Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zarodki danio pręgowanego (Danio rerio) są coraz częściej wykorzystywane jako model infekcji do badania funkcji wrodzonego układu odpornościowego kręgowców w interakcjach gospodarz-patogen. Łatwość uzyskania dużej liczby zarodków, ich dostępność dzięki zewnętrznemu rozwojowi, ich przezroczystość optyczna, a także dostępność szerokiego wachlarza narzędzi genetycznych/immunologicznych i transgenicznych kolekcji linii reporterowych, przyczyniają się do wszechstronności tego modelu. W związku z tym niniejszy manuskrypt opisuje wykorzystanie danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo do badania chronologii zakażenia Mycobacterium abscessus. Ten ludzki patogen może występować w postaci gładkiej (S) lub szorstkiej (R), w zależności od składu ściany komórkowej, a ich odpowiednią zjadliwość można obrazować i porównywać w zarodkach i larwach danio pręgowanego. Mikroiniekcja wariantów fluorescencyjnych S lub R bezpośrednio do krążenia krwi przez żyłę ogonową prowadzi odpowiednio do przewlekłych lub ostrych/śmiertelnych infekcji. Ten system biologiczny umożliwia wizualizację i analizę w wysokiej rozdzielczości roli prątków w promowaniu powstawania ropni. Ponadto zastosowanie bakterii fluorescencyjnych wraz z transgenicznymi liniami danio pręgowanego zawierającymi fluorescencyjne makrofagi stwarza wyjątkową okazję do wielokolorowego obrazowania interakcji gospodarz-patogen. W artykule opisano szczegółowe protokoły przygotowania jednorodnego inokulum M. abscessus oraz dożylnego wstrzykiwania zarodków danio pręgowanego w celu późniejszego obrazowania fluorescencyjnego interakcji z makrofagami. Techniki te otwierają drogę do przyszłych badań nad mutantami wadliwymi w tworzeniu pępowiny i mają na celu zrozumienie, w jaki sposób wpływa to na patogenność M. abscessus u całego kręgowca.
Wprowadzenie
Mycobacterium abscessus to pojawiający się patogen, który powoduje szerokie spektrum klinicznych zespołów u ludzi. Należą do nich zakażenia skórne, a także ciężkie przewlekłe infekcje płuc, najczęściej występujące u pacjentów z obniżoną odpornością i mukowiscydozą1,2,3,4. M. abscessus jest również uważany za główny, szybko rosnący gatunek prątków odpowiedzialny za zakażenia szpitalne i jatrogenne u ludzi. Co więcej, kilka ostatnich doniesień podkreśliło możliwość, że M. abscessus może przekroczyć barierę krew-mózg i wywołać ważne zmiany w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)5,6. Pomimo szybkiego wzrostu, M. abscessus<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury eksperymentalne z wykorzystaniem rybek danio-pręgowanych muszą być zgodne z odpowiednimi przepisami instytucjonalnymi i rządowymi. W niniejszym badaniu eksperymenty na rybkach danio-pręgowanych przeprowadzono na Uniwersytecie w Montpellier, zgodnie z wytycznymi Unii Europejskiej dotyczącymi postępowania ze zwierzętami laboratoryjnymi (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm), zatwierdzonymi pod numerem referencyjnym CEEA-LR-13007.
1. Przygotowanie odczynników i sprzętu do mikroiniekcji
- Przygotować wodę dla ryb, rozpuszczając 0,06 g soli morskiej Instant Ocean w 1 L wody destylowanej31
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Choć możliwe jest dokonywanie iniekcji w różnych miejscach anatomicznych32, iniekcje w żyłę ogonową są często stosowane w celu wywołania infekcji systemowej do późniejszych analiz, w tym eksperymentów dotyczących przeżywalności, oznaczenia ładunku bakteryjnego, aktywności fagocytozy lub tworzenia sznurów. Iniekcje w mięśnie ogona są wykorzystywane do oceny rekrutacji makrofagów w miejscu wstrzyknięcia (Rycina 3A). Aby zbadać i porównać zjadliwość wariantów R i S M. abscessus, fluoresc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Danio pręgowany stał się ostatnio doskonałym systemem modelowym kręgowców do badania dynamiki infekcji bakteryjnych przy użyciu obrazowania szerokokątnego i konfokalnego w czasie rzeczywistym36. Połączenie rozproszonych zawiesin prątków (protokół 2.2) wraz z metodami mikroiniekcji (protokół 4) umożliwia powtarzalne infekcje ogólnoustrojowe, a następnie monitorowanie i wizualizację postępu infekcji ze szczególnym uwzględnieniem interakcji bakteryjnych z makrofagami gospodarza. Zjadliwość M. abscessus <.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni K. Kissie za pomocne dyskusje i dostarczenie lipo-klodronianu oraz L. Ramakrishnanowi za hojny dar pTEC27 i pTEC15, które umożliwiają ekspresję odpowiednio tdTomato i Wasabi. Praca ta jest częścią projektów Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 i DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) oraz Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (FP7-PEOPLE-2011-ITN) na podstawie umowy o grant nr. PITN-GA-2011-289209 dla sieci szkoleń wstępnych Marie-Curie FishForPharma. Pragniemy również podziękować Stowarzyszeniu Gregory Lemarchal i Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) za ufundowanie projektu C.M. Dupont.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| BBL MGIT PANTA | BD Biosciences | 245114 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Euromedex | 04-100-811-E | |
| Katalaza z wątroby bydlęcej | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Difco Middlebrook 7H10 Agar | BD Biosciences | 262710 | |
| Difco Middlebrook 7H9 Bulion | BD Biosciences | 271310 | |
| Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (Trikaina) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Kwas oleinowy | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Paraformaldehyd | Delta Mikroskopia | 15710 | |
| Czerwień fenolowa | Sigma-Aldrich | 319244 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P4780 | |
| Agar | Gibco Life Technologie | 30391-023 | |
| Niskotopliwa agaroza | Sigma-Aldrich | ||
| Instant Ocean Sea Salts | Aquarium Systems Inc | ||
| Kapilary ze szkła borokrzemianowego | Instrument Sutter Inc | BF100-78-10 | 1 mm OD X 0,78 mm ID |
| Urządzenie do ściągania mikropipet | Sutter Instrument Inc | Flamming/Brown Ściągacz do mikropipet p-87 | |
| Mikrowtryskiwacz | Tritech Research | Cyfrowy mikrowtryskiwacz, | |
| pęseta | Sciences Tools inc | Dumont # M5S | |
| Końcówki do mikroładowarek | Eppendorf |
Bibliografia
- Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
- Aitken, M. L., Limaye, A., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
