Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

Summary

Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.

Abstract

Zarodki danio pręgowanego (Danio rerio) są coraz częściej wykorzystywane jako model infekcji do badania funkcji wrodzonego układu odpornościowego kręgowców w interakcjach gospodarz-patogen. Łatwość uzyskania dużej liczby zarodków, ich dostępność dzięki zewnętrznemu rozwojowi, ich przezroczystość optyczna, a także dostępność szerokiego wachlarza narzędzi genetycznych/immunologicznych i transgenicznych kolekcji linii reporterowych, przyczyniają się do wszechstronności tego modelu. W związku z tym niniejszy manuskrypt opisuje wykorzystanie danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo do badania chronologii zakażenia Mycobacterium abscessus. Ten ludzki patogen może występować w postaci gładkiej (S) lub szorstkiej (R), w zależności od składu ściany komórkowej, a ich odpowiednią zjadliwość można obrazować i porównywać w zarodkach i larwach danio pręgowanego. Mikroiniekcja wariantów fluorescencyjnych S lub R bezpośrednio do krążenia krwi przez żyłę ogonową prowadzi odpowiednio do przewlekłych lub ostrych/śmiertelnych infekcji. Ten system biologiczny umożliwia wizualizację i analizę w wysokiej rozdzielczości roli prątków w promowaniu powstawania ropni. Ponadto zastosowanie bakterii fluorescencyjnych wraz z transgenicznymi liniami danio pręgowanego zawierającymi fluorescencyjne makrofagi stwarza wyjątkową okazję do wielokolorowego obrazowania interakcji gospodarz-patogen. W artykule opisano szczegółowe protokoły przygotowania jednorodnego inokulum M. abscessus oraz dożylnego wstrzykiwania zarodków danio pręgowanego w celu późniejszego obrazowania fluorescencyjnego interakcji z makrofagami. Techniki te otwierają drogę do przyszłych badań nad mutantami wadliwymi w tworzeniu pępowiny i mają na celu zrozumienie, w jaki sposób wpływa to na patogenność M. abscessus u całego kręgowca.

Introduction

Mycobacterium abscessus to pojawiający się patogen, który powoduje szerokie spektrum klinicznych zespołów u ludzi. Należą do nich zakażenia skórne, a także ciężkie przewlekłe infekcje płuc, najczęściej występujące u pacjentów z obniżoną odpornością i mukowiscydozą^1,2,3,4. M. abscessus jest również uważany za główny, szybko rosnący gatunek prątków odpowiedzialny za zakażenia szpitalne i jatrogenne u ludzi. Co więcej, kilka ostatnich doniesień podkreśliło możliwość, że M. abscessus może przekroczyć barierę krew-mózg i wywołać ważne zmiany w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)^5,6. Pomimo szybkiego wzrostu, M. abscessus wykazuje również kilka cech patogennych, które są związane z Mycobacterium tuberculosis, w tym zdolność do milczenia przez lata w strukturach ziarniniakowych i generowania zmian serowatych w płucach⁷. Bardziej niepokojąca jest niska wrażliwość M. abscessus na antybiotyki, co sprawia, że infekcje te są niezwykle trudne do leczenia, co prowadzi do znacznego odsetka niepowodzeń terapeutycznych^8,9. Istotnym zagrożeniem związanym z tym gatunkiem jest przede wszystkim jego wewnętrzna oporność na antybiotyki, która budzi poważne obawy w instytucjach zdrowia publicznego¹⁰ i jest przeciwwskazaniem do przeszczepu płuc¹¹.

M. abscessus wykazuje gładkie (S) lub szorstkie (R) morfotypy kolonii, które prowadzą do różnych wyników klinicznych. W przeciwieństwie do szczepu S, bakterie R mają tendencję do wzrostu od końca do końca, co prowadzi do powstania struktury przypominającej linę lub sznur^12,13. Kilka niezależnych badań opartych na modelach komórkowych lub zwierzęcych ujawniło fenotyp hiperwirulencji morfotypu R^14,15. Z badań epidemiologicznych wynika, że najcięższe przypadki zakażeń płuc M. abscessus wydają się być związane z wariantami R¹⁶, które są jedynym wariantem, który utrzymuje się przez lata u zakażonego gospodarza³. Różnica w morfotypie polega na obecności (w S) lub utracie (w R) glikopeptydolipidów związanych z powierzchnią (GPL)¹². Jednak ze względu na nieodłączne ograniczenia obecnie dostępnych modeli komórkowych/zwierzęcych wykorzystywanych do badania infekcji M. abscessus, nasza wiedza na temat zdarzeń patofizjologicznych wariantów R lub S pozostaje niejasna. Zakażenie myszy immunokompetentnych drogą dożylną lub aerozolową prowadzi do przejściowej kolonizacji, utrudniając wykorzystanie myszy do badania uporczywych infekcji i do badania wrażliwości na leki in vivo ¹⁷. W związku z tym opracowanie modeli zwierzęcych podatnych na manipulację reakcją gospodarza jest poważnym wyzwaniem. W tym kontekście niedawno opracowano modele infekcji inne niż ssaki, w tym Drosophila melanogaster¹⁸, który oferuje kilka zalet, takich jak koszt, szybkość i akceptowalność etyczna w porównaniu z modelem mysim. Model infekcji danio pręgowanego (Danio rerio) został również zbadany w celu wizualizacji, za pomocą nieinwazyjnego obrazowania, postępu i chronologii zakażenia M. abscessus u żywego zwierzęcia¹⁹. Co ważne, ustanowiono również dowód słuszności koncepcji, aby wykazać jego przydatność do oceny antybiotyków in vivo przeciwko M. abscessus^17,20.

Danio pręgowany był szeroko stosowany w ciągu ostatnich dwóch dekad do badania interakcji między różnymi patogenami a układem odpornościowym gospodarza²¹. Rosnący sukces tego alternatywnego modelu kręgowców opiera się na dużych i unikalnych możliwościach, które zmotywowały i potwierdziły jego zastosowanie w celu lepszego zrozumienia licznych infekcji wirusowych i bakteryjnych^{19,22,23,24,25,26,27,28,29}. W przeciwieństwie do większości innych modeli zwierzęcych, zarodki danio pręgowanego są optycznie przezroczyste, co pozwala na nieinwazyjne obrazowanie fluorescencyjne³⁰. Doprowadziło to do zbadania zarodków danio pręgowanego zakażonych M. abscessus z niespotykanymi dotąd szczegółami, których kulminacją był opis sznurów zewnątrzkomórkowych, które stanowią przykład plastyczności morfologicznej bakterii. Cording stanowi nowy mechanizm subwersji układu odpornościowego i kluczowy mechanizm promujący patogenezę ostrego zakażenia M. abscessus ¹⁹.

Ten raport opisuje nowe narzędzia i metody wykorzystujące zarodek danio pręgowanego do rozszyfrowania patofizjologicznych cech infekcji M. abscessus i do zbadania intymnych interakcji między pałeczkami a wrodzonym układem odpornościowym. Po pierwsze, przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji, który obejmuje przetwarzanie inokulum bakteryjnego, przygotowanie zarodka i infekcję jako taką. Przedstawiono metody specjalnie przystosowane do oceny zjadliwości M. abscessus poprzez pomiar różnych parametrów, takich jak przeżywalność gospodarza i obciążenie bakteryjne. Szczególny nacisk położono na to, jak monitorować, na poziomie czasoprzestrzennym, los i postęp infekcji oraz odpowiedź immunologiczną gospodarza na M. abscessus za pomocą wideomikroskopii. Ponadto, aby zbadać udział i rolę makrofagów w zakażeniu M. abscessus, opisano metody generowania zarodków zubożonych w makrofagi (przy użyciu podejść opartych na genetyce lub chemii). Na koniec udokumentowane są protokoły wizualizacji specyficznych interakcji z makrofagami lub neutrofilami przy użyciu stałych lub żywych zarodków.

Celem tego raportu jest stymulowanie dalszych badań, które rzucą nowe światło na mechanizmy wirulencji M. abscessus, a w szczególności na rolę cordingu w tworzeniu ostrego i niekontrolowanego procesu infekcji.

Protocol

Procedury eksperymentalne danio pręgowanego muszą być zgodne z odpowiednimi regulacjami instytucjonalnymi i rządowymi. Na potrzeby niniejszego badania eksperymenty z danio pręgowanym zostały przeprowadzone na Uniwersytecie w Montpellier, zgodnie z wytycznymi Unii Europejskiej dotyczącymi postępowania ze zwierzętami laboratoryjnymi (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) i zatwierdzone pod numerem referencyjnym CEEA-LR-13007.

1. Przygotowanie odczynników i sprzętu do mikroiniekcji

1. Przygotuj wodę dla ryb, rozpuszczając 0,06 g rozpuszczalnej soli oceanicznej w 1 litrze wody destylowanej³¹, a następnie autoklaw w celu sterylizacji (120 °C przez 20 min) i przechowuj w temperaturze 28,5 °C przez okres do 1 miesiąca.
2. Przygotować roztwór błękitu metylenowego, rozpuszczając 1 g błękitu metylenowego w 1 l wody destylowanej. Dodać 300 μl roztworu błękitu metylenowego do 1 l wody dla ryb, aby uzyskać niebieską wodę dla ryb, a następnie autoklaw w celu sterylizacji i przechowywania w temperaturze 28,5 °C przez okres do 1 miesiąca.
   UWAGA: Dodatek błękitu metylenowego do wody dla ryb zapobiega rozwojowi pleśni.
3. Przygotowanie soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)
   1. Przygotować 10 X PBS roztwór podstawowy, rozpuszczając 5,696 g Na₂HPO₄, 680 mg KH₂PO₄, 969 mg KCl i 78,894 g NaCl w 1 l wody destylowanej i dostosować pH do 7,0 za pomocą HCl. Aby otrzymać 1 X PBS, rozcieńczyć 100 ml roztworu 10 X PBS w 900 ml wody destylowanej i sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 120 °C.
   2. Dodaj 0,05% Tween 80, aby uzyskać 1 X PBST i przechowywać w RT przez okres do 1 roku.
4. Przygotować wzbogacenie katalazą dekstrozy kwasu oleinowego (OADC) przez rozpuszczenie 8,5 g NaCl, 50 g albuminy surowicy bydlęcej, 20 g D-glukozy, 40 mg katalazy z wątroby bydlęcej i 0,5 g kwasu oleinowego w 1 l wody destylowanej, a następnie przefiltrować, wysterylizować roztwór i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
5. Przygotować 100 ml roztworu podstawowego kwasu metanosulfonowego (trikainy) 3-aminobenzoesanu etylu, rozpuszczając 400 mg trikainy w proszku w 97,9 ml wody destylowanej. Dodać 2,1 ml 1 M Tris (pH 9) w celu dostosowania pH do 7,0 i przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
6. Przygotować igły do iniekcji mikrokapilarnych, ciągnąc kapilary ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1 mm x średnica zewnętrzna 0,78 mm) za pomocą ściągacza do mikropipet z następującymi ustawieniami: Ciśnienie powietrza 650; Upał 999; Pociągnij 50; Prędkość 80; Czas 200.
7. Przygotuj 1,5% roztwór agaru w niebieskiej wodzie dla ryb i wlej 25 ml stopionego agaru na 100 mm szalki Petriego. Na wierzchu stopionego agaru umieść domowe foremki, aby odcisnąć określone kanały. Kanały w kształcie litery "V" służą do pozycjonowania zarodków, podczas gdy kanały w kształcie litery "U" są używane do jaj (ryc. 1)³¹. Po zestaleniu ostrożnie usuń odcisk.
   UWAGA: Zalej agar niebieską wodą rybną, aby uniknąć odwodnienia i przechowuj w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.

Rysunek 1. Komory pozycjonujące do iniekcji danio pręgowanego. (A) Kanały w kształcie litery U dla jaj (lewy panel) i kanały w kształcie litery V dla zarodków (prawy panel). Ikry/zarodki danio pręgowanego są składane w kanałach i ustawiane wzdłuż tej samej osi. (B) Komory widokowe do obserwacji mikroskopowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie i przechowywanie inokulum M. abscessus

1. Warunki wzrostu M. abscessus
   1. Usunąć M. abscessus z glicerolu o temperaturze -80°C na agarze Middlebrook 7H10 zawierającym 10% OADC i 0,5% glicerolu (^{7H10 OADC}) i uzupełnić odpowiednim antybiotykiem w zależności od markera oporności przenoszonego przez wektor kodujący białko fluorescencyjne. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 4-5 dni.
   2. Weź fluorescencyjną kolonię prątków i zaszczep 1 ml bulionu Middlebrook 7H9 uzupełnionego OADC, 0,2% glicerolu, 0,05% Tween 80 (7H9^OADC/T) wymaganym antybiotykiem w sterylnej plastikowej tubie o pojemności 15 ml. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 1 tydzień bez wstrząsania.
      UWAGA: Animacja 80 ogranicza zbrylanie i agregację bakterii.
   3. Zawiesić hodowlę wstępną otrzymaną w 2.1.2 w 50 ml kolbach Middlebrook 7H9^OADC/T w 150 cm 2 kolbach do hodowli tkankowych^do końcowego 0,1 OD₆₀₀ (co odpowiada około 5,10⁷ bakteriom/ml) i dalej inkubować w temperaturze 30 °C przez 4 dni w celu uzyskania wykładniczo rosnącej kultury (OD₆₀₀ = 0,6 do 0,8).
      UWAGA: Aby zminimalizować zbrylanie, zwłaszcza w wariancie szorstkim, inkubacja nie powinna przekraczać 5 dni. Zarówno warianty gładkie, jak i szorstkie wykazują podobne tempo wzrostu.
2. Przygotowanie szczepionki M. abscessus
   UWAGA: Ze względu na dużą skłonność szorstkich M. abscessus do tworzenia dużych skupisk i wytwarzania sznurów, konieczne jest specjalne leczenie w celu wytworzenia jednorodnej i ilościowo kontrolowanej inokuli przed mikroiniekcjami w zarodkach. Zabieg ten stosuje się również do bakterii gładkich, które wytwarzają agregaty, choć w mniejszym stopniu niż szczep szorstki.
   1. Zebrać wykładniczo rosnące kultury z kolb do hodowli tkankowych o wielkości 150 cm² przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze suchej temperatury w sterylnej probówce z tworzywa sztucznego o pojemności 50 ml i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 1 ml 7H9^OADC/T. Podwielokrotność 200 μl zawiesin bakteryjnych do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Praca z małymi objętościami w strzykawkach o pojemności 1 ml jest konieczna w celu uzyskania wysoce jednorodnych zawiesin.
   2. Homogenizować zawiesiny bakteryjne za pomocą igły 26-G (15 sekwencji góra-dół), sonikować trzy razy przez 10 sekund (z 10-sekundowymi przerwami między każdą sekwencją sonikacji) za pomocą sonikatora w kąpieli wodnej. Dodać 1 ml 7H9^OADC/T i krótko przemieszać. Wirować 3 minuty przy 100 x g.
   3. Ostrożnie zebrać supernatanty zawierające prątki, aby uniknąć grudek i zebrać jednorodne zawiesiny w sterylnej plastikowej probówce o pojemności 50 ml.
   4. Sprawdź wzrokowo, czy nie ma ewentualnych pozostałych agregatów bakteryjnych.
      UWAGA: Jeśli agregaty są nadal obecne, należy przejść do dodatkowego etapu wirowania przy 100 x g przez 2 minuty i zebrać supernatant.
   5. Odwirować zawiesinę o stężeniu 4 000 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad w 200 μl 7H9^OADC/Ti przystąpić do iniekcji.
   6. Ocenić końcowe stężenie bakterii poprzez posiew seryjnych rozcieńczeń (w 1 x PBST) na agarze^{7H10 OADC} i zliczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) po 4 dniach inkubacji w temperaturze 30 °C. Dla każdej nowej partii należy oznaczyć jtk.
   7. Przygotować zamrożone zapasy inokulantów, przechowując 5 μl porcji w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Ocena CFU zamrożonych podwielokrotności w temperaturze -80°C jest warunkiem wstępnym do określenia dokładnej liczby żywotnych bakterii, ponieważ zamrażanie/rozmrażanie może wpływać na żywotność bakteryjną inokulum. Te zamrożone inokulatory są gotowe do użycia do kolejnych wstrzyknięć. Ponieważ wszystkie podwielokrotności zawierają taką samą liczbę CFU, umożliwiają one wstrzykiwanie bakterii w powtarzalny sposób z jednego eksperymentu do drugiego.
3. Kontrola jakości inokulum
   UWAGA: Barwienie Ziehl-Neelsen (specyficzne dla prątków) może być stosowane do porównywania jakości zawiesin bakteryjnych przed i po procedurach homogenizacji opisanych w ppkt 2.2.
   1. Odplamić i rozprowadzić jedną kroplę homogenizowanej zawiesiny bakteryjnej na szkiełku podstawowym i pozostawić do całkowitego wyschnięcia, utrwalić rozmaz na co najmniej 30 minut na gorącej płycie ustawionej na 65-70 ^oC i zabarwić przy użyciu protokołu barwienia Ziehl-Neelsen.
   2. Obserwuj rozmaz bakteryjny pod mikroskopem przy użyciu obiektywu 100 X i porównaj z rozmazem nieprzetworzonej zawiesiny bakteryjnej (ryc. 2).

Ryc. 2. Przygotowanie rozproszonej inokulacji M. abscessus.Barwienie Ziehl-Neelsen wariantów R lub S wyhodowanych na pożywce bulionowej przed jakimkolwiek zabiegiem (górne panele) lub po zabiegu (dolne panele) w celu zmniejszenia wielkości i liczby agregatów prątków (kolejne etapy strzykawki, sonikacji i dekantacji). Bakterie obserwowano za pomocą mikroskopu z obiektywem 100 X APO oil 1,4 NA). Podziałka skali: 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego

1. Tarło i zbieranie ikry danio pręgowanego
   1. Dzień przed tarłem rozmnażaj dorosłe danio pręgowanego, umieszczając 2 samce i 1 samicę (zwykle stosunek 2:1 pozwala na optymalne tempo zapłodnienia) w komorze hodowlanej, składającej się z oddzielnego akwarium z koszem do zbierania jaj³¹.
      UWAGA: Kosze do zbierania jaj służą do ochrony jaj przed zjedzeniem przez rodziców i ułatwienia zbioru jaj.
   2. W temperaturze 1 hpf zbierać jaja i tylko prawidłowo rozwinięte zarodki na 100 mm szalce Petriego wypełnionej 25 ml niebieskiej wody dla ryb (maksymalnie 100 zarodków na szalkę) i przechowywać je w temperaturze 28,5 °C. Niezapłodnione jaja są odrzucane.
2. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego do wstrzyknięć
   1. Po około 24 godzinach od zapłodnienia (hpf) należy zdechorionować zarodki za pomocą cienkiej pęsety na szalce Petriego o średnicy 100 mm i utrzymywać je w temperaturze 28,5 °C.
   2. Zebrać 30-48 zarodków hpf za pomocą pipety i przenieść je do komory pozycjonującej w kształcie litery "V" wypełnionej 25 ml wody rybnej zawierającej 270 mg/l trikainy. Ułóż zarodki prawidłowo w kanałach za pomocą domowej roboty końcówki do mikroładowarki (domowej roboty przycięta końcówka mikroładowarki) zoptymalizowanej pod kątem łatwiejszej mikromanipulacji.
      UWAGA: Ustaw stronę grzbietową w dół w przypadku wstrzyknięć dożylnych w żyłę ogonową lub stronę grzbietową w górę w przypadku wstrzyknięć w mięśnie ogona.

4. Procedura mikroiniekcji

UWAGA: Procedura mikroiniekcji dla M. abscessus jest podobna do tej opisanej wcześniej dla M. marinum ^{injections 32}. Aby ocenić chronologię zakażenia M. abscessus (przeżycie, obciążenia bakteryjne, kinetyka i charakterystyka infekcji), preferowane są wstrzyknięcia w żyłę ogonową 30 zarodków hpf. Aby uwidocznić rekrutację komórek odpornościowych, zastrzyki wykonuje się w zlokalizowanych miejscach, takich jak mięśnie ogona w zarodku 48 hpf.

1. Rozcieńczyć inokulum prątków w 1 X PBST (w zależności od liczby jtk, która ma być podana zgodnie z krokiem 2.2.6), zawierającej 10% czerwonego fenolu w celu sprawdzenia prawidłowości wstrzyknięcia.
2. Załadować igłę do iniekcji mikrokapilarnej 5-10 μl inokulum bakteryjnego za pomocą końcówki mikroładowacza, podłączyć igłę do mikroiniekcji do uchwytu trójwymiarowego mikromanipulatora podłączonego do wtryskiwacza i odłamać górną część igły drobną pęsetą, aby uzyskać średnicę otworu 5-10 μm.
3. Skalibruj objętość wtrysku, regulując ciśnienie mikroiniekcji (20-50 hPa) i czas (0,2 sekundy).
   UWAGA: Wymaganą objętość wstrzyknięcia kalibruje się poprzez wizualne określenie średnicy kropli wydalanej do żółtka zarodka.
4. W przypadku iniekcji żyły ogonowej należy umieścić zarodek stroną brzuszną skierowaną w stronę igły (jak opisano w punkcie 3.2.2) i umieścić końcówkę igły blisko otworu moczowo-płciowego, kierując się w stronę żyły ogonowej, a następnie delikatnie wepchnąć końcówkę igły do zarodka, aż przebije się przez obszar żyły ogonowej. Dostarczyć pożądaną objętość preparatu bakteryjnego, zwykle 1-3 nl zawierającego około 100 jtk/nl.
5. W przypadku wstrzyknięcia domięśniowego należy umieścić zarodek stroną grzbietową skierowaną w stronę igły (jak w sekcji 3.2.2), umieścić igłę nad jednym somitem i wstrzyknąć niewielką objętość (1 nl) inokulum.
   UWAGA: Jeśli chodzi o iniekcje do żyły ogonowej, infekcje domięśniowe są również trudne do wykonania. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć przeciążenia, które może uszkodzić otaczające tkanki.
6. Pod koniec procedury wstrzykiwania należy kontrolować wielkość inokulum, wstrzykując tę samą objętość zawiesiny bakteryjnej w kropli sterylnego PBST, a następnie posiewając na^{7H10 OADC}i licząc CFU. Około 100 zarodków można wstrzyknąć za pomocą igły.
   UWAGA: Ponieważ szorstki M. abscessus może nadal tworzyć agregaty w igle, wstrzyknięcia należy wykonać natychmiast po przygotowaniu inokulum.
7. Zakażone ryby należy przenieść pojedynczo na 24-dołkowe płytki zawierające 2 ml/wodę dla ryb studzienkowych i inkubować w temperaturze 28,5 °C. Zarodki, którym wstrzyknięto 1-3 nl 1 X PBST, mogą być używane jako kontrole.
8. Prawidłowe zakażenie bakteriami fluorescencyjnymi w zarodkach jest monitorowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

5. Wytwarzanie zarodków zubożonych w makrofagi

UWAGA: Selektywne usuwanie makrofagów z tkanek służy do badania ich udziału i roli podczas infekcji. Aby uwidocznić prawidłowe zubożenie makrofagów, zaleca się użycie linii transgenicznej z makrofagami fluorescencyjnymi, w której mCherry ulega specyficznej ekspresji pod kontrolą specyficznego dla makrofagów promotora mpeg1 ¹⁹.

1. Zabieg na bazie lipo-klodronianu
   UWAGA: Procedura lipo-klodronianu pozwala na selektywne zubożenie makrofagów z tkanek (ale bez neutrofili)¹⁹. Związek ten nie zmienia przeżywalności zarodków ani nie wpływa na integralność bakterii. Szczegółowy protokół przygotowania klodronianu kapsułkowanego w liposomach został opisany wcześniej³³.
   1. W temperaturze 24 hpf dokonać dekorionacji zarodków i przenieść je do naczynia iniekcyjnego w kształcie litery "V" wypełnionego wodą rybną uzupełnioną trikainą, aby utrzymać zarodki w stanie znieczulonym do końca procedury wstrzyknięcia, jak opisano w ppkt 3.2.2. Ustaw stronę grzbietową w dół.
   2. Załadować igłę do iniekcji mikrokapilarnych klodronianem zamkniętym w liposomach (lipo-klodronianem), połączyć igłę do mikroiniekcji z uchwytem trójwymiarowego mikromanipulatora i odłamać górną część igły drobną pęsetą, aby uzyskać średnicę otworu końcówki 10 μm.
   3. Aby skalibrować objętość wstrzyknięcia, należy dostosować ciśnienie mikroiniekcji do 20 hPa, a czas wstrzyknięcia do 0,2 sekundy. Umieścić końcówkę igły blisko otworu moczowo-płciowego, kierując się do żyły ogonowej, i delikatnie wepchnąć końcówkę igły do zarodka, aż przebije obszar żyły ogonowej i dostarczy żądaną objętość roztworu (2-3 nl, 3 razy).
      UWAGA: Zawiesina lipo-klodronianu jest bardzo lepka i powinna być wirowana przed wstrzyknięciem, aby uniknąć zablokowania układu naczyniowego i zabicia zarodka. Bardzo ważne jest, aby przejść do kilku kolejnych wstrzyknięć o małych objętościach.
   4. Przenieść zarodki na 100-milimetrowe szalki Petriego zawierające wodę dla ryb i utrzymywać je w temperaturze 28,5 °C aż do zakażenia.
   5. Kontroluj prawidłowe zubożenie makrofagów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
      UWAGA: Całkowite wyczerpanie makrofagów jest skuteczne przez 4 dni po podaniu lipo-klodoronianu.
2. Procedura oparta na morfolinie
   1. Dzień przed tarłem rozmnażaj dorosłego danio pręgowanego, umieszczając 2 samce i 1 samicę oddzielone plastikową barierą w komorze hodowlanej.
   2. Następnego dnia, ≈ 30 minut po tym, jak w obiekcie danio pręgowanego włącza się światło, usuwa się barierę oddzielającą samce i samice. Odczekaj około 20 minut po rozpoczęciu tarła, aby zoptymalizować tempo nawożenia. Zbierz jaja i spowolnij ich rozwój, przenosząc je na 100-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną zimną, niebieską wodą dla ryb (4 °C).
      UWAGA: Kontrola tarła ma kluczowe znaczenie dla eksperymentów opartych na morfolinosach. Morfolinosy mogą być wstrzykiwane do jaj tylko do stadium czterech komórek.
   3. Zbierz jaja za pomocą pipety i umieść jaja w komorze iniekcyjnej w kształcie litery "U" wypełnionej zimną, niebieską wodą dla ryb i zablokuj jaja w kanałach za pomocą domowej roboty końcówki do mikroładowarki.
   4. Przygotować roztwór morfolino pu.1 zawierający 10% czerwonego fenolu, jak opisano wcześniej¹⁹. Załadować igłę do iniekcji mikrokapilarnej preparatem morpholino i połączyć igłę do mikroiniekcji z uchwytem mikromanipulatora trójwymiarowego, następnie odłamać końcówkę igły za pomocą cienkiej pęsety, aby uzyskać średnicę otworu końcówki 5-10 μm.
   5. Aby skalibrować objętość iniekcji, należy dostosować ciśnienie mikroiniekcji do 20-50 hPa, a czas wstrzyknięcia do 0,2 sekundy. Umieścić końcówkę igły blisko komórki jajowej i delikatnie wepchnąć końcówkę igły przez kosmówkę do komórki jajowej i dostarczyć pożądaną objętość roztworu morfolino, zwykle 3-5 nl.
   6. Po mikroiniekcji przenieść jaja na szalkę Petriego o średnicy 100 mm w wodzie dla ryb i inkubować w temperaturze 28,5 °C aż do rozpoczęcia procedury infekcji.
   7. Przeanalizuj prawidłowe (całkowite) zubożenie makrofagów w morfantach pu.1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w temperaturze od 30 do 48 hpf. _.
      UWAGA: W zależności od wstrzykniętego stężenia, morfoliny pu.1 mogą również wpływać na liczbę wczesnych neutrofili. Aby potwierdzić prawidłowe zubożenie makrofagów bez zmiany liczby neutrofili, zaleca się użycie podwójnej transgenicznej linii danio pręgowanego z fluorescencyjnymi makrofagami i neutrofilami (z ekspresją GFP specyficznie napędzaną przez promotor mpx)¹⁹.

6. Kwantyfikacja obciążenia bakteryjnego

1. Oznaczanie przez wyliczenie CFU
   1. W pożądanym momencie zbierz grupy zakażonych zarodków (po 5 na warunki) w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (1 zarodek/probówka), krioznieczulenie zarodków przez inkubację na lodzie przez 10 minut i poddaj eutanazji przy użyciu przedawkowania tricainy (300-500 mg/l)
   2. Umyj zarodki sterylną wodą dwukrotnie i wlej je do nowej probówki, poddaj każdy zarodek lizie 2% Triton X-100 rozcieńczonym w 1 X PBST za pomocą igły 26-G i homogenizuj zawiesinę aż do całkowitej lizy. Odwirować zawiesinę i ponownie zawiesić osad w 1 X PBST z 0,05% Tween 80. Seryjne rozcieńczenia homogenatów są powlekane na Middlebrook 7H10^OADC i uzupełniane BBL MGIT PANTA, zgodnie z zaleceniami dostawcy.
      UWAGA: M. abscessus jest bardziej podatny na leczenie NaOH niż M. marinum, odkażanie lizatów ryb bez wpływu na wzrost M. abscessus można z powodzeniem osiągnąć za pomocą koktajlu antybiotykowego BBL MGIT PANTA.
   3. Inkubować płytki przez 4 dni w temperaturze 30 °C i policzyć kolonie.
2. Oznaczanie za pomocą pomiarów liczby pikseli fluorescencyjnych (FPC) w żywych zarodkach
   UWAGA: Aby określić obciążenie bakteryjne poprzez emisję fluorescencji, uzyskuje się seryjne obrazy zakażonych zarodków i mierzy intensywność fluorescencji za pomocą FPC (identyfikacja bakterii przez analizę cząstek) przy użyciu domowego makra opracowanego dla darmowego oprogramowania ImageJ. Analiza cząstek wymaga binarnego czarno-białego obrazu, który opiera się na zakresie progowym, który pozwala na odróżnienie interesującego sygnału fluorescencyjnego od tła.
   1. W pożądanym punkcie czasowym znieczulenie trikainą zakażonych zarodków (5-10 na warunek) na 35-milimetrowych szalkach Petriego, jak opisano w ppkt 3.2.2.
   2. Usuń wodę i zanurz zarodki i całą powierzchnię naczynia w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia w wodzie dla ryb, a następnie wyrównaj zarodki z boku. Zastygłą agarozę zalać wodą rybną zawierającą trikainę.
   3. Uzyskaj obrazy fluorescencyjne całego zarodka za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywem 10 X.
      UWAGA: Akwizycja obrazu fluorescencyjnego jest krytycznym etapem procedury pomiarów FPC. Ważne jest, aby używać skalibrowanego monitora z sondą do kalibracji kolorów. Dostosowanie optymalnego czasu ekspozycji w celu uzyskania minimalnego tła podczas akwizycji zapobiega nasyceniu sygnału. Obrazy muszą być w 8-bitowym formacie tiff. Identyczne ustawienia są zachowywane podczas całego eksperymentu do celów ilościowych.
   4. Ostrożnie usuń agarozę z zarodków za pomocą domowej roboty końcówki do mikroładowarki. W razie potrzeby zarodki te mogą być wykorzystane do kolejnych analiz. Przed ilościowym określeniem obciążenia bakteryjnego każdy obraz jest poddawany kontroli jakości. Aby przeanalizować obrazy i przekonwertować intensywność fluorescencji na FPC na rybę, otwórz darmowe oprogramowanie ImageJ.
      UWAGA: Wartość FPC odzwierciedla obciążenie bakteryjne, jak pokazano wcześniej przy użyciu M. marinum³⁴.
   5. Określ wymagany próg do analizy obrazu za pomocą obrazu niezakażonego zarodka (w celu uzyskania średniego progu można użyć kilku zarodków kontrolnych). Przejdź do Obraz → Dostosuj próg→, a następnie przesuń dolny suwak w oknie progu w prawo, aż tło stanie się całkowicie czarne (tj. aby uzyskać tło powinno być na zero). Zapisz odpowiednią wartość.
   6. W Image J otwórz makro FPC (plik uzupełniający) i postępuj zgodnie z instrukcjami: zlokalizuj folder z obrazami do zmierzenia, a następnie wprowadź wcześniej określony próg i kliknij "OK".
      UWAGA: Makro automatycznie odejmuje tło. Następnie stosowany jest próg. Sygnały fluorescencyjne są identyfikowane po analizie cząstek.
   7. Skopiuj i wklej dane z okna podsumowania do żądanego oprogramowania do analizy danych.
      UWAGA: W przeciwieństwie do metody oznaczania CFU, metoda FPC jest nieinwazyjna i pozwala na ponowne wykorzystanie zarodków do kolejnych analiz oraz, co ważne, monitorowanie dynamiki/kinetyki obciążenia bakteryjnego na zasadzie indywidualnej. Pozwala to zatem na znaczne zmniejszenie liczby zwierząt, zgodnie z zasadami etycznymi.

7. Obrazowanie M. abscessus - zakażone zarodki

1. Obrazowanie na żywo zakażenia M. abscessus
   1. Zamontuj zarodki znieczulone trikainą (patrz 3.2.2) w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia na szalce Petriego o średnicy 35 mm przed obserwacjami mikroskopii epifluorescencyjnej. Użyj naczynia ze szklanym dnem do odwróconej mikroskopii konfokalnej lub w szkiełku z pojedynczym wgłębieniem wnęki do pionowej mikroskopii konfokalnej. Ustaw zarodek w żądanej pozycji i przykryj zestaloną agarozę wodą rybną zawierającą trikainę.
   2. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywem 10 X do sekwencyjnego pozyskiwania i transmisji obrazów fluorescencyjnych całego zarodka. Alternatywnie użyj mikroskopu konfokalnego z obiektywami 40X lub 63X, aby zobrazować aktywność komórek odpornościowych po infekcji.
2. Obrazowanie utrwaliło zarodki zakażone M. abscessus
   1. Poddać eutanazji zarodki zgodnie z opisem w ppkt 6.1.1 i przenieść je do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i utrwalić zarodki w 4% paraformaldehydzie w 1 X PBST przez 2 godziny w temperaturze RT lub O/N w temperaturze 4 °C. Usunąć paraformaldehyd, przemując zarodki dwukrotnie 1 X PBST przez 10 min.
      UWAGA: Aby zachować fluorescencję, utrwalone zarodki muszą być chronione przed światłem.
   2. Aby zachować integralność tkanek i fluorescencję, zarodki są kolejno inkubowane w roztworach o rosnącym stężeniu glicerolu (10, 20, 30, 40 i 50% rozcieńczonych w 1 X PBST), przez 10 minut na warunek.
      UWAGA: Utrwalone zarodki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w 50% glicerolu w temperaturze 4 °C.
   3. Połóż zarodek zanurzony w 50% glicerolu w komorze obserwacyjnej (ryc. 1B)³¹.
   4. Obraz za pomocą obiektywów 40X lub 63X w mikroskopie konfokalnym.

Results

Chociaż różne miejsca anatomiczne mogą być wstrzykiwane³², często stosuje się iniekcje do żył ogonowych do generowania infekcji ogólnoustrojowej do późniejszych analiz, w tym eksperymentów przetrwania, określania obciążenia bakteryjnego, aktywności fagocytozy lub tworzenia pępowiny. Iniekcje w mięśnie ogona służą do oceny rekrutacji makrofagów w miejscu wstrzyknięcia (ryc. 3A). Aby zbadać i porównać zjadliwość wariantów R i S M. abscessus, fluorescencyjne zawiesiny bakteryjne wstrzyku...

Discussion

Danio pręgowany stał się ostatnio doskonałym systemem modelowym kręgowców do badania dynamiki infekcji bakteryjnych przy użyciu obrazowania szerokokątnego i konfokalnego w czasie rzeczywistym³⁶. Połączenie rozproszonych zawiesin prątków (protokół 2.2) wraz z metodami mikroiniekcji (protokół 4) umożliwia powtarzalne infekcje ogólnoustrojowe, a następnie monitorowanie i wizualizację postępu infekcji ze szczególnym uwzględnieniem interakcji bakteryjnych z makrofagami gospodarza. Zjadliwość M. abscessus <...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BBL MGIT PANTA	BD Biosciences	245114
Albumina surowicy bydlęcej	Euromedex	04-100-811-E
Katalaza z wątroby bydlęcej	Sigma-Aldrich	C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar	BD Biosciences	262710
Difco Middlebrook 7H9 Bulion	BD Biosciences	271310
Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (Trikaina)	Sigma-Aldrich	A5040
Kwas oleinowy	Sigma-Aldrich	O1008
Paraformaldehyd	Delta Mikroskopia	15710
Czerwień fenolowa	Sigma-Aldrich	319244
Tween 80	Sigma-Aldrich	P4780
Agar	Gibco Life Technologie	30391-023
Niskotopliwa agaroza	Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts	Aquarium Systems Inc
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	Instrument Sutter Inc	BF100-78-10	1 mm OD X 0,78 mm ID
Urządzenie do ściągania mikropipet	Sutter Instrument Inc		Flamming/Brown Ściągacz do mikropipet p-87
Mikrowtryskiwacz	Tritech Research		Cyfrowy mikrowtryskiwacz,
pęseta	Sciences Tools inc		Dumont # M5S
Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf