniczy lub, jeśli są wydzielane, powodują rozproszoną poświatę na zewnątrz komórki, która jest trudna do oszacowania. Fluorescencyjne testy immunologiczne oparte na kanapkach są najczęściej stosowanymi technikami wykrywania wydzielin komórkowych, ale zazwyczaj wymagają izolacji pojedynczych komórek. 6-11 Ponadto wprowadzenie przeciwciała wykrywającego zazwyczaj zatrzymuje lub kończy eksperyment, a rozmiar znaczników przeciwciał, 150 kDa dla IgG, stanowi przeszkodę w dalszej sygnalizacji.

Z powodu tych przeszkód lepiej jest użyć techniki bezznacznikowej do obrazowania wydzielin białkowych, a wśród istniejących technologii bez znaczników, doskonałe są czujniki powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) i zlokalizowanego powierzchniowego rezonansu plazmonowego (LSPR). 12-17 Czujniki te są szeroko stosowane do badań wiązania analitów białek, egzosomów i innych biomarkerów. 18-24 W przypadku LSPR nanostruktury plazmoniczne mogą być litograficznie wzorowane na szklanych szkiełkach nakrywkowych i wzbudzane za pomocą światła widzialnego za pomocą standardowych konfiguracji mikroskopii szerokokątnej. Ze względu na ich ślad w nanoskali, większość szklanego podłoża jest dostępna dla popularnych technik obrazowania, takich jak mikroskopia jasnego pola i mikroskopia fluorescencyjna, dzięki czemu sondy te dobrze nadają się do integracji z mikroskopią żywych komórek. 25-28 Pokazaliśmy pomiar w czasie rzeczywistym wydzielania przeciwciał z komórek hybrydoma przy użyciu funkcjonalizowanych złotych nanostruktur plazmonicznych o rozdzielczościach przestrzennych i czasowych odpowiednio 225 ms i 10 μm. Podstawowa konfiguracja układu scalonego jest zilustrowana na rysunku 1. 28 Ścieżka światła wyjściowego mikroskopu jest podzielona między kamerę CCD używaną do obrazowania i spektrometr sprzężony optycznie ze światłowodem do ilościowego określania ułamkowego zajętości danego układu nanostruktur (rysunek 2).

Protokół przedstawiony w tym artykule opisuje eksperymentalny projekt pomiaru w czasie rzeczywistym wydzielin pojedynczych komórek, jednocześnie monitorując reakcję komórek za pomocą standardowej mikroskopii jasnego pola. Multidyscyplinarne podejście obejmuje wytwarzanie nanostruktur, funkcjonalizację nanostruktur w celu wiązania analitów o wysokim powinowactwie, optymalizację powierzchni zarówno pod kątem minimalizacji niespecyficznego wiązania, jak i charakteryzowania stałych szybkości kinetycznej przy użyciu komercyjnego instrumentu do powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR), integrację linii komórkowych z podłożem oraz analizę obrazów i danych spektralnych. Przewidujemy, że technika ta stanie się technologią umożliwiającą czasoprzestrzenne mapowanie wydzielin komórkowych i ich związków przyczynowych z komórkami odbiorczymi.

Protokół

1. Wytwarzanie nanostruktur

  1. Jako podłoża do nanowytwarzania należy wybrać szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm i przybliżonej grubości 170 μm (nr 1,5).
  2. Zanurzyć szkiełka nakrywkowe w roztworze piranii (kwas siarkowy i nadtlenek wodoru w stosunku 3:1) na co najmniej 6 godzin. Umyć szkiełko nakrywkowe nasączone piranią dużą ilością ultraczystej dejonizowanej wody destylowanej (DDW) o mocy 18,2 MΩ.
    UWAGA: Kwas piranii reaguje gwałtownie z materiałami organicznymi i należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością.
  3. Osadzanie cienkiej warstwy chromu o długości fali 10 nm na szkiełkach nakrywkowych poprzez odparowanie wiązką elektronów, aby uniknąć efektów ładunku podczas modelowania i obrazowania nanostruktur.
  4. Wirować pierwszą warstwę dwuwarstwowego rezystu składającego się z kopolimeru mleczanu etylu i metakrylanu metylu (MMA_EL6) z prędkością 2 000 obr./min przez 45 sekund, a następnie piec w temperaturze 150 °C. Wirować drugą warstwę polimetakrylanu metylu (950PMMA_A2) przy 3 000 obr./min przez 45 sekund, a następnie piec w temperaturze 180 °C.
  5. Wzór rezystu dwuwarstwowego za pomocą litografii wiązką elektronów (EBL) przy napięciu 25 kV przy dawce powierzchniowej 300 μC/cm2. Wywołać w alkoholu izopropylowym (IPA)/ketonie metylowo-izobutylowym (MIBK): 2/1 i przepłukać w IPA.
  6. Nałożenie folii Ti (5 nm) / Au (80 nm) na podłoże za pomocą parownika z wiązką elektromagnetyczną.
  7. Po osadzeniu złota zdejmij dwuwarstwę kopolimeru, mocząc podłoże w acetonie przez 4 godziny.
  8. Sprawdź podłoże za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM), aby potwierdzić kształt i rozmiar nanostruktury, usuń pozostały chrom z podłoża za pomocą mokrego wytrawiania za pomocą wytrawiacza CR-7 przez 60 sekund w temperaturze pokojowej, a następnie spłucz w DDW.
  9. Zaprojektuj odstępy między środkami macierzy wynoszące 33 μm, aby pozostawić miejsce na obrazowanie komórek między macierzami. Ułóż nanostruktury w formacie 20 x 20 dla każdej matrycy o rozstawie 300 nm za pomocą czytnika e-beam. Każdy chip zawiera 300 matryc o typowym wymiarze nanostruktury o wysokości 80±2,5 nm i średnicy 70±2,5 nm.
  10. Zbadaj podzbiór macierzy za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) w celu sprawdzenia rozmiaru i jednorodności.
  11. Przymocuj pierścień nośny, zwykle silikonowy, z tyłu szkiełka nakrywkowego za pomocą żywicy epoksydowej utwardzanej promieniami UV.

2. Czyszczenie wiórów i zastosowanie samodzielnie zmontowanej warstwy

  1. Do czyszczenia i regeneracji zrębków popiół plazmowy o mocy 40 W w mieszaninie 300 mTorr 5% wodoru, 95% argonu przez 45 sekund po czyszczeniu komory przez 5 min w tych samych warunkach.
  2. Funkcjonalizować nanostruktury złota natychmiast po spopieleniu plazmowym poprzez zanurzenie chipa w dwuskładnikowym etanolowym roztworze tiolowym składającym się ze stosunku 3:1 SH-(CH2)8-EG 3-OH (SPO) i składnika z aminową lub karboksylową grupą funkcyjną, a mianowicie SH-(CH2)11-EG 3-NH 2 (SPN) lub SH-(CH2)11-EG 3-COOH (SPC).
  3. Pozostaw chip w roztworze tiolu O/N, aby utworzyć samoorganizującą się monowarstwę (SAM).
  4. Opłucz chip etanolem i osusz gazowym azotem.
  5. W razie potrzeby należy przechowywać sfunkcjonalizowany chip do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.
  6. Gdy składnik SPN lub SPC jest gotowy do użycia, należy reagować z ligandem, stosując skład chemiczny w zależności od wybranego liganda (patrz poniżej).
    Uwaga: Chipy mogą być regenerowane i ponownie funkcjonalizowane dziesiątki razy. Dany chip może być używany przez okresy od 6 miesięcy do ponad roku. Widma mierzone na danej matrycy są niezawodnie odtwarzane po wielokrotnych regeneracjach przez spopielanie plazmowe, a następnie biofunkcjonalizacji. 29

3. Funkcjonalizacja powierzchni i charakterystyka kinetyczna

Uwaga: Użyj funkcjonalizowanego chipa w komercyjnym instrumencie SPR, aby scharakteryzować kinetyczne stałe szybkości między ligandem a analitem, a także do zbadania odporności SAM na niespecyficzne wiązanie. Istnieje szeroki zakres natężeń przepływu i konstrukcji mikroprzepływowych, które pozwalają na wydajną funkcjonalizację powierzchni. Ponieważ dysponujemy dostępnym na rynku SPR, ustandaryzowaliśmy się wokół zalecanych natężeń przepływu. Zwracamy uwagę, że te natężenia przepływu są typowe dla wszystkich instrumentów SPR, a więc nie są restrykcyjne. Instrument SPR nie jest koniecznością, ponieważ cała funkcjonalizacja może być wykonana bezpośrednio na chipie LSPR, ale zmniejszył nasze obciążenie pracą, ponieważ jest to instrument multipleksowany, podczas gdy nasza konfiguracja mikroprzepływowa LSPR nie jest.

  1. Funkcjonalizuj komercyjny chip z gołego złota za pomocą SAM zgodnie z opisem w sekcji 2.
  2. W przypadku stosowania SAM na bazie SPC, aktywować grupę karboksylową mieszaniną 1:1 133 mM 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i 33 mM N-hydroksysukcynimidu (NHS) w DDW przez 10 minut.
  3. Sprzęż aktywowaną grupę karboksylową z badanym przeciwciałem/ligandem przez 300 sekund przy natężeniu przepływu 30 μl/min. Zazwyczaj przygotuj ligandy w buforze fosforanowym o pH 6, ale może się to różnić w zależności od cząsteczki.
  4. Po koniugacji liganda przepływać 0,1 M etanoloaminy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako etap dezaktywatora przez 300 sekund z szybkością 30 μl/min. Etanoloamina pomaga w zminimalizowaniu niespecyficznego wiązania.
  5. Wprowadzić badany analit przy natężeniu przepływu 100 μl/min przy użyciu różnych stężeń i obliczyć stałe szybkości kinetycznej za pomocą oprogramowania do analizy kinetycznej.
  6. Jeśli niespecyficzne wiązanie jest problematyczne, zwiększ stosunek SPO do SPC lub SPN.

4. Ustawienia ogólne LSPR

  1. Ustawienia mikroskopu:
    1. Użyj lampy halogenowej o mocy 100 W, aby oświetlić próbkę firmy Koehler. Użyj filtra długoprzepustowego (zwykle odcięcia 593 nm) na ścieżce światła, aby wyeliminować długości fal, które nie przyczyniają się do przesunięcia rezonansu (ilustracja 2).
    2. Do zbierania danych LSPRi należy użyć mikroskopu odwróconego z obiektywem zanurzeniowym z olejkiem 40X (1,4 NA) i chłodzoną termoelektrycznie 16-bitową kamerą CCD.
    3. Umieść rozdzielacz wiązki w porcie wyjściowym mikroskopu, aby jednocześnie uzyskać obrazy i widma.
    4. Ustawić stolik mikroskopu z kontrolowaną temperaturą na 37 °C i równoważyć przez 4 godziny.
    5. Dołącz dodatkowy zestaw inkubacyjny do mikroskopu, aby regulować stężenie CO2 i wilgotność odpowiednio na poziomie 5% i 95%.
  2. Przygotowanie i montaż wiórów:
    1. Funkcjonalizować układ LSPR zgodnie z opisem w sekcji 2 z optymalnymi dwuskładnikowymi współczynnikami SAM określonymi na podstawie eksperymentów SPR.
    2. Załaduj chip do specjalnie wykonanego uchwytu mikroprzepływowego w następujący sposób. Umieść żeton na aluminiowym dnie. Umieść chip między tą dolną częścią a silikonową uszczelką i przezroczystą plastikową górną częścią. Użyj 4, aby clamp zespół.
    3. W przypadku typowej aplikacji tiolu na bazie SPC, nałóż kroplą 300 μl mieszaniny 1:1 133 mM EDC i 33 mM NHS w DDW, aby aktywować grupy karboksylowe składnika tiolowego SPC.
    4. Odczekaj 10 minut i ręcznie spłucz powierzchnię 10 mM PBS.
    5. Sprzęgnąć aktywowaną grupę karboksylową z ligandem (zwykle przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała) będącym przedmiotem zainteresowania, pokrywając kroplami 300 μl roztworu liganda.
    6. Odczekaj 30 minut i ręcznie spłucz 10 mM PBS.
    7. Ułóż 300 μl 0,1 M etanoloaminy w PBS na chipie, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie. Odczekaj 10 min.
    8. Przemyć etanoloaminę PBS zawierającym 0,005% Tween 20 (PBS-T20).
    9. Umieść kawałek kwarcu nad chipem, aby zmniejszyć wahania danych związanych ze zmieniającą się łąkotką.
    10. Utrzymuj chip mokry za pomocą bufora PBS-T20 podczas montażu na mikroskopie.
    11. Umieść zespół chipa LSPR w podgrzewanym stage sample holder i podłącz rurkę mikroprzepływową.
    12. Podłącz rurki mikroprzepływowe do zespołu i bufora przepływowego (lub pożywki wolnej od surowicy do badań komórkowych) aż do osiągnięcia stanu ustalonego.
    13. Pozwól, aby zespół i mikroskop osiągnęły równowagę przez co najmniej 2 godziny.
    14. Ustaw układ za pomocą joysticka tak, aby centralny układ był wyrównany ze światłowodem do spektroskopii. Dane spektroskopowe są pobierane za pomocą spektrometru i oprogramowania do analizy spektralnej.
    15. Utrzymuj ostrość matryc przez cały czas trwania eksperymentu, korzystając z programowego autofokusa, Zeiss Definite Focus lub równoważnego urządzenia z autofokusem.

5. Obrazowanie LSPR wydzielin anty-c-myc z komórek hybrydoma 9E10

Uwaga: Linia komórkowa hybrydoma użyta do tego badania wyraża przeciwciało anty-c-myc konstytutywnie i dlatego nie wymaga chemicznego wyzwalacza

  1. Funkcjonalizuj nanostruktury za pomocą peptydu c-myc. Ma to wartość KD wynoszącą 1,77 nM dla przeciwciał anty-c-myc wydzielanych przez klonowane komórki hybrydoma 9E10.
  2. Hodować komórki hybrydoma w kompletnej pożywce wzrostowej z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% antybiotykiem w kolbie T75 w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 . Utrzymuj gęstość komórek 4 ×105 komórek/ml.
  3. Do badań wydzielania komórek, komórki osadkowe z kolby T75 przez odwirowanie, przemyć dwukrotnie pożywką wolną od surowicy RPMI-1640 (SFM) w celu usunięcia wydzielanych przeciwciał i dostosować gęstość komórek do 4 ×106 komórek/ml.
  4. Zbierz komórki i przetestuj ich żywotność przed wprowadzeniem ich do chipów LSPR.
  5. Wprowadzić 50 μl roztworu komórkowego ręcznie na chipy LSPR za pomocą mikropipety. Po kilku minutach od 25 do 50 komórek przylega do powierzchni chipów LSPR.
  6. Zmyj pozostałe komórki w roztworze świeżym SFM za pomocą systemu perfuzji mikroprzepływowej.
  7. Do obrazowania należy wybrać matryce LSPR, które znajdują się blisko siebie, w granicach 10 μm, ale nie nakładają się na komórki.
  8. Aby upewnić się, że sygnał jest specyficzny dla wydzielanych przeciwciał anty-c-myc, należy wprowadzić pożywkę do hodowli komórkowej z obecnymi przeciwciałami i bez nich, jak również z przeciwciałami, ale z miejscami wiązania zablokowanymi przez obecność nasyconego stężenia peptydu c-myc w roztworze.
  9. Skalibrować czujniki na końcu każdego cyklu roztworem nasycającym przeciwciała anty-c-myc (250 nM). Pomaga to w normalizacji odpowiedzi czujników i określeniu ułamkowego zajętości na podstawie profilu biofunkcjonalizacji każdego biegu.
  10. Skoryguj dryft w kierunku X i Y za pomocą oprogramowania do wyrównywania obrazu.

Wyniki

W typowym badaniu sekrecji w żywych komórkach stosuje się kilka trybów gromadzenia danych. Rysunek 3 przedstawia nałożenie obrazu LSPRi, który uwydatnia kwadratowe macierze, oraz obrazu w świetle przechodzącym, na którym w lewym dolnym rogu widoczna jest komórka. Dane są zazwyczaj zbierane przez okres 3 h, po czym wprowadza się nasycający roztwór anality przed opisanym poniżej obliczeniem normalizacji. Do rutyny gromadzenia danych można zintegrować obrazowanie fluorescencyjne poprzez automatyczną zmianę kostki filtra. Na Rysunku 4 komórka zabarwiona fluorescencyjnym barwnikiem błonowym rhodamine DHPE wykazuje wypustki przypominające lamellipodia (strzałki). Gdyby takie wypustki nałożyły się na macierze, mogłyby one dać wynik fałszywie dodatni w odniesieniu do sekrecji białek. Stosowanie wielu trybów obrazowania pozwala zidentyfikować takie zdarzenia.

Rysunek 5 przedstawia dane spektrometryczne przed i po wprowadzeniu nasyconego roztworu (400 nM) zakupionych komercyjnie przeciwciał anty-c-myc do matryc funkcjonalizowanych c-myc. W tym eksperymencie nie zastosowano komórek. Widmo wykazuje zarówno przesunięcie czerwone, jak i wzrost intensywności. Różnica między polami pod dwiema krzywymi skutkuje wzrostem intensywności obrazu matrycy w trybie LSPRi na kamerze CCD. Opracowano nieliniową metodę analizy danych metodą najmniejszych kwadratów w celu wyznaczenia frakcyjnego stopnia zajętości ligandów związanych z powierzchnią na podstawie widm.30,31

Na koniec eksperymentu wartości intensywności nasycenia (tj. zajętość frakcyjna ≈ 1) są wykorzystywane do obliczenia znormalizowanej odpowiedzi dla każdego układu przy użyciu następującego wzoru:

Gdzie odpowiednio: znormalizowana intensywność w punkcie czasowym t, intensywność początkowa na początku eksperymentu, końcowa intensywność nasycenia oraz zmierzona intensywność matrycy w punkcie czasowym t.

Znormalizowane wartości z dwóch macierzy przedstawiono na Rysunku 6. Jedna macierz znajdowała się w odległości 10 µm od badanej komórki, natomiast druga, wykorzystana jako kontrola, znajdowała się w odległości 130 µm od komórki. Nagły wzrost znormalizowanej odpowiedzi macierzy położonej najbliżej komórki w stosunku do płaskiej odpowiedzi macierzy kontrolnej wskazuje na lokalny wyrzut wydzielonych przeciwciał.

Schemat oddziaływań powierzchniowych nanocząstek; analiza czujnika plazmonicznego, badanie wzbudzenia optycznego.
Rysunek 1. Projekt czujnika. Rysunek przedstawiający geometrię typowego eksperymentu z sekrecją żywych komórek. Komórka (niebieski sferoid) jest osadzana na chipie LSPR zawierającym macierze biofunkcjonalizowanych nanostruktur złota. W powiększeniu przedstawiono pomiar sekrecji komórkowej (w tym przypadku przeciwciał, ukazanych jako cząsteczki w kształcie litery Y) w momencie ich wiązania się z powierzchnią funkcjonalizowanych nanostruktur. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat układu spektroskopii optycznej z wstawką analizy nanostruktur 3D; obejmuje dzielniki wiązki.
Rysunek 2. Układ optyczny. Światło z lampy halogenowej jest najpierw filtrowane przez filtr długoprzepustowy (LP). Światło jest polaryzowane liniowo (P1) i oświetla próbkę za pomocą obiektywu 40X/1.4 NA. Światło rozproszone jest zbierane przez obiektyw i przechodzi przez polaryzator skrzyżowany (P2). W torze zbieranego światła umieszczono dzielnik wiązki 50/50 (BS) w celu jednoczesnej analizy spektroskopowej i obrazowej. Prawy górny róg: Obraz z mikroskopii sił atomowych 9 pojedynczych nanostruktur oddzielonych rozstawem 300 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Równowaga statyczna, obraz mikroskopowy; wzór siatki z cząsteczką, konfiguracja analizy optycznej do badań.
Rysunek 3. Badanie LSPRi na żywych komórkach. Nałożony obraz światła przechodzącego i obraz LSPRi przedstawiający pojedynczą komórkę hybridoma (lewy dolny róg) otoczoną przez 12 macierzy. Jest to obraz z wzmocnionym kontrastem. Pasek skali wynosi 10 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat emisji plazmy w astronomicznych dżetach, przedstawiający dżety kosmiczne w gromadzie galaktyk.
Rycina 4. Badanie fluorescencji żywych komórek. Fluorescencyjny obraz w fałszywych kolorach pojedynczej komórki hybridoma barwionej rhodamine DHPE, który jest barwnikiem błonowym. W trybie obrazowania fluorescencyjnego macierze zazwyczaj nie są widoczne, jednak w prawym dolnym rogu można zaobserwować pobliską macierz w postaci czarnego kwadratu. Widać, że komórka jest oddzielona od macierzy, choć z komórek wyciekają wypustki przypominające macki (prawdopodobnie filopodia lub lamelipodia) (strzałki). Pasek skali wynosi 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres widm emisji fluorescencji porównujący stężenia, przedstawiający intensywność względem długości fali.
Rycina 5. Modalność spektralna. Widma uzyskane z macierzy funkcjonalizowanej c-myc przed i po wprowadzeniu roztworu przeciwciał anty-c-myc o stężeniu 400 nM. W badaniu tym nie wykorzystano komórek. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres znormalizowanej odpowiedzi w czasie; czerwona krzywa w pobliżu komórki vs. czarna macierz kontrolna.
Rysunek 6. Sekrecja pojedynczej komórki. Odpowiedź macierzy znajdującej się w odległości 15 µm od pojedynczej komórki oraz macierzy oddalonej o 130 µm (Kontrola). Pasek skali wynosi 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Technika obrazowania LSPR opisana w tej pracy ma wiele zalet w porównaniu z bardziej tradycyjnymi metodologiami wykrywania wydzielin komórkowych. Po pierwsze, rozdzielczość czasowa naszej techniki jest rzędu sekund, podczas gdy komercyjna alternatywa, test immunologiczny znany jako EliSpot, ma typową rozdzielczość czasową od 2 do 3 dni. 7,32 W rezultacie byliśmy w stanie rozwiązać nagłe zmiany w tempie wydzielania białka, takie jak te pokazane na rycinie 6. Po drugie, rozmieszczenie macierzy w chipie pozwala na śledzenie wydzielanego sygnału w przestrzeni i czasie, co umożliwia bardziej rygorystyczne porównania z modelami wydzielania komórek opartymi na dyfuzji. Ponadto tablice, takie jak tablica kontrolna pokazana na rysunku 6 , mogą być używane do odejmowania globalnych zmian w obrazie, które zwykle wynikają z czynników instrumentalnych, takich jak dryf ostrości. Po trzecie, nasza technika nie wymaga modyfikacji komórek. W razie potrzeby eksperyment może zawierać powszechnie używane znaczniki, takie jak białka fluorescencyjne, ale jeśli istnieje obawa, że takie znaczniki mogą negatywnie wpływać na żywotność komórek lub homeostazę, bezznacznikowy charakter naszego podejścia ich nie wymaga. Po czwarte, korzystając z danych spektroskopowych, wykazaliśmy, że można obliczyć informacje ilościowe dotyczące frakcyjnego zajmowania ligandów związanych z powierzchnią.

Istnieje wiele alternatywnych metod wytwarzania nanocząstek metalicznych dla EBL. Odkryliśmy jednak, że EBL zapewnia znaczną elastyczność w optymalizacji nanostruktury i wymiarów matrycy, aby jak najlepiej dopasować się do optyki i badanych komórek. Niezwykle ważny jest również fakt, że wióry można łatwo zregenerować poprzez spopielanie plazmowe. W ten sposób typowy chip może być używany dziesiątki razy. Szczegóły biofunkcjonalizacji muszą zostać zmodyfikowane pod kątem konkretnego zastosowania. Przedstawiony tutaj protokół sprzężał powierzchnię ze stosunkowo małymi ligandami peptydu c-myc. Większe ligandy, takie jak całe przeciwciała, zazwyczaj wymagają większych odstępów, a tym samym wyższego stosunku SPO do SPN/SPC. Niezależnie od tego, dobrze uformowana warstwa SAM jest niezbędna do zapobiegania niespecyficznemu wiązaniu w eksperymentach z żywymi komórkami. Ogólnie rzecz biorąc, anality o większej masie cząsteczkowej są łatwiej wykrywane przez LSPR. Tak więc, w postaci pojedynczej komórki, technika ta może nie być odpowiednia do wykrywania wydzielania małych białek, takich jak cytokiny.

Obecna konfiguracja została wykorzystana do badania pojedynczych komórek nieprzylegających. Istnieje znaczna liczba wydzielanych białek sygnałowych i pęcherzyków, do których wyniki przedstawione w tej pracy mają bezpośrednie zastosowanie. Na przykład antygen rakowo-embrionalny (CEA), który od dziesięcioleci jest markerem diagnostycznym raka. Wiadomo, że komórki raka jelita grubego wydzielają CEA w tempie tysięcy cząsteczek / komórkę / godzinę, a masa cząsteczkowa wynosi 180 kDa, co przekracza masę przeciwciał IgG. Uważa się, że CEA jest zaangażowane w autokrynne i parakrynne szlaki sygnałowe, ale czasoprzestrzenny charakter tych wydzielin nigdy nie został zmierzony. Nasza technika może bezpośrednio odpowiedzieć na te pytania sygnalizacyjne. Rozszerzeniem tych prac będzie pomiar czasoprzestrzennego charakteru wydzielania CEA z pojedynczych komórek. 33 Przyszłe prace będą również koncentrować się na integracji LSPRi z dwu- i trójwymiarowymi hodowlami komórkowymi komórek przylegających. Dzięki zastosowaniu multipleksowanych macierzy zdolnych do równoległego wykrywania wielu wydzielanych białek, technika ta może otworzyć nowe okno na wydzieliny komórkowe i ich wpływ na sąsiednie komórki.

Oświadczenia

Dziękujemy George'owi Andersonowi za pomocne komentarze i dyskusje. Prace te były wspierane przez Instytut Nanonauki Laboratorium Badawczego Marynarki Wojennej oraz Nagrodę Współpracy Badawczej Narodowej Rady ds. Badań Naukowych.

Podziękowania

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
25  mm średnica szklane szkiełka nakrywkowe BioscienceTools CSHP-No1.5-25  170± 5 & mikro; m jest optymalny
Polimetakrylan metyluMicrochemPMMA 950 A4
Mleczan etylu Metakrylan metyluMicrochemMMA EL6
Parownik wiązki elektronówTemescalFC-2000
Litografia wiązką elektronówRaithSeries 150
EtanolSigma-Aldrich459836
AcetonSigma-Aldrich320110
CR-7 wytrawiacz chromowyCyantekCR-7
Skaningowy mikroskop elektronowyZeissUltra 55
Mikroskop sił atomowychVeecoNanoscope III
System spopielania plazmowegoTechnicsSeries 85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)ProchimiaTH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)ProchimiaTH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)ProchimiaTH 002-m11.n3-0.2
rezonansu plazmonowegoBioradXPR36
Chip z gołego złotaChip BioradGLCPlazma spoinowana w celu usunięcia monowarstwy
1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimiduThermo22980
N-hydroksysukcynimid (NHS)Thermo24510
Pentyloamina-Biotyna         Thermo21345
EtanoloaminaSigma-AldrichE9508
NeutraawidynaThermo31000
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermo28374
Tween 20Sigma-AldrichP2287
Mikroskop odwróconyZeissAxio ObserverMikroskop jest wyposażony w obiektyw zanurzeniowy z olejkiem 40X; Inkubacja CO2 i wilgotności od Pecon GmbH
Kamera CCDHamamatsuOrca R2Chłodzony termoelektrycznie (16 bitów)
spektrometrOcean OpticsQE65Pro
SpectrasuiteOcean Opticswersja1.4
peptyd c-myc HyNic TagSolulinkSP-E003
monoklonalne przeciwciałoanty-c-mycSigma-AldrichM4439
Hybridoma linia komórkowaATCCCRL-1729
Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy (100 razy;)Sigma-AldrichA5955
Pożywka wolna od surowicy RPMI 1640 Invitrogen  Numer katalogowy: 11835-030 
Płodowa surowica bydlęcaATCC30-2020
Rodamina DHPELife TechnologiesL-1392
: System powierzchniowego

Bibliografia

  1. Ludwig, A. -K., Giebel, B. Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 44, 11-15 (2012).
  2. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 445-457 (2009).
  3. Letterio, J. J., Roberts, A. B. Regulation of immune responses by TGF-beta. Annual Review of Immunology. 16, 137-161 (1998).
  4. Werner, S., Grose, R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiological Reviews. 83, 835-870 (2003).
  5. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. Journal of Investigative Dermatology. 127, 998-1008 (2007).
  6. Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. Journal of the American Chemical Society. 129, 1959-1967 (2007).
  7. Gazagne, A., et al. A Fluorospot assay to detect single T lymphocytes simultaneously producing multiple cytokines. Journal of Immunological Methods. 283, 91-98 (2003).
  8. Han, Q., et al. Polyfunctional responses by human T cells result from sequential release of cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1607-1612 (2012).
  9. Han, Q., Bradshaw, E. M., Nilsson, B., Hafler, D. A., Love, J. C. Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving. Lab on a Chip. 10, 1391-1400 (2010).
  10. Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nature Medicine. 17, 738-743 (2011).
  11. Shirasaki, Y., et al. Real-time single-cell imaging of protein secretion. Scientific Reports. 4, (2014).
  12. Milgram, S., et al. On chip real time monitoring of B-cells hybridoma secretion of immunoglobulin. Biosensors and Bioelectronics. 26, 2728-2732 (2011).
  13. Abbas, A., Linman, M. J., Cheng, Q. A. New trends in instrumental design for surface plasmon resonance-based biosensors. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1815-1824 (2011).
  14. Ermakova, A., et al. Detection of a Few Metallo-Protein Molecules Using Color Centers in Nanodiamonds. Nano Letters. 13, 3305-3309 (2013).
  15. Haes, A. J., Van Duyne, R. P. A nanoscale optical blosensor: Sensitivity and selectivity of an approach based on the localized surface plasmon resonance spectroscopy of triangular silver nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 124, 10596-10604 (2002).
  16. Horowitz, V. R., Aleman, B. J., Christle, D. J., Cleland, A. N., Awschalom, D. D. Electron spin resonance of nitrogen-vacancy centers in optically trapped nanodiamonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13493-13497 (2012).
  17. Sepulveda, B., Angelome, P. C., Lechuga, L. M., Liz-Marzan, L. M. LSPR-based nanobiosensors. Nano Today. 4, 244-251 (2009).
  18. Barbillon, G., et al. Biological and chemical gold nanosensors based on localized surface plasmon resonance. Gold Bulletin. 40, 240-244 (2007).
  19. Endo, T., et al. Multiple label-free detection of antigen-antibody reaction using localized surface plasmon resonance-based core-shell structured nanoparticle layer nanochip. Analytical Chemistry. 78, 6465-6475 (2006).
  20. Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor. Analytical Chemistry. 77, 6976-6984 (2005).
  21. Haes, A. J., Hall, W. P., Chang, L., Klein, W. L., Van Duyne, R. P. A localized surface plasmon resonance biosensor: First steps toward an assay for Alzheimer's disease. Nano Letters. 4, 1029-1034 (2004).
  22. Jonsson, M. P., Jonsson, P., Dahlin, A. B., Hook, F. Supported lipid bilayer formation and lipid-membrane-mediated biorecognition reactions studied with a new nanoplasmonic sensor template. Nano Letters. 7, 3462-3468 (2007).
  23. Park, J. H., et al. A regeneratable, label-free, localized surface plasmon resonance (LSPR) aptasensor for the detection of ochratoxin A. Biosensors & Bioelectronics. 59, 321-327 (2014).
  24. Mayer, K. M., Hao, F., Lee, S., Nordlander, P., Hafner, J. H. A single molecule immunoassay by localized surface plasmon resonance. Nanotechnology. 21, (2010).
  25. Endo, T., Yamamura, S., Kerman, K., Tamiya, E. Label-free cell-based assay using localized surface plasmon resonance biosensor. Analytica Chimica Acta. 614, 182-189 (2008).
  26. Huang, Y. X., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Analytical Chemistry. 83, 4393-4406 (2011).
  27. Oh, B. R., et al. Integrated Nanoplasmonic Sensing for Cellular Functional Immunoanalysis Using Human Blood. ACS Nano. 8, 2667-2676 (2014).
  28. Raphael, M. P., Christodoulides, J. A., Delehanty, J. B., Long, J. P., Byers, J. M. Quantitative Imaging of Protein Secretions from Single Cells in Real Time. Biophysical Journal. 105, 602-608 (2013).
  29. Raphael, M. P., et al. A New Methodology for Quantitative LSPR Biosensing and Imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2011).
  30. Raphael, M. P., et al. Quantitative LSPR imaging for biosensing with single nanostructure resolution. Biophysical Journal. 104, 30-36 (2013).
  31. Raphael, M. P., et al. A new methodology for quantitative LSPR biosensing and imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2012).
  32. Henn, A. D., et al. Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division. Journal of Immunology. 183, 3177-3187 (2009).
  33. Bramswig, K. H., et al. Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis. Cancer Research. 73, 6584-6596 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie lokalnego powierzchniowego rezonansu plazmonowegotechnologia LSPRizłote nanoczujniki plazmonicznesamoorganizująca się monowarstwafunkcjonalizacja ligandamiintegracja mikrofluidycznamapowanie czasoprzestrzennedetekcja sekrecji białek
Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.