Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53130

⸱

9 września 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535, Université Montpellier, 2Centre d'études d'agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689, Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM, Université Versailles St Quentin

W tym artykule

Podsumowanie

Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.

Streszczenie

Zarodki danio pręgowanego (Danio rerio) są coraz częściej wykorzystywane jako model infekcji do badania funkcji wrodzonego układu odpornościowego kręgowców w interakcjach gospodarz-patogen. Łatwość uzyskania dużej liczby zarodków, ich dostępność dzięki zewnętrznemu rozwojowi, ich przezroczystość optyczna, a także dostępność szerokiego wachlarza narzędzi genetycznych/immunologicznych i transgenicznych kolekcji linii reporterowych, przyczyniają się do wszechstronności tego modelu. W związku z tym niniejszy manuskrypt opisuje wykorzystanie danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo do badania chronologii zakażenia Mycobacterium abscessus. Ten ludzki patogen może występować w postaci gładkiej (S) lub szorstkiej (R), w zależności od składu ściany komórkowej, a ich odpowiednią zjadliwość można obrazować i porównywać w zarodkach i larwach danio pręgowanego. Mikroiniekcja wariantów fluorescencyjnych S lub R bezpośrednio do krążenia krwi przez żyłę ogonową prowadzi odpowiednio do przewlekłych lub ostrych/śmiertelnych infekcji. Ten system biologiczny umożliwia wizualizację i analizę w wysokiej rozdzielczości roli prątków w promowaniu powstawania ropni. Ponadto zastosowanie bakterii fluorescencyjnych wraz z transgenicznymi liniami danio pręgowanego zawierającymi fluorescencyjne makrofagi stwarza wyjątkową okazję do wielokolorowego obrazowania interakcji gospodarz-patogen. W artykule opisano szczegółowe protokoły przygotowania jednorodnego inokulum M. abscessus oraz dożylnego wstrzykiwania zarodków danio pręgowanego w celu późniejszego obrazowania fluorescencyjnego interakcji z makrofagami. Techniki te otwierają drogę do przyszłych badań nad mutantami wadliwymi w tworzeniu pępowiny i mają na celu zrozumienie, w jaki sposób wpływa to na patogenność M. abscessus u całego kręgowca.

Wprowadzenie

Mycobacterium abscessus to pojawiający się patogen, który powoduje szerokie spektrum klinicznych zespołów u ludzi. Należą do nich zakażenia skórne, a także ciężkie przewlekłe infekcje płuc, najczęściej występujące u pacjentów z obniżoną odpornością i mukowiscydozą1,2,3,4. M. abscessus jest również uważany za główny, szybko rosnący gatunek prątków odpowiedzialny za zakażenia szpitalne i jatrogenne u ludzi. Co więcej, kilka ostatnich doniesień podkreśliło możliwość, że M. abscessus może przekroczyć barierę krew-mózg i wywołać ważne zmiany w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)5,6. Pomimo szybkiego wzrostu, M. abscessus wykazuje również kilka cech patogennych, które są związane z Mycobacterium tuberculosis, w tym zdolność do milczenia przez lata w strukturach ziarniniakowych i generowania zmian serowatych w płucach7. Bardziej niepokojąca jest niska wrażliwość M. abscessus na antybiotyki, co sprawia, że infekcje te są niezwykle trudne do leczenia, co prowadzi do znacznego odsetka niepowodzeń terapeutycznych8,9. Istotnym zagrożeniem związanym z tym gatunkiem jest przede wszystkim jego wewnętrzna oporność na antybiotyki, która budzi poważne obawy w instytucjach zdrowia publicznego10 i jest przeciwwskazaniem do przeszczepu płuc11.

M. abscessus wykazuje gładkie (S) lub szorstkie (R) morfotypy kolonii, które prowadzą do różnych wyników klinicznych. W przeciwieństwie do szczepu S, bakterie R mają tendencję do wzrostu od końca do końca, co prowadzi do powstania struktury przypominającej linę lub sznur12,13. Kilka niezależnych badań opartych na modelach komórkowych lub zwierzęcych ujawniło fenotyp hiperwirulencji morfotypu R14,15. Z badań epidemiologicznych wynika, że najcięższe przypadki zakażeń płuc M. abscessus wydają się być związane z wariantami R16, które są jedynym wariantem, który utrzymuje się przez lata u zakażonego gospodarza3. Różnica w morfotypie polega na obecności (w S) lub utracie (w R) glikopeptydolipidów związanych z powierzchnią (GPL)12. Jednak ze względu na nieodłączne ograniczenia obecnie dostępnych modeli komórkowych/zwierzęcych wykorzystywanych do badania infekcji M. abscessus, nasza wiedza na temat zdarzeń patofizjologicznych wariantów R lub S pozostaje niejasna. Zakażenie myszy immunokompetentnych drogą dożylną lub aerozolową prowadzi do przejściowej kolonizacji, utrudniając wykorzystanie myszy do badania uporczywych infekcji i do badania wrażliwości na leki in vivo 17. W związku z tym opracowanie modeli zwierzęcych podatnych na manipulację reakcją gospodarza jest poważnym wyzwaniem. W tym kontekście niedawno opracowano modele infekcji inne niż ssaki, w tym Drosophila melanogaster18, który oferuje kilka zalet, takich jak koszt, szybkość i akceptowalność etyczna w porównaniu z modelem mysim. Model infekcji danio pręgowanego (Danio rerio) został również zbadany w celu wizualizacji, za pomocą nieinwazyjnego obrazowania, postępu i chronologii zakażenia M. abscessus u żywego zwierzęcia19. Co ważne, ustanowiono również dowód słuszności koncepcji, aby wykazać jego przydatność do oceny antybiotyków in vivo przeciwko M. abscessus17,20.

Danio pręgowany był szeroko stosowany w ciągu ostatnich dwóch dekad do badania interakcji między różnymi patogenami a układem odpornościowym gospodarza21. Rosnący sukces tego alternatywnego modelu kręgowców opiera się na dużych i unikalnych możliwościach, które zmotywowały i potwierdziły jego zastosowanie w celu lepszego zrozumienia licznych infekcji wirusowych i bakteryjnych19,22,23,24,25,26,27,28,29. W przeciwieństwie do większości innych modeli zwierzęcych, zarodki danio pręgowanego są optycznie przezroczyste, co pozwala na nieinwazyjne obrazowanie fluorescencyjne30. Doprowadziło to do zbadania zarodków danio pręgowanego zakażonych M. abscessus z niespotykanymi dotąd szczegółami, których kulminacją był opis sznurów zewnątrzkomórkowych, które stanowią przykład plastyczności morfologicznej bakterii. Cording stanowi nowy mechanizm subwersji układu odpornościowego i kluczowy mechanizm promujący patogenezę ostrego zakażenia M. abscessus 19.

Ten raport opisuje nowe narzędzia i metody wykorzystujące zarodek danio pręgowanego do rozszyfrowania patofizjologicznych cech infekcji M. abscessus i do zbadania intymnych interakcji między pałeczkami a wrodzonym układem odpornościowym. Po pierwsze, przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji, który obejmuje przetwarzanie inokulum bakteryjnego, przygotowanie zarodka i infekcję jako taką. Przedstawiono metody specjalnie przystosowane do oceny zjadliwości M. abscessus poprzez pomiar różnych parametrów, takich jak przeżywalność gospodarza i obciążenie bakteryjne. Szczególny nacisk położono na to, jak monitorować, na poziomie czasoprzestrzennym, los i postęp infekcji oraz odpowiedź immunologiczną gospodarza na M. abscessus za pomocą wideomikroskopii. Ponadto, aby zbadać udział i rolę makrofagów w zakażeniu M. abscessus, opisano metody generowania zarodków zubożonych w makrofagi (przy użyciu podejść opartych na genetyce lub chemii). Na koniec udokumentowane są protokoły wizualizacji specyficznych interakcji z makrofagami lub neutrofilami przy użyciu stałych lub żywych zarodków.

Celem tego raportu jest stymulowanie dalszych badań, które rzucą nowe światło na mechanizmy wirulencji M. abscessus, a w szczególności na rolę cordingu w tworzeniu ostrego i niekontrolowanego procesu infekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury eksperymentalne z wykorzystaniem rybek danio-pręgowanych muszą być zgodne z odpowiednimi przepisami instytucjonalnymi i rządowymi. W niniejszym badaniu eksperymenty na rybkach danio-pręgowanych przeprowadzono na Uniwersytecie w Montpellier, zgodnie z wytycznymi Unii Europejskiej dotyczącymi postępowania ze zwierzętami laboratoryjnymi (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm), zatwierdzonymi pod numerem referencyjnym CEEA-LR-13007.

1. Przygotowanie odczynników i sprzętu do mikroiniekcji

  1. Przygotować wodę dla ryb, rozpuszczając 0,06 g soli morskiej Instant Ocean w 1 L wody destylowanej31, następnie wysterylizować w autoklawie (120 °C przez 20 min) i przechowywać w temperaturze 28,5 °C do 1 miesiąca.
  2. Przygotować roztwór błękitu metylenowego, rozpuszczając 1 g błękitu metylenowego w 1 L wody destylowanej. Dodać 300 µl roztworu błękitu metylenowego do 1 L wody dla ryb, aby otrzymać niebieską wodę dla ryb, następnie wysterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze 28,5 °C do 1 miesiąca.
    UWAGA: Dodatek błękitu metylenowego do wody dla ryb zapobiega wzrostowi pleśni.
  3. Przygotowanie solistrowanego roztworu fosforanowego (PBS)
    1. Przygotować 10 X roztwór zapasowy PBS, rozpuszczając 5,696 g Na2HPO4, 680 mg KH2PO4, 969 mg KCl i 78,894 g NaCl w 1 L wody destylowanej, a następnie dostosować pH do 7,0 za pomocą HCl. Aby otrzymać 1 X PBS, rozcieńczyć 100 ml roztworu 10 X PBS w 900 ml wody destylowanej i wysterylizować w autoklawie przez 20 min w temperaturze 120 °C.
    2. Dodać 0,05% Tween 80, aby otrzymać 1 X PBST i przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 roku.
  4. Przygotować pożywkę wzbogaconą OADC (Oleic Acid Dextrose Catalase), rozpuszczając 8,5 g NaCl, 50 g albuminy surowicy bydlęcej, 20 g D-glukozy, 40 mg katalazy z wątroby bydlęcej i 0,5 g kwasu oleinowego w 1 L wody destylowanej, a następnie wysterylizować roztwór poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
  5. Przygotować 100 ml roztworu zapasowego kwasu 3-aminobenzoesanu etylu metanosulfonowego (trikainy), rozpuszczając 400 mg proszku trikainy w 97,9 ml wody destylowanej. Dodać 2,1 ml 1 M Tris (pH 9), aby dostosować pH do 7,0, i przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotować mikrokapilarne igły do iniekcji poprzez wyciąganie kapilar z borokrzemianu szkła (1 mm O.D. X 0,78 mm I.D.) za pomocą urządzenia do wyciągania mikrokapilar z następującymi ustawieniami: ciśnienie powietrza 650; grzanie 999; wyciąganie 50; prędkość 80; czas 200.
  7. Przygotować 1,5% roztwór agaru w niebieskiej wodzie dla ryb i wlać 25 ml stopionego agaru do szalek Petriego o średnicy 100 mm. Na powierzchni stopionego agaru umieścić wykonane samodzielnie formy w celu odciśnięcia specyficznych kanałów. Kanały w kształcie litery „V” służą do pozycjonowania embrionów, natomiast kanały w kształcie litery „U” do jaj (Rycina 1)31. Po zestaleniu ostrożnie usunąć formę.
    UWAGA: Przykryć agar niebieską wodą dla ryb, aby zapobiec odwodnieniu, i przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 miesięcy.

Schemat układu do iniekcji z szalką Petriego, kanałami z agaru do wyrównywania jaj i zarodków; komora obserwacyjna.
Rysunek 1. Komory pozycjonujące do iniekcji u danio pręgowanego. (A) Kanały w kształcie litery U dla jaj (panel lewy) i kanały w kształcie litery V dla zarodków (panel prawy). Jaja/zarodki danio pręgowanego są układane w kanałach i wyrównywane wzdłuż tej samej osi. (B) Komory obserwacyjne do obserwacji mikroskopowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie i przechowywanie inokulum M. abscessus

  1. M. abscessus warunki hodowli
    1. Wysiać M. abscessus z zapasu glicerolowego przechowywanego w -80°C na agar Middlebrook 7H10 zawierający 10% OADC i 0,5% glicerolu (7H10OADC), uzupełniony o odpowiedni antybiotyk, zależnie od markera oporności niesionego przez wektor kodujący białko fluorescencyjne. Inkubować płytki w 30 °C przez 4-5 dni.
    2. Wybrać fluorescencyjnie dodatnią kolonię prątków i zaszczepić 1 ml bulionu Middlebrook 7H9 uzupełnionego o OADC, 0,2% glicerolu, 0,05% Tween 80 (7H9OADC/T) i wymagany antybiotyk w sterylnym plastikowym probówce o pojemności 15 ml. Inkubować w 30 °C przez 1 tydzień bez wytrząsania.  
      UWAGA: Tween 80 ogranicza zlepianie się i agregację bakterii.
    3. Resuspender prekulturę uzyskaną w punkcie 2.1.2 w 50 ml 7H9OADC/T w kolbach do hodowli tkankowych o powierzchni 150 cm2 do końcowej wartości 0,1 OD600 (co odpowiada około 5.107 bakterii/ml) i inkubować dalej w 30 °C przez 4 dni, aby uzyskać kulturę w fazie wzrostu wykładniczego (OD600 = 0,6 do 0,8).  
      UWAGA: Aby zminimalizować agregację, szczególnie w przypadku wariantu szorstkiego, inkubacja nie powinna przekraczać 5 dni. Zarówno warianty gładkie, jak i szorstkie wykazują podobną szybkość wzrostu.
  2. Przygotowanie inokulum M. abscessus  
    UWAGA: Ze względu na wysoką skłonność szorstkiego szczepu M. abscessus do tworzenia dużych agregatów i sznurów, konieczne jest zastosowanie specjalnej procedury w celu uzyskania jednorodnych i ilościowo kontrolowanych inokulów przed mikroiniekcjami do embrionów. Procedurę tę stosuje się również do bakterii gładkich, które tworzą agregaty, choć w mniejszym stopniu niż szczep szorstki.
    1. Zebrać kultury w fazie wzrostu wykładniczego z kolb do hodowli tkankowych o powierzchni 150 cm2 poprzez wirowanie przy 4 000 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT) w sterylnym plastikowym probówce o pojemności 50 ml, a następnie resuspender osad bakteryjny w 1 ml 7H9OADC/T. Rozdzielić 200 µl zawiesiny bakteryjnej do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.  
      UWAGA: Praca z małymi objętościami w strzykawkach 1 ml jest niezbędna do uzyskania wysoce jednorodnych zawiesin.
    2. Ujednorodnić zawiesiny bakteryjne za pomocą igły 26-G (15 cykli zasysania i wypychania), sonikować trzy razy po 10 sek (z 10-sekundowymi przerwami między każdą sekwencją sonikacji) za pomocą sonikatora w kąpieli wodnej. Dodać 1 ml 7H9OADC/T i krótko wymieszać na vortexie. Wirować przez 3 min przy 100 x g.
    3. Ostrożnie zebrać nadnadstąwek zawierające prątki, aby uniknąć grudek, i połączyć jednorodne zawiesiny w sterylnym plastikowym probówce o pojemności 50 ml.
    4. Sprawdzić wizualnie obecność ewentualnych pozostałych agregatów bakteryjnych.  
      UWAGA: Jeśli agregaty są nadal obecne, należy przeprowadzić dodatkowy etap wirowania przy 100 x g przez 2 min i zebrać nadnadstąwek.
    5. Wirować zawiesinę przy 4 000 x g przez 5 min, resuspender osad w 200 µl 7H9OADC/T i przystąpić do iniekcji.
    6. Ocenić końcowe stężenie bakterii poprzez wysianie rozcieńczeń szeregowych (w 1 x PBST) na agar 7H10OADC i policzyć jednostki tworzące kolonie (CFU) po 4 dniach inkubacji w 30 °C. CFU należy wyznaczyć dla każdej nowej partii.
    7. Przygotować mrożone zapasy inokulum, przechowując aliquoty o objętości 5 µl w -80 °C.  
      UWAGA: Ocena CFU mrożonych aliquotów w -80°C jest niezbędna do określenia dokładnej liczby żywych bakterii, ponieważ zamrażanie i rozmrażanie może wpływać na żywotność bakterii w inokulum. Mrożone inokula te są gotowe do użycia w kolejnych iniekcjach. Ponieważ wszystkie aliquoty zawierają taką samą liczbę CFU, pozwalają one na reprodukowalne wstrzykiwanie bakterii z jednego eksperymentu do drugiego.
  3. Kontrola jakości inokulum  
    UWAGA: Do porównania jakości zawiesin bakteryjnych przed i po procedurach homogenizacji opisanych w punkcie 2.2 można zastosować barwienie metodą Ziehla-Neelsena (specyficzne dla prątków).
    1. Nanieść i rozprowadzić jedną kroplę zhomogenizowanej zawiesiny bakteryjnej na szkiełko przedmiotowe i pozostawić do całkowitego wyschnięcia, utrwalić rozmaz przez co najmniej 30 min na płycie grzewczej ustawionej na 65-70 oC i zabarwić zgodnie z protokołem barwienia Ziehla-Neelsena.
    2. Obserwować rozmaz bakteryjny pod mikroskopem przy użyciu obiektywu 100 X i porównać go z rozmazem nieprzetworzonej zawiesiny bakteryjnej (Rysunek 2).

Mikroskopia bakterii przed i po opracowaniu; warianty S i R; analiza żywotności komórek.
Rycina 2. Przygotowanie zdyspergowanych M. abscessus inokulów. Barwienie Ziehla-Neelsena wariantów R lub S hodowanych na pożywce płynnej przed jakimkolwiek opracowaniem (panele górne) lub po opracowaniu (panele dolne) w celu zmniejszenia rozmiaru i liczby agregatów prątków (kolejne etapy przeciskania przez strzykawkę, sonikacji i dekantacji). Bakterie obserwowano przy użyciu mikroskopu z obiektywem 100 X APO oil 1.4 NA). Paski skali: 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Przygotowanie embrionów danio pręgowanego

  1. Tarło i zbieranie ikry danio pręgowanego
    1. Dzień przed tarłem dobierz dorosłe osobniki danio pręgowanego, umieszczając 2 samce i 1 samicę (zazwyczaj stosunek 2:1 pozwala na optymalny stopień zapłodnienia) w komorze tarłowej, składającej się z oddzielnego akwarium z koszykiem do zbierania ikry31.
      UWAGA: Koszyki do zbierania ikry są stosowane w celu ochrony jaj przed zjedzeniem przez rodziców oraz w celu ułatwienia ich zbioru.
    2. W 1 hpf zbierz jaja i wyłącznie prawidłowo rozwinięte zarodki do szalki Petriego o średnicy 100 mm wypełnionej 25 ml niebieskiej wody dla ryb (maksymalnie 100 zarodków na szalkę) i utrzymuj je w temperaturze 28,5 °C. Jaja niezapłodnione należy odrzucić.
  2. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego do iniekcji
    1. Około 24 h po zapłodnieniu (hpf) usuń otoczki chorionowe zarodków za pomocą precyzyjnej pęsety w szalce Petriego o średnicy 100 mm i utrzymuj je w temperaturze 28,5 °C.
    2. Zbierz zarodki w wieku 30-48 hpf za pomocą pipety i przenieś je do komory pozycjonującej w kształcie litery „V” wypełnionej 25 ml wody dla ryb zawierającej 270 mg/L trikainy. Ułóż zarodki prawidłowo w kanałach, używając domowej roboty narzędzia z końcówki mikroladera (przycięta końcówka mikroladera), zoptymalizowanego pod kątem łatwiejszej mikromanipulacji.
      UWAGA: Ustaw stronę grzbietową skierowaną w dół w przypadku iniekcji dożylnych do żyły ogonowej lub stronę grzbietową skierowaną w górę w przypadku iniekcji do mięśni ogona.

4. Procedura mikroiniekcji

UWAGA: Procedura mikroiniekcji dla M. abscessus jest podobna do procedury opisanej wcześniej dla iniekcji M. marinum32. Aby ocenić chronologię infekcji M. abscessus (przeżywalność, miano bakterii, kinetykę i charakterystykę infekcji), preferowane są iniekcje do żyły ogonowej embrionów w 30 hpf. W celu wizualizacji rekrutacji komórek odpornościowych iniekcje wykonuje się w miejscach zlokalizowanych, takich jak mięśnie ogona u embrionów w 48 hpf.

  1. Rozcieńczyć inokulum prątków w 1 X PBST (zależnie od liczby CFU do podania, określonej w kroku 2.2.6), zawierającym 10% czerwonego fenolu w celu sprawdzenia poprawności wstrzyknięcia.
  2. Napełnić mikrokapilarną igłę do iniekcji 5-10 µl inokulum bakteryjnego za pomocą końcówki mikroładownika, podłączyć igłę do uchwytu trójwymiarowego mikromanipulatora połączonego z injektorem i odłamać górną część igły precyzyjną pęsetą, aby uzyskać średnicę otworu wynoszącą 5-10 µm.
  3. skalibrować objętość iniekcji poprzez regulację ciśnienia mikroiniekcji (20-50 hPa) i czasu (0,2 sec).
    UWAGA: Wymagana objętość iniekcji jest kalibrowana poprzez wizualne określenie średnicy kropli wypuszczonej do żółtka embrionu.
  4. W przypadku iniekcji do żyły ogonowej, ustawić embrion stroną brzuszną w stronę igły (jak opisano w sekcji 3.2.2) i umieścić końcówkę igły blisko otworu urogenitalnego, celując w żyłę ogonową, a następnie delikatnie wsunąć końcówkę igły w embrion, aż przebije ona obszar żyły ogonowej. Podać pożądaną objętość preparatu bakteryjnego, zazwyczaj 1-3 nl zawierających około 100 CFU/nl.
  5. W przypadku iniekcji domięśniowej, ustawić embrion stroną grzbietową w stronę igły (jak w sekcji 3.2.2), umieścić igłę nad jednym somitem i wstrzyknąć małą objętość (1 nl) inokulum.
    UWAGA: Podobnie jak w przypadku iniekcji do żyły ogonowej, infekcje domięśniowe są trudne do wykonania. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć nadmiernego obciążenia, które mogłoby uszkodzić otaczające tkanki.
  6. Po zakończeniu procedury iniekcji kontrolować wielkość inokulum poprzez wstrzyknięcie tej samej objętości zawiesiny bakteryjnej do kropli sterylnego PBST, a następnie wysianie na podłoże 7H10OADC i przeliczenie CFU. Jedną igłą można zaszczepić około 100 embrionów.
    UWAGA: Ponieważ szorstki wariant M. abscessus może nadal tworzyć agregaty w igle, iniekcje należy wykonywać natychmiast po przygotowaniu inokulum.
  7. Przenieść zainfekowane ryby indywidualnie do płytek 24-dołkowych zawierających 2 ml/dołek wody dla ryb i inkubować w temperaturze 28,5 °C. Jako kontrole można wykorzystać embriony wstrzyknięte 1-3 nl 1 X PBST.
  8. Poprawność infekcji bakteriami fluorescencyjnymi w embrionach monitoruje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

5. Generowanie embrionów pozbawionych makrofagów

UWAGA: Selektywne usuwanie makrofagów z tkanek stosuje się w celu zbadania ich wkładu i roli podczas infekcji. Aby zwizualizować prawidłowe usunięcie makrofagów, zaleca się użycie linii transgenicznej z fluorescencyjnymi makrofagami, w której mCherry jest specyficznie wyrażane pod kontrolą specyficznego dla makrofagów promotora mpeg119.

  1. Procedura z wykorzystaniem lipo-klodronianu  
    UWAGA: Procedura z lipo-klodronianem umożliwia selektywne usunięcie makrofagów z tkanek (ale nie neutrofili)19. Związek ten nie wpływa na przeżywalność embrionów ani na integralność bakterii. Szczegółowy protokół przygotowania klodronianu zamkniętego w liposomach został opisany wcześniej33.
    1. W 24 hpf zdechorionizować embriony i przenieść je do „V”-kształtnej szalki do iniekcji wypełnionej wodą dla ryb z dodatkiem trikainy, aby utrzymać embriony w stanie znieczulenia do końca procedury iniekcji, zgodnie z opisem w 3.2.2. Ułożyć embriony stroną grzbietową do dołu.
    2. Napełnić mikrokapilarną igłę do iniekcji klodronianem zamkniętym w liposomach (lipo-klodronianem), zamocować igłę w uchwycie trójwymiarowego mikromanipulatora i odłamać górną część igły za pomocą precyzyjnej pęsety, aby uzyskać średnicę otworu końcówki wynoszącą 10 µm.
    3. Aby skalibrować objętość iniekcji, ustawić ciśnienie mikroiniekcji na 20 hPa i czas iniekcji na 0,2 s. Umieścić końcówkę igły blisko otworu urogenitalnego, celując w żyłę ogonową, i delikatnie wsunąć końcówkę igły do embrionu, aż przebije ona obszar żyły ogonowej, a następnie podać żądaną objętość roztworu (2-3 nl, 3 razy).  
      UWAGA: Zawiesina lipo-klodronianu jest bardzo lepka i przed iniekcją powinna zostać wymieszana w wirówce typu vortex, aby uniknąć zablokowania układu naczyniowego i śmierci embrionu. Kluczowe jest wykonanie kilku następujących po sobie iniekcji małych objętości.
    4. Przenieść embriony do szalek Petriego o średnicy 100 mm zawierających wodę dla ryb i przechowywać je w temperaturze 28,5 °C do momentu infekcji.
    5. Kontrolować prawidłowe usunięcie makrofagów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
      UWAGA: Całkowite usunięcie makrofagów jest skuteczne przez 4 dni po podaniu lipo-klodronianu.
  2. Procedura z wykorzystaniem morfolino
    1. Dzień przed tarłem rozmieścić dorosłe danio pręgowane, umieszczając 2 samce i 1 samicę, oddzielonych plastikową barierą, w komorze tarłowej.
    2. Następnego dnia, ok. 30 min po zapaleniu światła w pomieszczeniu dla danio pręgowanych, usunąć barierę oddzielającą samce od samic. Odczekać ok. 20 min od rozpoczęcia tarła, aby zoptymalizować wskaźnik zapłodnienia. Zebrać jaja i spowolnić ich rozwój, przenosząc je do szalki Petriego o średnicy 100 mm wypełnionej zimną niebieską wodą dla ryb (4 °C).  
      UWAGA: Kontrola tarła jest kluczowa dla eksperymentów z wykorzystaniem morfolino. Morfolino można wstrzyknąć do jaj tylko do stadium czterech komórek.
    3. Zebrać jaja za pomocą pipety i umieścić je na dnie „U”-kształtnej komory do iniekcji wypełnionej zimną niebieską wodą dla ryb, a następnie zablokować jaja w kanałach za pomocą domowej roboty narzędzia do ładowania końcówek mikroloaderów.
    4. Przygotować roztwór morfolino pu.1 zawierający 10% czerwonego fenolu, zgodnie z wcześniejszym opisem19. Napełnić mikrokapilarną igłę do iniekcji preparatem morfolino i zamocować igłę w uchwycie trójwymiarowego mikromanipulatora, a następnie odłamać końcówkę igły precyzyjną pęsetą, aby uzyskać średnicę otworu końcówki wynoszącą 5-10 µm.
    5. Aby skalibrować objętość iniekcji, ustawić ciśnienie mikroiniekcji na 20-50 hPa i czas iniekcji na 0,2 s. Umieścić końcówkę igły blisko jaja i delikatnie wsunąć końcówkę igły przez chorion do jaja, podając żądaną objętość roztworu morfolino, zazwyczaj 3-5 nl.
    6. Po mikroiniekcji przenieść jaja do szalki Petriego o średnicy 100 mm z wodą dla ryb i inkubować w temperaturze 28,5 °C do rozpoczęcia procedury infekcji.
    7. Przeanalizować prawidłowe (całkowite) usunięcie makrofagów u morfantów pu.1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w czasie od 30 do 48 hpf..  
      UWAGA: W zależności od wstrzykniętego stężenia, morfolino pu.1 mogą również wpływać na liczbę wczesnych neutrofili. Aby potwierdzić prawidłowe usunięcie makrofagów bez zmiany liczby neutrofili, zaleca się użycie podwójnej linii transgenicznej danio pręgowanych z fluorescencyjnymi makrofagami i neutrofilami (z ekspresją GFP sterowaną specyficznie przez promotor mpx)19.

6. Ilościowe określanie obciążenia bakteryjnego

  1. Oznaczenie poprzez liczenie CFU
    1. W wybranym punkcie czasowym zebrać grupy zainfekowanych embrionów (5 na warunki) do probówek mikroodwirowywaczy o pojemności 1,5 ml (1 embrion/probówka), znieczulić embriony metodą kriogeniczną poprzez inkubację na lodzie przez 10 min i poddać eutanazji przy użyciu przedawkowania trikainy (300-500 mg/L)
    2. Przemyć embriony sterylną wodą dwukrotnie i przenieść do nowej probówki, lizować każdy embrion 2% roztworem Triton X-100 rozcieńczonym w 1 X PBST za pomocą igły 26-G i homogenizować zawiesinę do całkowitej lizy. Odwirować zawiesinę i resuspendować osad w 1 X PBST z 0,05% Tween 80. Rozcieńczenia seryjne homogenizatów wysiać na podłoże Middlebrook 7H10OADC uzupełnione o BBL MGIT PANTA, zgodnie z zaleceniami dostawcy.
      UWAGA: M. abscessus jest bardziej wrażliwy na traktowanie NaOH niż M. marinum, zatem dekontaminację lizatów ryb bez wpływu na wzrost M. abscessus można skutecznie przeprowadzić przy użyciu koktajlu antybiotykowego BBL MGIT PANTA.
    3. Inkubować płytki przez 4 dni w temperaturze 30 °C i policzyć kolonie.
  2. Oznaczenie poprzez pomiar liczby pikseli fluorescencyjnych (FPC) w żywych embrionach
    UWAGA: Aby określić ładunek bakteryjny via emisję fluorescencji, pozyskuje się seryjne obrazy zainfekowanych embrionów, a intensywność fluorescencji mierzy się za pomocą FPC (identyfikacja bakterii poprzez analizę cząsteczek) przy użyciu autorskiego makra opracowanego dla darmowego oprogramowania ImageJ. Analiza cząsteczek wymaga binarnego obrazu czarno-białego, opartego na zakresie progu, który pozwala odróżnić interesujący sygnał fluorescencyjny od tła.
    1. W wybranym punkcie czasowym znieczulić trikainą zainfekowane embriony (5-10 na warunki) w szalkach Petriego 35 mm, zgodnie z opisem w 3.2.2.
    2. Usunąć wodę i zanurzyć embriony oraz całą powierzchnię szalki w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia w wodzie dla ryb, a następnie ustawić embriony bokiem. Przykryć zestaloną agarozę wodą dla ryb zawierającą trikainę.
    3. Pozyskać obrazy fluorescencyjne całego embrionu przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywem 10 X.
      UWAGA: Pozyskiwanie obrazów fluorescencyjnych jest krytycznym krokiem procedury pomiarów FPC. Ważne jest użycie skalibrowanego monitora z sondą do kalibracji kolorów. Dostosowanie optymalnego czasu ekspozycji w celu uzyskania minimalnego tła podczas akwizycji zapobiega nasyceniu sygnału. Obrazy muszą być w 8-bitowym formacie tiff. W celach ilościowych podczas całego eksperymentu zachowuje się identyczne ustawienia.
    4. Ostrożnie usunąć agarozę z embrionów za pomocą autorskiego narzędzia z końcówką mikroladera. Embriony te mogą być wykorzystane do dalszych analiz, jeśli jest to wymagane. Przed kwantyfikacją ładunku bakteryjnego każdy obraz powinien zostać poddany kontroli jakości. Aby przeanalizować obrazy i przekonwertować intensywność fluorescencji na FPC na rybę, należy otworzyć darmowe oprogramowanie ImageJ.
      UWAGA: Wartość FPC odzwierciedla obciążenie bakteryjne, co wykazano wcześniej przy użyciu M. marinum34.
    5. Wyznaczyć wymagany próg analizy obrazu, korzystając z obrazu niezainfekowanego embrionu (do uzyskania średniego progu można użyć kilku embrionów kontrolnych). Przejść do Image → Adjust → Threshold, a następnie przesuwać dolny suwak w oknie progu w prawo, aż tło stanie się całkowicie czarne (tzn. aby tło wynosiło zero). Zapisać odpowiednią wartość.
    6. W programie ImageJ otworzyć makro FPC (plik uzupełniający) i postępować zgodnie z instrukcjami: wskazać folder z obrazami do pomiaru, a następnie wprowadzić wcześniej wyznaczony próg i kliknąć „OK”.
      UWAGA: Makro automatycznie odejmuje tło. Następnie stosowany jest próg. Sygnały fluorescencyjne są identyfikowane po analizie cząsteczek.
    7. Skopiować i wkleić dane z okna podsumowania do wybranego oprogramowania do analizy danych.
      UWAGA: W przeciwieństwie do metody oznaczania CFU, metoda FPC jest nieinwazyjna i pozwala na ponowne wykorzystanie embrionów do późniejszych analiz, a co ważne, na monitorowanie dynamiki/kinetyki obciążenia bakteryjnego w ujęciu indywidualnym. Pozwala to zatem na znaczną redukcję liczby zwierząt, zgodnie z zasadami etycznymi.

7. Obrazowanie zarodków zakażonych M. abscessus

  1. Obrazowanie na żywo zakażenia M. abscessus
    1. Przed obserwacjami za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej zamocuj embriony znieczulone trikainą (patrz 3.2.2) w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia w 35 mm szalce Petriego. Do mikroskopii konfokalnej odwróconej użyj szalki z szklanym dnem, a do mikroskopii konfokalnej prostej przedmiotu ze wgłębieniem jednokomorowym. Ustaw embrion w pożądanej pozycji i przykryj stężałą agarozę wodą dla ryb zawierającą trikainę.
    2. Do sekwencyjnego pozyskiwania obrazów fluorescencyjnych i transmisyjnych całego embrionu użyj mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywem 10 X. Alternatywnie, w celu wizualizacji aktywności komórek odpornościowych po zakażeniu, użyj mikroskopu konfokalnego z obiektywami 40X lub 63X.
  2. Obrazowanie utrwalonych embrionów zakażonych M. abscessus
    1. Uśmierć embriony zgodnie z opisem w 6.1.1, przenieś je do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i utrwal w 4% paraformaldehydzie w 1 X PBST przez 2 h w RT lub O/N w 4 °C. Usuń paraformaldehyd, myjąc embriony dwukrotnie w 1 X PBST przez 10 min.
      UWAGA: Aby zachować fluorescencję, utrwalone embriony muszą być chronione przed światłem.
    2. Aby zachować integralność tkanek i fluorescencję, embriony inkubuje się kolejno w roztworach o rosnącym stężeniu glicerolu (10, 20, 30, 40 i 50% rozcieńczonych w 1 X PBST) przez 10 min w każdym z warunków.
      UWAGA: Utrwalone embriony można przechowywać przez kilka miesięcy w 50% glicerolu w 4 °C.
    3. Umieść embrion zatopiony w 50% glicerolu w komorze obserwacyjnej (Rycina 1B)31.
    4. Wykonaj obrazowanie przy użyciu obiektywów 40X lub 63X w mikroskopie konfokalnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Choć możliwe jest dokonywanie iniekcji w różnych miejscach anatomicznych32, iniekcje w żyłę ogonową są często stosowane w celu wywołania infekcji systemowej do późniejszych analiz, w tym eksperymentów dotyczących przeżywalności, oznaczenia ładunku bakteryjnego, aktywności fagocytozy lub tworzenia sznurów. Iniekcje w mięśnie ogona są wykorzystywane do oceny rekrutacji makrofagów w miejscu wstrzyknięcia (Rycina 3A). Aby zbadać i porównać zjadliwość wariantów R i S M. abscessus, fluoresc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Danio pręgowany stał się ostatnio doskonałym systemem modelowym kręgowców do badania dynamiki infekcji bakteryjnych przy użyciu obrazowania szerokokątnego i konfokalnego w czasie rzeczywistym36. Połączenie rozproszonych zawiesin prątków (protokół 2.2) wraz z metodami mikroiniekcji (protokół 4) umożliwia powtarzalne infekcje ogólnoustrojowe, a następnie monitorowanie i wizualizację postępu infekcji ze szczególnym uwzględnieniem interakcji bakteryjnych z makrofagami gospodarza. Zjadliwość M. abscessus <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni K. Kissie za pomocne dyskusje i dostarczenie lipo-klodronianu oraz L. Ramakrishnanowi za hojny dar pTEC27 i pTEC15, które umożliwiają ekspresję odpowiednio tdTomato i Wasabi. Praca ta jest częścią projektów Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 i DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) oraz Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (FP7-PEOPLE-2011-ITN) na podstawie umowy o grant nr. PITN-GA-2011-289209 dla sieci szkoleń wstępnych Marie-Curie FishForPharma. Pragniemy również podziękować Stowarzyszeniu Gregory Lemarchal i Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) za ufundowanie projektu C.M. Dupont.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BBL MGIT PANTABD Biosciences245114
Albumina surowicy bydlęcej Euromedex04-100-811-E
Katalaza z wątroby bydlęcej Sigma-AldrichC40
Difco Middlebrook 7H10 AgarBD Biosciences262710
Difco Middlebrook 7H9 BulionBD Biosciences271310
Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (Trikaina)Sigma-AldrichA5040
Kwas oleinowySigma-AldrichO1008
ParaformaldehydDelta Mikroskopia15710
Czerwień fenolowaSigma-Aldrich319244
Tween 80Sigma-AldrichP4780
AgarGibco Life Technologie30391-023
Niskotopliwa agarozaSigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts Aquarium Systems Inc
Kapilary ze szkła borokrzemianowego Instrument Sutter IncBF100-78-101 mm OD X 0,78 mm ID
Urządzenie do ściągania mikropipet Sutter Instrument IncFlamming/Brown Ściągacz do mikropipet p-87
MikrowtryskiwaczTritech Research Cyfrowy mikrowtryskiwacz,
pęsetaSciences Tools incDumont # M5S 
Końcówki do mikroładowarekEppendorf
Minj-D

Bibliografia

  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -L., Reyrat, J. -M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619(2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588(2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42(2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Iniekcja do ylnamikroskopia fluorescencyjnamikroskopia konfokalnadeplecja makrofag wprzygotowanie inokulum bakteryjnegotworzenie sznur woddzia ywanie gospodarz patogenpor wnanie wirulencji
Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.