Artykuł metodologiczny

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

DOI:

10.3791/53154

⸱

22 grudnia 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health and Science University, 2Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 3OHSU Center for Spatial Systems Biomedicine, Oregon Health and Science University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko (PPI) są kluczowymi zdarzeniami molekularnymi dla biologii. Wyzwaniem pozostaje jednak wizualizacja IPP z wystarczającą rozdzielczością i czułością w komórkach, ponieważ rozdzielczość konwencjonalnej mikroskopii świetlnej jest ograniczona dyfrakcją do ~250 nm. Łącząc dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną (BiFC) z mikroskopią lokalizacji aktywowanej fotoaktywem (PALM), można wizualizować IPP w komórkach z czułością pojedynczej cząsteczki i nanometrową rozdzielczością przestrzenną. BiFC jest powszechnie stosowaną techniką wizualizacji IPP z kontrastem fluorescencyjnym, która polega na rozszczepieniu białka fluorescencyjnego na dwa niefluorescencyjne fragmenty. PALM to najnowsza technika mikroskopii superrozdzielczej do obrazowania próbek biologicznych w skali nanometrowej i pojedynczej cząsteczki, która wykorzystuje fototransformowalne sondy fluorescencyjne, takie jak fotoaktywowane białka fluorescencyjne (PA-FP). BiFC-PALM został zademonstrowany przez rozszczepienie PAmCherry1, PA-FP kompatybilnego z PALM, ze względu na jego monomeryczną naturę, dobrą jasność pojedynczej cząsteczki, wysoki współczynnik kontrastu i użyteczność do pomiarów stechiometrycznych. Po rozdzieleniu na aminokwasy 159 i 160, PAmCherry1 można przekształcić w sondę BiFC, która skutecznie odtwarza się w temperaturze 37 °C z wysoką swoistością dla IPP i niską rekonstytucją nieswoistą. Oddziaływanie Ras-Raf jest używane jako przykład, aby pokazać, w jaki sposób BiFC-PALM pomaga badać interakcje w skali nanometrowej i z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki. Ich dyfuzję można również śledzić w żywych komórkach za pomocą śledzenia pojedynczych cząsteczek (smt-) PALM. W tym protokole omówiono czynniki, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania białek fuzyjnych dla BiFC-PALM, wyjaśniono etapy przygotowania próbki, akwizycji obrazu i analizy danych, a także przedstawiono kilka przykładowych wyników. Zapewniając wysoką rozdzielczość przestrzenną, swoistość i czułość, BiFC-PALM jest użytecznym narzędziem do badania IPP w nienaruszonych próbkach biologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko (PPI) są fundamentalne dla biologii1 i są ściśle regulowane przez mechanizmy czasoprzestrzenne w wielu skalach czasowych i długotrwałych. Na przykład badania nad sygnalizacją komórkową na błonie komórkowej ujawniły dynamiczne, przestrzenne przedziały w nanoskali, które ułatwiają tworzenie określonych IPP i procesów komórkowych2. W związku z tym zdolność do sondowania IPP w systemach biologicznych z wystarczającą rozdzielczością przestrzenną i czasową, wysoką specyficznością i wysoką czułością jest kluczem do osiągnięcia mechanistycznego zrozumienia biologii.

Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencyjna (BiFC) jest jednym z niewielu istniejących narzędzi do wizualizacji IPP w komórce o rozdzielczości subkomórkowej i kompatybilności z żywymi komórkami3–5. Technika jest stosunkowo prosta i polega na rozszczepieniu białka fluorescencyjnego na dwa niefluorescencyjne fragmenty; Po genetycznym przyznaczeniu do dwóch oddziałujących białek i zbliżeniu się do siebie, fragmenty mogą się odtworzyć, tworząc kompletne białko fluorescencyjne, dając sygnał fluorescencyjny. Prawidłowo zaprojektowane sondy BiFC nie powinny samoistnie odtwarzać się w przypadku braku IPP. W związku z tym sygnał fluorescencyjny w teście BiFC pojawi się tylko w obecności IPP, co umożliwia bezpośrednią wizualizację IPP o wysokiej swoistości. Dodatkowe korzyści płynące z zastosowania fluorescencji jako odczytu to między innymi wysoka czułość, rozdzielczość subkomórkowa oraz kompatybilność z testami przesiewowymi o wysokiej przepustowości i wysokiej zawartości. Aby uzyskać te korzyści, opracowano szereg sond BiFC opartych na różnych macierzystych białkach fluorescencyjnych. Podobnie jak w przypadku wszystkich innych technik detekcji opartych na konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, rozdzielczość przestrzenna BiFC jest ograniczona do ~250 nm przez dyfrakcję światła. To sprawia, że wyzwaniem jest badanie regulacji IPP w nanoskali, która, jak wspomniano wcześniej i czego przykładem są tratwy lipidowe6 i nanoklastry Ras7, jest krytyczną skalą długości dla zrozumienia wielu procesów komórkowych, takich jak sygnalizacja.

BiFC został połączony z mikroskopią lokalizacyjną aktywowaną fotoaktywowaną (PALM)8,9, aby pokonać to ograniczenie w rozdzielczości przestrzennej dla obrazowania PPI10. PALM to najnowsza technika mikroskopii superrozdzielczej, która omija granicę dyfrakcji w obrazowaniu fluorescencyjnym poprzez stochastyczną aktywację i subdyfrakcyjną lokalizację pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych. W każdym cyklu aktywacji cząsteczka fluorescencyjna emituje od kilkuset do kilku tysięcy fotonów i powoduje powstanie obrazu pojedynczej cząsteczki na detektorze. Chociaż obraz jest ograniczony dyfrakcją (~250 nm szerokości), jego środek ciężkości można określić ze znacznie większą precyzją, zwykle rzędu 10-50 nm w zależności od liczby wykrytych fotonów. Poprzez aktywację i lokalizację każdej cząsteczki fluorescencyjnej w próbce, można zrekonstruować obraz o wysokiej rozdzielczości. Prowadzony na żywych komórkach system śledzenia pojedynczych cząsteczek (smt-) PALM pozwala ponadto na uzyskanie tysięcy trajektorii dyfuzji białek z pojedynczej komórki11. Co ważne, PALM wykorzystuje specjalistyczne sondy fluorescencyjne, takie jak fotoaktywowane białka fluorescencyjne (PA-FP), aby osiągnąć aktywację stochastyczną. Ponieważ zarówno BiFC, jak i PALM wykorzystują białka fluorescencyjne, połączono je poprzez rozszczepienie PAmCherry1, powszechnie stosowanego PA-FP dla PALM, na dwa fragmenty między aminokwasami 159 i 160.

System BiFC oparty na podzielonym PAmCherry1 pokazuje niski sygnał tła z spontanicznej rekonstytucji dwóch fragmentów. Po genetycznym przypisaniu do pary oddziałujących białek, dwa fragmenty (RN = reszty 1-159; RC = Met + reszty 160-236) skutecznie odtworzone w celu wytworzenia kompletnych białek PAmCherry1 nawet w temperaturze 37 °C i bez inkubacji w niższych temperaturach, co nie ma miejsca w przypadku innych par BiFC12, takich jak macierzysty mCherry13. Co więcej, odtworzone białko PAmCherry1 zachowało właściwości fotofizyczne macierzystego białka PAmCherry1, takie jak między innymi wysoki współczynnik kontrastu, średnia wydajność fotonów i szybka fotoaktywacja, które mają kluczowe znaczenie dla dokładnej lokalizacji pojedynczej cząsteczki i obrazowania PALM w wysokiej rozdzielczości.

W tym protokole opisane jest użycie BiFC-PALM do obrazowania interakcji Ras-Raf w komórkach U2OS za pomocą podzielonego PAmCherry1 (Rysunek 1A). Pierwszym krokiem jest zaprojektowanie konstruktów do ekspresji białek fuzyjnych między fragmentami PAmCherry1 (tj. RN i RC) a białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Teoretycznie dla każdej pary białek kandydujących (A i B) do zbadania przypada osiem par białek fuzyjnych: RN-A/RC-B; RN-A/B-RC; RC-A/RN-B; RC-A/B-RN; A-RN/RC-B; A-RN/B-RC; A-RC/RN-B; oraz A-RC/B-RN. Proces ten można często uprościć, biorąc pod uwagę właściwości strukturalne lub biochemiczne białek kandydujących. W przypadku Ras białko jest modyfikowane potranslacyjnie w C-końcowym pudełku CAAX (C=Cys; A=alifatyczny; X=dowolny), po czym motyw AAX jest odcinany. W związku z tym RN lub RC mogą być połączone tylko z N-końcem Ras; zmniejsza to liczbę par białek fuzyjnych do czterech (ryc. 1B). W przypadku Raf używana jest domena wiążąca Ras (RBD; reszty 51-131), która może być oznaczona na obu końcach. Wygenerowano te cztery konfiguracje fuzji: RN-KRas/RC-Raf RBD; RN-KRas/Raf RBD-RC; RC-KRas/RN-Raf RBD; oraz RC-KRas/Raf RBD-RN.

Dodatkowo, konieczne będzie rozważenie łącznika między fragmentami a białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Często stosuje się elastyczny łącznik składający się z około dziesięciu aminokwasów, ponieważ zapewnia on wystarczającą swobodę do wystąpienia komplementacji. Jednym z takich linkerów jest (GGGGS)x2, chociaż istnieje wiele innych, które zostały z powodzeniem zastosowane, w tym losowe sekwencje generowane z wielu miejsc klonowania (MCS)14. Długość łączników może wymagać optymalizacji w zależności od wielkości badanych białek i ich orientacji podczas interakcji.

Fragmenty PAmCherry1 są zawarte w małym szkielecie klonowania z flankującymi MCS-ami (zobacz Lista materiałów). Interesujące geny można wprowadzać za pośrednictwem miejsc restrykcyjnych lub metodą niezależną od podwiązania. Po sklonowaniu i weryfikacji sekwencji, kaseta ekspresji jest przenoszona do wektora ekspresji za pomocą reakcji rekombinazy, procesu klonowania o wysokiej wierności i wysokiej wydajności.

Następnie, wynikowe konstrukcje wyrażeń są transfekowane do docelowej linii komórkowej lub, jeśli pożądana jest stabilna linia komórkowa, pakowane w lentiwirusa w celu zainfekowania docelowej linii komórkowej. Transfekcja przejściowa pozwala na szybką walidację konfiguracji BiFC, ale należy zwrócić uwagę na potencjalne problemy. Transfekcja przy użyciu chemikaliów często obciąża komórki, powodując wysoką autofluorescencję; podczas gdy zastosowanie mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) może złagodzić ten sygnał tła poprzez ograniczenie objętości oświetlenia, TIRF jest idealny, gdy IPP zachodzą na błonie komórkowej. Dodatkowo, przejściowe transfekcje często prowadzą do wysokich poziomów ekspresji białek, znacznie przekraczających poziomy białek endogennych, co może powodować artefakty w wykrywaniu IPP. W związku z tym zaleca się ustanowienie stabilnych linii komórkowych po ustaleniu odpowiedniej konfiguracji BiFC w wyniku wstępnych testów. Stabilne linie komórkowe mają również potencjał do przestrajalnej ekspresji poprzez indukcję doksycykliny15.

Po infekcji, komórki są selekcjonowane antybiotykami, zazwyczaj puromycyną i neomycyną, po jednym dla każdego konstruktu. Kolejne etapy przygotowania próbki, akwizycji obrazu i analizy danych zostaną szczegółowo opisane w protokołach.

Dzięki takiemu podejściu, rutynowo obserwuje się tworzenie nanoskalowych klastrów na obrazach BiFC-PALM RBD Ras-Raf (Rysunek 2A). Konsekwentnie, trajektorie smt-PALM RBD Ras-Raf wykazują niejednorodny rozkład w stanach dyfuzji (Rysunek 2B-D). Wyniki te sugerują, że kompleksy Ras-Raf istnieją w wielu stanach na błonie komórkowej, prawdopodobnie jako monomery i klastry, z potencjalnymi implikacjami biologicznymi. Praca ta demonstruje moc BiFC-PALM w selektywnym obrazowaniu IPP w komórkach o nanometrowej rozdzielczości przestrzennej i czułości pojedynczej cząsteczki, co byłoby trudne do uzyskania przy użyciu konwencjonalnego BiFC, kolokalizacji fluorescencji lub transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET).

Podczas projektowania eksperymentów BiFC i interpretacji wyników, ważne jest, aby pamiętać, że proces BiFC jest nieodwracalny w większości przypadków, w tym w podziale PAmCherry1. Gdy te dwa fragmenty połączą się i utworzą kompletne białko PAmCherry1, połączenie między dwoma fragmentami, a tym samym PPI, staje się trwałe. Ogranicza to stosowanie BiFC i BiFC-PALM do monitorowania dynamiki IPP (tj. kinetyki wiązania, a nie dynamiki dyfuzji kompleksu białkowego po jego utworzeniu), a czasami może nawet prowadzić do nieprawidłowej lokalizacji kompleksów IPP.

Dodatkowym czynnikiem do rozważenia przy projektowaniu eksperymentów BiFC-PALM jest opóźnienie w dojrzewaniu chromoforu, które jest nieodłącznym elementem białek fluorescencyjnych. Gdy dwa białka wchodzą w interakcję i fragmenty FP łączą się, zazwyczaj ponownie się składają w ciągu kilku sekund (czas połowicznego zaniku 60 sekund dla EYFP3). Jednak późniejsze dojrzewanie chromoforu i sygnał fluorescencyjny rozwijają się rzędu minut. Podczas gdy fluorescencja może być wykrywalna w ciągu 10 minut po odtworzeniu rozszczepionej Wenus, szybko składającego się wariantu YFP, czas połowicznego dojrzewania wynosi często około 60 minut16. Zaobserwowano, że Split-PAmCherry1 ma podobne wskaźniki. W związku z tym BiFC i BiFC-PALM są obecnie złym wyborem do monitorowania kinetyki PPI w czasie rzeczywistym; inne metody, takie jak FRET i niedawno opracowane białko fluorescencyjne17 zależne od dimeryzacji, mogą być bardziej odpowiednie do tego celu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonowanie

  1. Określ konfiguracje do sklonowania i wybierz konsolidator. Oznacz białka fragmentami na końcu N lub C, jak opisano poniżej, aby nie zakłócały ich prawidłowej lokalizacji. Użyj elastycznego konsolidatora, takiego jak (GGGGS)x2.
  2. Genetycznie znakuj białka będące przedmiotem zainteresowania fragmentami PAmCherry1. Jako jedną z opcji użyj plazmidów klonujących wymienionych na liście materiałów zawierających fragmenty RN (reszty PAmCherry1 1-159) i RC (Met plus reszty PAmCherry1 160-236) z flankującymi sekwencjami MCS.
    1. Linearyzuj plazmidy zawierające fragmenty RN i RC za pomocą odwrotnego PCR (lub trawienia restrykcyjnego) w miejscu insercji. Startery do odwróconej reakcji PCR wymieniono w Tabeli 1. Poniżej znajduje się przykładowy protokół PCR używany w laboratorium autora (zobacz Lista materiałów, aby zapoznać się z dokładnymi materiałami użytymi w tym protokole).
      1. Wymieszać ze sobą reakcję PCR, doprowadzić do końcowej objętości 50 μl z wodą: do cienkościennej probówki PCR dodać wodę, 25 μl 2x mieszanki wzorcowej, po 0,5 μl każdego ze starterów do przodu i do tyłu (20 μM rozcieńczony bulion, 0,2 μM stężenie końcowe) i 1 ng matrycy. Stosować następujące warunki cyklu: 98 °C przez 30 sekund, 30 cykli w temperaturze 98 °C przez 7 sekund i 68 °C przez 2 minuty oraz końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut.
    2. PCR geny będące przedmiotem zainteresowania do insercji do zlinearyzowanych plazmidów zawierających fragmenty RN i RC. Przeprowadzić PCR jak w kroku 1.2.1 z czasem przedłużenia w temperaturze 68 °C. Użyj starterów z nawisami, które zawierają elastyczną sekwencję łącznika, taką jak GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGGGGGAAGT dla (GGGGS)x2 i homologia 15 par zasad do końców zlinearyzowanych plazmidów RN i RC w celu rekombinacji.
      Uwaga: Zwisy starterów dla badanych białek przedstawiono w Tabeli 2 w przypadku użycia starterów z Tabeli 1 do linearyzacji szkieletu plazmidu.
    3. Strawić reakcję PCR za pomocą Dpn1, aby wyeliminować matrycę PCR. Dodać 0,5 μl Dpn1 (20 U/μl) bezpośrednio do 50 μl reakcji PCR. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i podgrzewać w temperaturze 80 °C przez 20 minut. Jeśli szablon tła utrzymuje się w późniejszych krokach, zwiększ ilość enzymu lub wydłuż czas trawienia.
    4. Oczyść produkty PCR za pomocą kolumny wirowej zgodnie z opisem producenta.
    5. Wykonaj reakcję niezależną od ligacji, aby połączyć zlinearyzowany plazmid zawierający fragment RN lub RC z interesującym genem. Zmierzyć stężenie oczyszczonych produktów PCR: połączyć 50 ng zlinearyzowanego plazmidu i 50 ng interesującego genu z 1 μl premiksu enzymatycznego i doprowadzić całkowitą objętość do 5 μl za pomocą wody dejonizowanej. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 15 minut, umieścić na lodzie i dodać 20 μl buforu TE.
    6. Przekształć rekombinowane plazmidy w kompetentne bakterie18.
    7. Wybierz 2-4+ (według uznania) kolonie do hodowli O/N. Dodać 5 ml bulionu LB i 5 μl kanamycyny (50 mg/ml bulionu) do 14 ml polipropylenowej probówki okrągłodennej i dodać wybraną kolonię bakterii za pomocą wysterylizowanej pętli zaszczepiającej. Inkubować w temperaturze 37 °C O/N, wytrząsając z prędkością 225 obr./min.
    8. Zamrozić 1 ml kultury O/N dla glicerolu19 i miniprzygotować pozostałą część zgodnie z opisem producenta.
    9. Wykonaj sekwencjonowanie, aby określić dobry klon. Jeśli używasz plazmidów klonujących z Listy Materiałów, użyj starterów M13 do przodu i do tyłu (w oddzielnych reakcjach), jeśli to konieczne, aby uzyskać pełną sekwencję konstruktu fuzyjnego. Porównaj z oczekiwaną sekwencją za pomocą narzędzia do wyrównywania, takiego jak BLAST z National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
    10. Przenieś zweryfikowane sekwencyjnie konstrukty do plazmidu ekspresyjnego poprzez reakcję rekombinazy.
      1. Dodać 75 ng docelowego plazmidu – takiego jak pcDNA do przejściowych transfekcji lub pLenti do pakowania lentiwirusowego20 – i 50 ng rekombinowanego plazmidu klonującego do 1 μl premiksu enzymatycznego i zwiększyć całkowitą objętość do 5 μl za pomocą wody dejonizowanej. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę, następnie dodać 5 μl buforu TE.
        Uwaga: W przypadku pakowania lentiwirusa i stabilnego generowania linii komórkowych należy użyć innego plazmidu docelowego dla każdego konstruktu, na przykład jednego z opornością na puromycynę, a drugiego neomycyny. Pozwala to na podwójną selekcję transdukowanych komórek. Należy również wziąć pod uwagę promotor dla każdego z nich, taki jak konstytutywny promotor wirusa cytomegalii (CMV) dla wysokich poziomów ekspresji lub CMV z operatorem TetO dla regulowanej ekspresji doksycykliny.
      2. Przekształć 5 μl w kompetentne bakterie i miniprzygotuj plazmidy, jak w krokach od 1.2.6 do 1.2.8, ale przy użyciu odpowiedniego antybiotyku (zwykle ampicyliny).
  3. Określ optymalną konfigurację BiFC.
    1. Plazmidy o ekspresji kotransfekcyjnej do komórek U2OS (lub komórki z wyboru).
      1. Dodaj 350 μl fenolu DMEM bez czerwieni i antybiotyków, uzupełnionego 10% FBS do każdej studzienki 8-dołkowego szkiełka z dolną komorą #1,5. Płytka około 7,5 x 104 komórki na studzienkę, tak aby komórki były około 70% -90% zlewające się następnego dnia.
      2. Dzień po posiewie, plazmidy ekspresyjne o współtransfekcji o różnych konfiguracjach w każdym dołku przy użyciu preferowanego odczynnika i zgodnie z opisem producenta.
        1. Do każdej studzienki dodać 125 ng każdego plazmidu ekspresyjnego do 50 μl zredukowanego podłoża bez surowicy w probówce o pojemności 0,6 ml i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać. Dodać 1 μl odczynnika do transfekcji w dół środka probówki i bezpośrednio do podłoża. Delikatnie zamieszać do wymieszania i pozostawić reakcję na 30 minut.
        2. Zmniejsz zawartość pożywki w każdym dołku szkiełka komory o około połowę. Dodaj mieszaninę transfekcji kroplami do studzienek i delikatnie wstrząśnij, aby wymieszać. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24–48 godzin. Zmień pożywkę następnego dnia po transfekcji.
    2. Obrazowanie komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym jak w Protokole 2, zaczynając od kroku 2.1.4.
      Uwaga: Próbka może być zobrazowana na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym, jeśli poziomy ekspresji są wysokie, a kamera jest wystarczająco czuła dla stosunkowo niskiej emisji fotonów PAmCherry1. Rozpuszczone cząsteczki PAmCherry1 mogą być aktywowane za pomocą zestawu filtrów ultrafioletowych (405 nm) przed obrazowaniem za pomocą zestawu filtrów do zielonego wzbudzenia (561 nm).
  4. W stosownych przypadkach należy stworzyć kontrolę ujemną, na przykład poprzez wprowadzenie mutacji punktowej do jednego z białek będących przedmiotem zainteresowania, która zakłóca interakcję. Przeprowadzić mutagenezę ukierunkowanąna miejsce 21 na plazmidzie klonującym białko, które ma być zmutowane i o wybranej konfiguracji.
  5. Wygeneruj stabilną linię komórkową, pakując konstrukty w cząsteczki wirusa i infekuj komórki U2OS (lub linię komórkową z wyboru). Należy rozważyć indukowalny (tetracyklinowy) system ekspresji15, aby można było indukować ekspresję przed obrazowaniem, jeśli problemem jest przedłużająca się nieodwracalność BiFC lub jeśli pożądana jest dostrajalna ekspresja.
    UWAGA: Praca z wirusami jest klasyfikowana jako poziom bezpieczeństwa biologicznego 2. Chociaż ostatnie generacje systemów pakowania wirusów znacznie zmniejszyły prawdopodobieństwo wytworzenia wirusów zdolnych do replikacji, pewne zagrożenia są nadal obecne. Referencje można znaleźć pod adresem http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.
    1. Powtórz krok 1.2.10, używając docelowego wektora soczewicy lub retrowirusa20. Zwiększ kulturę O/N do 100 ml w celu uzyskania midiprepu i większej czystości plazmidów.
    2. W dniu 1: Umieść około 2 x 106 komórek 293T/17 w 10-centymetrowym naczyniu dla każdej konstruktu, która ma być zapakowana.
    3. Dzień 2: Przygotować reakcję transfekcji przy użyciu wybranego odczynnika do transfekcji, zgodnie z opisem producenta.
      1. Przygotować premiks plazmidów do pakowania o końcowych stężeniach 250 ng/μl do pakowania plazmidów 1 i 2 oraz 100 ng/μl do pakowania plazmidu 3 w sterylnej wodzie. Dodać 10 μl premiksu plazmidu do pakowania i 2,5 μg plazmidu docelowego do 1 ml zredukowanej pożywki bez surowicy w 5 ml probówce okrągłodennej z polipropylenu i pipetować w górę iw dół w celu wymieszania. Dodać 20 μl odczynnika do transfekcji w dół środka probówki i bezpośrednio do podłoża.
        1. Delikatnie mieszać do mieszania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Usunąć około połowy pożywki z komórek i dodać mieszaninę transfekcji kroplami. Wstrząsnąć delikatnie do wymieszania i inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 . Inkubować 10 ml pożywki na płytkę w probówce z poluzowaną nakrętką w celu uzyskania temperatury i wyrównania CO2 .
      2. W dniu 3: Delikatnie zmień pożywkę na wstępnie inkubowaną pożywkę i włóż komórki z powrotem do inkubatora. Inkubować kolejną probówkę z pożywką z poluzowaną nasadką.
        Uwaga: Syncytia, czyli tworzenie się dużych komórek wielojądrowych, może być znakiem, że opakowanie idzie dobrze. Jednak komórki są w stanie kruchym i można je łatwo odłączyć. Podczas wymiany pożywki należy przechylić pipetor tak, aby znajdował się w pozycji poziomej i dodawać pożywkę kroplami do jednej krawędzi płytki.
      3. Dzień 4: Zbierz wirusa, usuwając pożywkę za pomocą strzykawki i filtrując przez filtr o wielkości porów 0,45 μm do czystej probówki o pojemności 50 ml. Delikatnie zastąp pożywkę wstępnie inkubowaną pożywką.
      4. W dniu 5: Zebrać ponownie, jak to zrobiono wcześniej w kroku 1.5.3.3 i połączyć zwykły filtrat w tej samej probówce o pojemności 50 ml. Dodać 6 ml koncentratora wirusów do każdej probówki i wymieszać. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny, aż wirus się wytrąci.
        Uwaga: W zależności od stanu zdrowia komórek, wirus może zostać pobrany po raz trzeci.
      5. Zagęścić wirusa przez odwirowanie w temperaturze 1 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 μl pożywki. Wirus może być natychmiast wykorzystany do zakażenia lub przechowywany w 50 μl podwielokrotności w temperaturze -80 °C przez okres do jednego roku.
      6. Umieść około 3 x 105 komórek U2OS (lub docelowych) na studzience na płytce 6-dołkowej (2 ml DMEM z 10% FBS na studzienkę) w celu infekcji, tak aby komórki były w około 50% zlewające się w momencie infekcji.
      7. Następnego dnia usuń około połowy podłoża, tak aby pozostało około 1 ml. Współinfekować 50 μl skoncentrowanego wirusa dla każdego konstruktu. Dodać 1 μl polibrenu (8 mg/ml) do każdego dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmień pożywkę następnego dnia i inkubuj jeszcze jeden dzień przed wyborem antybiotyku.
        Uwaga: Ilość wirusa do dodania może się różnić w zależności od pożądanego wskaźnika infekcji. Wirusy można miareczkować za pomocą qRT-PCR.
      8. Dodaj antybiotyki, aby wybrać zakażone komórki. Oddzielne studzienki z niezainfekowanymi komórkami, które nie widziały wirusa, są wymagane jako kanarki w celu przetestowania skuteczności selekcji. Inkubować przez 2-7 dni lub do zakończenia selekcji.
        Uwaga: Skuteczne stężenia należy początkowo miareczkować, ale zazwyczaj wynoszą one 1,0 μg/ml dla puromycyny i 1,0 mg/ml dla neomycyny.
      9. Rozwiń komórki do większego 10-centymetrowego naczynia i przejdź do Protokołu 2.

2. Obrazowanie stałych komórek

  1. Przygotowanie próbki do obrazowania
    1. Wyczyść 8-dołkowe szkiełko komorowe #1.5 ze szklanym dnem, dodając 250 μl 1 M NaOH przez co najmniej 1 godzinę i dokładnie umyj PBS.
      Uwaga: Nieobrobione szkiełka komory zazwyczaj powodują wysoki sygnał tła. Dodatkowo ogniwa mogą być wrażliwe na resztki NaOH, a brak dokładnego oczyszczenia powierzchni szkła (nawet 10-krotne mycie) może utrudnić przyleganie komórek. W razie potrzeby po umyciu inkubować oczyszczone szkiełko komorowe z PBS O/N. W przypadku wrażliwych linii komórkowych pomocne może być posiewanie o większej gęstości (np. przy początkowej konfluencji 50%-60%).
    2. Płytka około 5,5 x 104 stabilnych komórek ekspresyjnych U2OS na studzienkę w 350 μl DMEM wolnego od czerwieni fenolowej z 10% FBS, aby komórki były zdrowe i nie zlewały się nadmiernie podczas obrazowania.
    3. Wykonaj niezbędne zabiegi do eksperymentu, takie jak dodanie tetracykliny w celu wywołania ekspresji białka.
    4. Napraw komórki bezpośrednio przed obrazowaniem.
      1. Przed utrwaleniem należy przygotować świeży roztwór paraformaldehydu (PFA) — 3,7% PFA w 1x PHEM z 0,1% aldehydem glutarowym (GA). W przypadku 10 ml roztworu PFA odważyć 0,37 g PFA i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 ml wody destylowanej i 30 μl 1 M NaOH i odwirować. Podgrzewać w temperaturze 70 °C i wirować co 1-2 minuty, aż PFA całkowicie się rozpuści.
      2. Przenieś rozpuszczony PFA do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodaj 3,8 ml wody destylowanej, 5 ml 2x buforu PHEM, 20 μl 25% aldehydu glutarowego i wiruj do wymieszania. Zapasowy, 2x bufor PHEM to 120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA i 16 mM MgSO4, o pH dostosowanym do 7,0 przy 10 M KOH. Roztwór utrwalający może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka dni.
        UWAGA: PFA i GA są niebezpieczne. Przygotuj roztwór w dygestoriach i noś odpowiedni sprzęt ochronny podczas obchodzenia się z obiema substancjami chemicznymi. Unikać wdychania lub bezpośredniego kontaktu ze skórą.
      3. Usuń podłoże wzrostowe. Szybko przemyć 500 μl PBS i dodać 250 μl utrwalacza PFA do dołka. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Usunąć utrwalacz PFA z próbki i dodać 350 μl PBS lub buforu do obrazowania (100 mM Tris z 30 mM NaCl i 20 mM MgCl2, pH 8,5) do dołka.
    6. Wiruj cząsteczki złota o długości 100 nm, aby rozbić agregaty i dodaj 35 μl na studzienkę (10x końcowe rozcieńczenie) w celu śledzenia dryfu etapu podczas obrazowania.
  2. Uzyskiwanie obrazów
    1. Włącz mikroskop. Włącz lasery 405 i 561 nm, ale w tym momencie nie zamykaj żaluzji (wewnętrznych lub zewnętrznych). Włącz kamerę EMCCD i pozwól jej ostygnąć. Upewnij się, że filtry 561 nm są na swoim miejscu.
    2. Otwórz oprogramowanie do akwizycji i ustaw czas ekspozycji na 100 ms, a wzmocnienie EMCCD na 300 (zakres 1 – 1,000).
    3. Dodaj olejek immersyjny do obiektywu i przymocuj próbkę do stolika mikroskopowego.
    4. Przy włączonym jasnym polu lub laserze 561 nm (~1 kW/cm2) ustawić ostrość próbki.
    5. Do obrazowania Ras i innych białek błonowych należy użyć apochromatycznego obiektywu TIRF 60X z aperturą numeryczną 1,49 i ustawić mikroskop w konfiguracji TIRF. Wyreguluj laser wzbudzający tak, aby był wyśrodkowany po uderzeniu w tylną aperturę obiektywu TIRF; Powoduje to odchylenie lasera po dotarciu do próbki. Kontynuuj regulację lasera, aż zostanie osiągnięty krytyczny kąt, a laser zostanie odbity z powrotem. Wyszukaj komórkę do zobrazowania z kilkoma cząsteczkami złota w polu widzenia. Ustaw obszar zainteresowania, który otacza komórkę (lub obszar w komórce) i cząsteczki złota.
      Uwaga: TIRF zmniejsza głębokość penetracji lasera wzbudzającego i redukuje nieostry sygnał tła. Ponadto korekta dryfu będzie prawdopodobnie dokładniejsza, gdy w polu widzenia jest więcej cząstek złota.
    6. Jeśli to możliwe, włącz system autofokusa, aby skorygować dryft próbki w kierunku z. W przeciwnym razie należy ręcznie wyregulować ostrość podczas akwizycji, jeśli obraz jest nieostry.
    7. Rozpocznij akwizycję przy wyłączonym laserze 405 nm i włączonym laserze 561 nm (~1 kW/cm2) w przypadku, gdy następuje już wystarczająca aktywacja (zwykle jeśli poziomy ekspresji są wysokie). W przeciwnym razie włącz laser 405 nm przy najniższym fabrycznym ustawieniu mocy (0,02 mW lub 0,01 W/cm2) i stopniowo zwiększaj (0,1 mW na raz) w razie potrzeby, aż w jednej klatce będzie kilkadziesiąt cząsteczek lub tak, aby pojedyncze cząsteczki były dobrze oddzielone.
    8. W miarę kontynuowania zbierania danych stopniowo zwiększaj moc lasera 405 nm, aby utrzymać gęstość plamki na mniej więcej stałym poziomie.
      Uwaga: Przy niższej mocy wzbudzenia 405 nm niektóre PAmCherry1 mogą być już aktywowane. W miarę jak te cząsteczki fotowybielają, populacja pozostałych fotoaktywowanych cząsteczek PAmCherry1 zmniejsza się, co wymaga większego strumienia fotonów, aby utrzymać tę samą gęstość cząsteczek emitujących fluorescencję w każdej klatce.
    9. Kontynuuj akwizycję obrazu, aż wysoka moc 405 nm (2,5 – 10 W/cm2) nie aktywuje więcej zdarzeń aktywacji.
      Uwaga: Całkowity czas akwizycji zależy od poziomu ekspresji i skuteczności uzupełnienia.
  3. Przetwarzanie obrazów
    Uwaga: Istnieje wiele opcji oprogramowania open source do przetwarzania obrazu. Przykładami są ThunderSTORM (https://code.google.com/p/thunder-storm/) i QuickPALM (https://code.google.com/p/quickpalm/). Typowe procedury przetwarzania danych są tutaj pokrótce zilustrowane na przykładzie niestandardowego pakietu Matlab o nazwie wfiread do przetwarzania danych PALM. Jednak przyszłe zmiany mogą nie być dokładnie zgodne z tym, co opisano tutaj. Informacje na temat przetwarzania obrazu za pomocą innego oprogramowania można znaleźć w dokumentacji użytkownika.
    1. Pobierz oprogramowanie do przetwarzania obrazu (plik z kodem uzupełniającym) lub najnowszą wersję ze strony http://www.ohsu.edu/nan. Otwórz Matlab i załaduj oprogramowanie wfiread (które jest już umieszczone w domyślnej ścieżce).
    2. Wyświetl sekwencję obrazów RAW i określ obszar zainteresowania. Wybierz obszar stosu do przetworzenia, klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając ramkę wokół żądanego obszaru. Jeśli obszar zainteresowania nie został zmniejszony podczas akwizycji (do około 256 x 256 pikseli), wybierz mniejszy obszar, aby skrócić czas obliczeń. Aby usunąć zaznaczenie obszaru i przetworzyć całą ramkę, kliknij prawym przyciskiem myszy w dowolnym miejscu obrazu.
    3. Wprowadź zakres ramek do przetworzenia.
    4. Wybierz cząstkę złota (taką, która jest odizolowana i ma jednolity kształt), klikając obraz lewym przyciskiem myszy i przeciągając wokół niego małe pole. W obszarze Śledzenie cząstek kliknij przycisk Śledź. Pojawi się wykres pokazujący położenie wybranej cząstki złota w stosie obrazów, przedstawiający zakres dryfu.
    5. Powtórz ten proces, aby śledzić jak najwięcej cząstek złota i określić te, które podążają razem (cząstki będą oznaczone kolorami). Idealnie byłoby, gdyby ogólny dryf był rzędu co najwyżej jednego piksela.
    6. Pojedynczo wybierz cząsteczki złota, które śledziły się razem, pojedynczo i kliknij przycisk Dodaj znacznik w obszarze Śledzenie cząstek. Pojawi się zielony krzyżyk oznaczający, że został dodany jako znacznik i będzie używany do korygowania dryfu.
    7. W razie potrzeby dostosuj zakres Sigma, zakres wygładzania i próg, nieznacznie zmieniając wartości. Kliknij przycisk Znajdź cząstkę, aby przetestować ustawienia. Cząstki, które zostaną przetworzone, zostaną zapakowane w pudełko, a te, które nie zostaną przetworzone, zostaną pominięte. Należy wybrać cząsteczki PAmCherry1, cząsteczki, które są stosunkowo okrągłe i jasne.
    8. Rozpocznij przetwarzanie obrazów, klikając przycisk Utwórz plik współrzędnych i zapisz plik.
      Uwaga: Program przejdzie przez każdą klatkę w zdefiniowanym zakresie ramek, znajdzie wszystkie punkty fluorescencyjne i wykona dopasowanie gaussowskie, aby znaleźć współrzędne środka ciężkości. Zostanie wygenerowany plik .cor przechowujący wszystkie współrzędne i inne pasujące parametry przetwarzanych obrazów pojedynczej cząsteczki.
  4. Przetwarzanie końcowe obrazów i renderowanie obrazu PALM
    Uwaga: Inne programy mogą bezpośrednio renderować obraz po wyodrębnieniu współrzędnych.
    1. W Matlabie uruchom pakiet "palm" i załaduj właśnie utworzony plik .cor.
    2. Przed renderowaniem obrazu PALM przy użyciu współrzędnych posortuj poszczególne współrzędne (każda z nich pochodzi ze zdarzenia lokalizacyjnego). Optymalne wartości sortowania mogą się różnić w zależności od konfiguracji i fluoroforu.
      1. W przypadku PAmCherry1 użyj następujących wartości: Łączenie klatki — 8; Odległość łączenia (nm) - 100; Minimalna wartość skuteczna - 4; minimalna wartość dopasowania - 0,25; i Max. Mimośród - 1,4. Zapoznaj się z sekcją Dyskusja, aby uzyskać dodatkowe wyjaśnienie tych parametrów.
    3. Kliknij przycisk Sortuj, aby wygenerować nowy zestaw współrzędnych gotowych do renderowania obrazów w wysokiej rozdzielczości.
    4. Wprowadź wartości zapewniające prawidłowe renderowanie obrazu końcowego, takie jak rozmiar surowego piksela (nm), żądany rozmiar elementu (nm) w renderowanym obrazie i rozmiar piksela renderowanego obrazu.
      Uwaga: Rozmiar surowych pikseli musi być określony dla każdej konfiguracji. Rozmiar renderowanego obiektu można ustawić dowolnie, ale zazwyczaj jest on ustawiany na wartość nieco wyższą niż średnia precyzja lokalizacji. W przypadku PAmCherry1 średnia precyzja lokalizacji wynosi około 18 nm, więc rozmiar elementu 20 – 30 nm jest odpowiedni. Warto zauważyć, że precyzja lokalizacji została obliczona, biorąc pod uwagę odchylenie standardowe lokalizacji tej samej cząsteczki w wielu ramkach22, a nie dzieląc granicę dyfrakcji przez pierwiastek kwadratowy z wykrytej liczby fotonów. Jeśli chodzi o rozmiar piksela renderowanego obrazu, 10 nm jest dobrym punktem wyjścia; Ustawienie tej wartości zbyt nisko spowoduje, że pliki obrazów będą niepotrzebnie duże dla niepowiększonych widoków.
    5. Kliknij przycisk Renderuj, aby wygenerować obraz PALM. Użyj ikon powiększających +/- na pasku narzędzi okna rysunku, aby powiększyć lub pomniejszyć.
    6. Opcjonalnie: Wykonaj analizę skupień zrekonstruowanego obrazu PALM za pomocą testu K Ripleya lub innych mechanizmów, takich jak wspomagany symulacją DBSCAN (SAD)23. Uwaga: W niestandardowym pakiecie dłoni zarówno analiza K, jak i SAD Ripleya są już wbudowane; W przypadku współrzędnych wygenerowanych z innego oprogramowania te same analizy mogą być wykonywane za pomocą dodatkowych niestandardowych skryptów.

3. Śledzenie pojedynczych cząsteczek w żywych komórkach

  1. Poddać działaniu powierzchnię hodowli tkankowej i umieścić komórki na płytce zgodnie z opisem w Protokole 2. Ponieważ etap kontrolowany temperaturą i/lub CO2 może wymagać określonej płytki hodowlanej, upewnij się, że szkło nakrywkowe ma odpowiednią grubość (0,17 mm) do konfiguracji mikroskopowej.
    1. Komórki transfekcyjne, jeśli dokonują przejściowej ekspresji, i wykonać wszelkie zabiegi potrzebne do eksperymentu, takie jak tetracyklina w celu wywołania ekspresji, i w razie potrzeby inkubować. Jest to również takie samo, jak opisano w Protokole 2.
    2. Umieść naczynie hodowlane w inkubatorze na etapie. Pozostaw naczynie na scenie na kilka minut, aż temperatura i stężenie CO2 ustabilizują się za każdym razem po zamontowaniu szalki hodowlanej lub przeniesieniu do nowego obszaru zainteresowania. Na tym etapie zablokuj lasery. Jeśli kontrola CO2 nie jest dostępna, zmień na niezależną pożywkę CO2 tuż przed obrazowaniem, taką jak L-15.
      firmy Leibovitz Uwaga: Pożywka wolna od czerwieni fenolowej jest zalecana do obniżania fluorescencji tła.
  2. Pobieraj obrazy jak w Protokole 2. Należy jednak ustawić odpowiedni czas ekspozycji (zwykle 25-50 ms dla PAmCherry1).
    Uwaga: Gęstość cząsteczek musi być mniejsza niż w przypadku komórek stałych, tak aby trajektorie mogły być rejestrowane bez nakładania się na siebie. Określone kilkadziesiąt cząsteczek jest typowe dla akwizycji pikseli 256x256 przy rozmiarze piksela około 160 nm. Gęstość mocy lasera 561 nm została ustawiona na 0,8 kW/cm2, aby utrzymać dobry stosunek sygnału do szumu, jednocześnie zmniejszając fototoksyczność dla komórek i zwiększając średnią długość trajektorii.
  3. Przetwórz obrazy.
    1. Wyodrębnij współrzędne pojedynczych cząsteczek za pomocą pakietu wfiread, jak opisano w Protokole 2, lub za pomocą innego pakietu.
    2. Rekonstrukcja trajektorii pojedynczych cząstek przy użyciu różnych pakietów śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) w oparciu o różne algorytmy znalezione w innych miejscach24. Uwaga: Alternatywnie, ten krok można wykonać za pomocą domowego pakietu Matlab (prawdopodobnie dostępnego w przyszłych wersjach pod adresem http://www.ohsu.edu/nan.
    3. Opcjonalnie: Po rekonstrukcji należy użyć pakietu SPT24 do obliczenia stałych przemieszczenia i dyfuzji na podstawie trajektorii. Dodatkowo użyj wariacyjnego śledzenia pojedynczych cząstek Bayesa (vbSPT)25, aby określić stany dyfuzji docelowych białek. Pakiet vbSPT Matlab i dokumentację można znaleźć na oficjalnej stronie Sourceforge: http://vbspt.sourceforge.net/.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazany przykład BiFC-PALM to mutacja KRas G12D oddziałująca z domeną wiążącą Ras (RBD) CRaf (Rysunek 1A). Jak wspomniano, fragmenty RN lub RC nie zostały oznaczone do C-końca Ras, ponieważ zakłóciłoby to lokalizację błony, a tym samym aktywność biologiczną Ras. Zmniejszyło to liczbę możliwych kombinacji z ośmiu do czterech (rysunek 1B). Każda z tych czterech kombinacji została wprowadzona do komórek U2OS za pomocą infekcji lentiwirusowej. Komórki zostały naprawione zgodnie z opisem w p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BiFC jest powszechnie stosowaną techniką wykrywania i wizualizacji IPP w komórkach, podczas gdy PALM jest najnowszą techniką mikroskopii superrozdzielczej pojedynczej cząsteczki, która umożliwia obrazowanie w nanoskali nienaruszonych próbek biologicznych. Połączenie BiFC z PALM pozwoliło na uzyskanie selektywnego obrazowania IPP wewnątrz komórki z nanometrową rozdzielczością przestrzenną i czułością pojedynczej cząsteczki. BiFC-PALM rozszerza użyteczność obu technik i, jak wykazano w niniejszej pracy, jest bardzo obiecuj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują doktorom Stevenowi Chu i Joe W. Grayowi za pomocne dyskusje, Henry'emu Marrowi za jego początkową pracę nad projektem BiFC-PALM oraz Alexis Shoemaker za pomoc techniczną. Prace te są wspierane przez fundusze startowe dla X.N. z OHSU. Badania w laboratorium Nan były również wspierane przez NIH 5U54CA143836-05, Fundację Badań nad Rakiem Damona Runyona, M. J. Murdock Charitable Trust oraz firmę FEI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ramka mikroskopuNikonTi-U 60X
zanurzeniowy w oleju Obiektyw TIRF z 1,49 NANikonCFI Apo TIRF 60x H
Kamera EMCCDLaser AndoriXon Ultra 897
561 nmOpto EngineMGL-FN-561
405 nm laserCoherentCUBE-405 50mW
561 nm lustrodichroiczneSemrock  Di01-R405/488/561/635-25x36
Filtr 561 nmSemrockFF01-525/45-25
405/561 nm filtr wycinającySemrockNF01-405/488/568-25
Temperatura i CO2 stopień kontrolowanyTokai HitINUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCSAddgene60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCSAddgene60546
pcDNA3.2-DESTLife Technologies12489-019
pLenti-DESTAddgenehttp://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseThermo ScientificF-531
In-Fusion HD KlonowanieClontech639649
LR ClonaseLife Technologies11791
Vira Power Lentivirus PackagingLife TechnologiesK497500
Odczynnik do transfekcji X-tremeGENERoche13873800
Lab-Tek II Komorowe szkło nakrywkoweThermo Scientific155409#1,5 szklane dno
Ogniwa U2OS OgniwaATCCHTB-96
293T/17ATCCCRL-11268
DMEM z czerwienią fenolowąLife Technologies11995
DMEM bez czerwieni fenolowejLife Technologies21063
Surowica bydlęcaLife Technologies10082
Leibovit's L-15, bez czerwieni fenolowejLife Technologies21083-027
Zredukowana surowicaTechnologie życia31985
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiTechnologies14040
StrzykawkaBD Biosciences309604
Filtr strzykawkowyKoncentrator MilliporeSLHV033RB
LentiviralClontech631231
Koncentrator retrowirusowyClontech631455
10 cm kultura danieBD Biosciences353003
6-dołkowa płytkahodowlana BD Biosciences353046
PolybreneSigma107689
PuromycinLife TechnologiesA11138
G-418Calbiochem345812Neomycyna
DoksycylinaFisherBP2653
BazaTrisFisherBP152
EDTASigmaEDS
Wodorotlenek soduSigmaS5881
ParaformaldehydSigma158127
Aldehyd glutarowySigmaG6257
RURYSigmaP6757
HEPESSigmaH4034
EGTASigma3777
Siarczan magnezuSigmaM2643
Wodorotlenek potasuSigma221473
Chlorek soduFisherBP358
Chlorek magnezuFisherM33
100 nm cząsteczki złotaBBI SolutionsEM. GC100
Woda molekularnaLife Technologies10977
Dpn1New England BiolabsR0176
Zestaw do oczyszczania PCRQiagen28104
Zestaw miniprepQiagen27104
Zestaw MidiprepMacherey-Nagel740410
0,6 ml probówki do mikrowirówekFisher05-408-120
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlFisher05-408-137
Probówki 15 mlFisher05-539-12
Probówki okrągłodenne z polipropylenu o pojemności 5 mlBD Biosciences352063
14 ml probówki okrągłodenne z polipropylenuBD Biosciences352059
Probówka 50 mlBD Biosciences352070
Probówka PCRGeneMateC-3328-1
SOC mediumLife Technologies15544
LB bulionBD Biosciences244610
Siarczan kanamycynyFisherBP906
Kompetentne komórkiLife TechnologiesC4040
MatlabMathworks
płodu Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
  2. Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
  3. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
  4. Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
  5. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
  6. Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
  7. Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
  8. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  10. Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589(2014).
  11. Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
  12. Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
  13. Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
  14. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  15. Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171(2013).
  16. Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
  17. Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
  18. Seidman, C. E., Struhl, K., et al. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Coligan, J. E., et al. Appendix 4, 4D(2001).
  19. Morrison, S. L. Preparing frozen bacterial stocks. Curr. Protoc. Immunol. Coligan, J. E., et al. Appendix 3, Appendix 3M(2001).
  20. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529(2009).
  21. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
  22. Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
  23. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
  24. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
  25. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  26. Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
  27. Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oddzia ywania bia ko bia koledzenie pojedynczych cz steczekmikroskopia superrozdzielczananometrowa rozdzielczo przestrzennaobrazowanie ywych kom rekfluorescencyjne fragmenty bia eksondy fototransformowalneoddzia ywanie Ras Raf

Powiązane artykuły