Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53156

⸱

22 września 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina, 3Department of Bioengineering, Clemson University

W tym artykule

Podsumowanie

A kartezjańska biodrukarka została zaprojektowana i wyprodukowana, aby umożliwić osadzanie wielu materiałów w precyzyjnych, powtarzalnych geometriach, jednocześnie umożliwiając kontrolę czynników środowiskowych. Korzystając z trójwymiarowej biodrukarki, można drukować i łatwo odtwarzać złożone i żywotne konstrukcje.

Streszczenie

Inżynieria tkankowa skupiła się na budowie zamienników dla niefunkcjonalnych lub uszkodzonych tkanek. Wykorzystanie trójwymiarowego biodruku w inżynierii tkankowej stworzyło nowe metody drukowania komórek i matryc w celu wytwarzania biomimetycznych konstruktów tkankowych. Metoda wytwarzania brył o swobodnych kształtach (SFF) opracowana na potrzeby trójwymiarowego biodruku wykorzystuje podejście do wytwarzania przyrostowego polegające na osadzaniu kropelek komórek i hydrożeli warstwa po warstwie. Produkcja biodruku jest zależna od specyficznego rozmieszczenia materiałów biologicznych w trójwymiarowych architekturach, a wydrukowane konstrukty powinny ściśle naśladować złożoną organizację komórek i macierzy zewnątrzkomórkowych w tkance natywnej. W artykule zwrócono uwagę na zastosowanie drukarki Palmetto, biodrukarki kartezjańskiej, a także proces wytwarzania przestrzennie zorganizowanych, żywotnych konstrukcji, przy jednoczesnym umożliwieniu kontroli czynników środowiskowych. Metodologia ta wykorzystuje projektowanie wspomagane komputerowo i produkcję wspomaganą komputerowo do wytwarzania tych specyficznych i złożonych geometrii. Wreszcie, takie podejście pozwala na powtarzalną produkcję gotowych konstrukcji zoptymalizowanych pod kątem kontrolowanych parametrów drukowania.

Wprowadzenie

Inżynieria tkankowa wykorzystuje zasady biologii i inżynierii do opracowywania funkcjonalnych substytutów w celu utrzymania, przywrócenia lub ulepszenia rodzimej tkanki i . Zdolność do generowania trójwymiarowych konstruktów biomimetycznych na żądanie ułatwiłaby postęp naukowy i technologiczny w inżynierii tkankowej, a także w czujnikach komórkowych, badaniach przesiewowych leków/toksyczności, modelach tkanek lub nowotworów i innych. Trójwymiarowa organizacja konstruktów inżynierii tkankowej jest podstawowym elementem metody wytwarzania, ponieważ musi ściśle naśladować wysoce zorganizowaną interakcję komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej w tkance natywnej.

Biodegradowalne i kształtujące kształty trójwymiarowe rusztowania są kluczowymi czynnikami w generowaniu nowych konstrukcji tkankowych, ponieważ komórki migrują, tworząc dwuwymiarową warstwę komórek, ale nie mają zdolności do wzrostu w preferowanym trójwymiarze. Rusztowanie służy jako tymczasowa podstawa do przyczepiania i proliferacji komórek, dlatego musi być zbudowane z materiałów o kontrolowanej porowatości i biodegradowalności oraz wystarczającej integralności mechanicznej. Materiały rusztowań nie powinny być cytotoksyczne ani wywoływać niepożądanej reakcji gospodarza. Hydrożele są powszechnie stosowane w technikach inżynierii tkankowej, a ze względu na swoją hydrofilowość hydrożele umożliwiają wymianę płynów i gazów w całej strukturze. Łącząc różne hydrożele, właściwości zsyntetyzowanego hydrożelu można modyfikować, aby spełnić różne wymagania aplikacji.

Konwencjonalne podejście inżynierii tkankowej polega na tworzeniu bezkomórkowych, porowatych rusztowań ofiarnych, które są zasiewane komórkami po faktylacji. Zastosowano wiele technik, takich jak klejenie włókien, odlewanie rozpuszczalnikowe i formowanie ze stopu, ale okazało się, że są one minimalnie skuteczne w zastosowaniach inżynierii tkankowej. Metody łączenia włókien pozwalają na wyrównanie włókien w określonych kształtach, ale są one w stanie wytworzyć tylko bardzo cienkie rusztowanie. Metody odlewania rozpuszczalnikowego pozwoliły uzyskać wysoce porowate konstrukcje, jednak największa wyprodukowana membrana miała zaledwie 3 mm grubości. Dlatego tworzenie trójwymiarowych konstrukcji nie jest możliwe przy użyciu tych technik. Techniki formowania ze stopu okazały się skuteczne w produkcji trójwymiarowych rusztowań, ale wymagane są tak wysokie temperatury, że materiały biologiczne nie mogą być włączone do procesu produkcyjnego. Rusztowania wysiewane po wytworzeniu mają ograniczoną zdolność do spełnienia wymagań inżynierii tkankowej w zakresie produkcji trójwymiarowych rusztowań z predefiniowanymi lub sterowalnymi mikrostrukturami i . Innym poważnym problemem związanym z technologiami siewu rusztowań litych jest brak unaczynienia i słaba mechaniczna .

Bioprinting został od tego czasu rozszerzony do trzech wymiarów dzięki zastosowaniu nietoksycznych, biodegradowalnych, termoodwracalnych żeli, aby przezwyciężyć wady konwencjonalnych . Kilka z obecnie stosowanych technik wytwarzania brył o swobodnych kształtach to biodruk wspomagany laserem i druk atramentowy. Techniki biodruku wspomaganego laserowo wykorzystują impulsowe źródło lasera, płytkę docelową i podłoże odbiorcze do generowania trójwymiarowych. Jednak technika ta jest ograniczona ze względu na niską przepustowość, niską żywotność komórek i może wytwarzać tylko ograniczone układy wytwarzanych struktur, ponieważ do utworzenia usieciowanego hydrożelu można użyć tylko fotosieciowalnych prepolimerów. Druk atramentowy został opracowany jako metodologia bezkontaktowa, która odtwarza cyfrowe dane obrazu na podłożu poprzez osadzanie atramentu pikolitrowego. Jednak druk atramentowy nie wytwarza konstruktu o wysokiej rozdzielczości, konstrukty doświadczają szybkiej denaturacji białek, a wiele komórek ulega lizie podczas osadzania.

Obecnie opracowano nowe metody biodruku w produkcji addytywnej. W tych systemach komórki, białka, czynniki wzrostu i hydrożele biomimetyczne są zwykle integrowane z materiałami matrycowymi podczas procesu produkcyjnego i jednocześnie osadzane za pomocą sterowanych komputerowo siłowników w celu wygenerowania trójwymiarowych konstruktów komórkowych opartych na rusztowaniach, które ściśle naśladują mikroarchitekturę natywnych. Hydrożele obciążone komórkami tworzą biotusz, który może być niejednorodny, składający się z wielu typów komórek lub jednorodny. Systemy produkcji addytywnej umieszczają biotusz kropla po kropli lub warstwa po warstwie za pomocą jednorazowych strzykawek i końcówek na sterowanym komputerowo stoliku, który może poruszać się w kierunkach x, y i z. Dzięki oprogramowaniu komputerowemu architekturą rusztowań drukowanych można łatwo manipulować w zależności od wymagań aplikacji. W przeciwieństwie do konwencjonalnych technik, trójwymiarowe technologie medyczne (rezonans magnetyczny, tomografia komputerowa) mogą być włączone do projektów, generując konstrukcję specyficzną dla pacjenta. Metody te dają również możliwość wytwarzania unaczynionych zamienników, ponieważ konstrukty są wytwarzane z większą lokalną gęstością komórek, co umożliwia interakcje komórka-komórka i zwiększa prawdopodobieństwo przeżycia po implantacji.

Drukarka Palmetto to specjalnie zbudowany trójwymiarowy system wielodozownikowy, który wykorzystuje programowalne metody produkcji robotycznej do generowania trójwymiarowych heterogenicznych konstrukcji tkanek (Rysunek 1). Pozwala na użycie wielu materiałów w unikalnych kombinacjach w celu uzyskania niejednorodnych struktur. Inicjalizacja biodrukarki jest jednym z najważniejszych kroków w biodruku, ponieważ pozwala ustawić różne parametry w celu optymalizacji drukowalności biodrukowanych konstrukcji.

Bioprinter składa się z procesu typu wsadowego z sekwencjami uruchamiania, działania i wyłączania kontrolowanymi przez programowalny sterownik logiczny (PLC), który użytkownik obsługuje za pomocą interaktywnego panelu sterowania z ekranem dotykowym (Rysunek 1, A). Aby zapobiec zanieczyszczeniu materiałów biologicznych, biodrukarka jest zamknięta w komorze z poli(metakrylanu metylu) (PMMA) pod dodatnim ciśnieniem z wysokowydajnym systemem cyrkulacji powietrza filtrowanym przez filtr cząstek stałych (HEPA) (rysunek 1, B, C). Wnętrze drukarki można sterylizować za pomocą wbudowanych źródeł światła ultrafioletowego (rysunek 1, D). Centralnym elementem biodrukarki jest w pełni programowalny robot pozycjonujący, który może w sposób powtarzalny umieścić końcówkę dozownika z dokładnością do 10 mikrometrów (rys. 1, E). Dostępne są trzy dozowniki, które są w stanie nanosić objętości tak małe jak 230 nl za pomocą obrotowej (rysunek 1, F). Są one niezależnie programowalne za pomocą oddzielnych komputerów, które zarządzają parametrami drukowania dla każdego dozownika (rysunek 1, G). Dozowanie śrubowe obrotowe wykorzystuje obrót napędzanej silnikiem do przesuwania biotuszu w dół strzykawki i na zewnątrz końcówki strzykawki. Dozowniki te są zamontowane na pneumatycznie sterowanym gnieździe narzędziowym (Rysunek 2A, B), co pozwala robotowi przełączać dozownik zamontowany na ramieniu robota osi Z pod zaprogramowanym sterowaniem (Rysunek 1, H).

Robot XYZ otrzymuje instrukcje drukowania z komputera z uruchomionym oprogramowaniem do projektowania (Rysunek 1, I). Każdy program zawiera lokalizacje dozowania, procedury kalibracji i protokoły wymiany dozownika. Projekt generowanych konstrukcji składa się przede wszystkim ze współrzędnych XYZ, na których każdy dozownik będzie deponował materiał. Biodrukarka składa się z dwóch optycznych czujników światła (rysunek 2C), które określają współrzędne XYZ końcówki strzykawki. Czujniki te wysyłają informacje o współrzędnych do robota, który wykorzystuje je do obliczania pozycji końcówek końcówek dozownika. Istnieje dodatkowy laser przemieszczeniowy (rysunek 2D), który emituje czerwoną wiązkę lasera diodowego o długości 633 nm o wielkości plamki 30 x 100 mikrometrów w celu pomiaru odległości z dokładnością do 0,1 mikrometra. Gdy wiązka jest mocno skupiona, robot określa odległość Z powierzchni druku. Pomiar ten, a także pomiar końcówki końcówki w Z przez czujniki światła optycznego, pozwala na obliczenie dokładnych współrzędnych Z używanych do umieszczenia końcówki dozownika w stosunku do powierzchni druku. Końcówki dozownika poruszają się poprzecznie i pionowo przez optyczny czujnik światła zorientowany na oś X, aby znaleźć środki Y i Z, oraz poprzecznie przez czujnik osi Y, aby znaleźć środek osi X. Powierzchnia drukowania jest odwzorowywana przy użyciu wzoru na płaską płaszczyznę w przestrzeni xyz: ax + by +cz = d w celu określenia, gdzie znajduje się powierzchnia względem położenia końcówki dozującej. Stolik drukarki (rysunek 1, J) zawiera próbkę szalki Petriego o średnicy do 80 mm i wykorzystuje recyrkulacyjną łaźnię wodną do utrzymania ustawionej temperatury (rysunek 1, K). Temperaturę stage można ustawić w zakresie -20 i pozostaje stabilna w zakresie . Na ramieniu Z robota zamontowana jest kamera USB, która zapewnia powiększony widok końcówki dozującej podczas procesu drukowania (Rysunek 1, L). W górnej części wnętrza komory zamontowana jest druga kamera, która zapewnia pełny widok biodrukarki podczas procesu drukowania (Rysunek 1, L).

Wspomagane komputerowo oprogramowanie do rysowania projektów określa wzór osadzania i pozwala użytkownikowi na generowanie przyrostowo rozmieszczonych kropel i skomplikowanych struktur (Rysunek 3). Trójwymiarowe ścieżki można ręcznie zakodować w oprogramowaniu do projektowania kompatybilnym z drukarką lub zaimportować z oddzielnego oprogramowania do rysowania projektów wspomaganych komputerowo (Rysunek 4, Tabela 1). Oprogramowanie kompatybilne z drukarką umożliwia zmianę parametrów drukowania, takich jak metoda osadzania (osadzanie pojedynczej kropli lub osadzanie ciągłe), trójwymiarowa geometria ścieżek, szybkość stapiania, odległość między końcówką strzykawki a powierzchnią drukowania podłoża, ilość czasu do nałożenia pojedynczej kropli oraz wysokość i prędkość podnoszenia strzykawki między osadzaniem kropli. Każdy program zawiera lokalizacje dozowania XYZ, procedury kalibracji końcówek i protokoły wymiany dozownika, aby zapewnić sterylne środowisko podczas drukowania bez interwencji operatora. Programowalny sterownik logiczny (PLC) robota otrzymuje instrukcje z komputera, na którym działa oprogramowanie do projektowania, i steruje czasem zdarzeń z zewnętrznych sterowników (np. dozowników). W tym celu sterownik PLC wykorzystuje mechanizm pętli do sterowania dozownikami, zrobotyzowanym urządzeniem pozycjonującym i czynnikami środowiskowymi.

Trójwymiarowy biodruk bezpośredniego zapisu, wykorzystujący obrotowo-śrubowy system dozowania płynów, pozwala na to, aby proces osadzania komórek był bardziej wydajny, dokładny i łatwiejszy niż poprzednie metody. Badanie to pokazuje, że specjalnie zbudowana biodrukarka jest w stanie generować obciążone komórkami konstrukcje hydrożelowe o wysokiej żywotności komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża zawierającego żelatynę do trójwymiarowego biodrukowania hydrożeli alginianowych

  1. Przygotować podłoże wapniowo-żelatynowe zgodnie z metodą przygotowania podłoża wapniowo-żelatynowego opisaną przez Patakym i wsp.11 aby uniknąć ograniczenia żywotności związanej z wysoką gęstością komórek. Poniżej opisano metodę z użyciem podłoża wapniowo-żelatynowego.
    1. Połączyć chlorek wapnia dwuwodny (1,5% wag.), chlorek sodu (0,9% wag.) oraz żelatynę wieprzową (2% wag.) w wodzie destylowanej i gotować przez 2 min, aby przygotować 100 mM roztwór żelatyny.
  2. Wlej 5 ml roztworu żelatyny z wapniem do standardowych szalek Petriego o średnicy 100 mm, zakręć roztworem, aby uzyskać równomierną warstwę na powierzchni, a następnie umieść szalki na płaskiej powierzchni w lodówce w celu żelowania przez noc (pozostaw do żelowania przez co najmniej 8 h przed użyciem).
  3. Aby zwiększyć nieprzezroczystość powierzchni podłoża, należy dodać dwutlenek tytanu (0,3% masy) do żelatyny/CaCl22 roztwór. Mieszać przez 10 min. Autoklawować żelatynę/TiO2 roztwór w cyklu płynów przez 30 min w celu jego sterylizacji.
    1. Dodać 3 ml żelatyny/TiO22 roztwór na powierzchnię wcześniej przygotowanych płytek żelatynowych. Zamieszaj delikatnie mieszaninę, aby upewnić się, że została równomiernie rozprowadzona po całej powierzchni. Pozostaw do żelowania w 4 °C lodówka przez noc (pozostawić do zżelowania przez co najmniej 8 h przed użyciem). Podłoża należy wykorzystać w ciągu 3 dni.

2. Utlenianie alginianu

  1. Utlenij bioatrament z alginianu sodu zgodnie z metodą otrzymywania częściowo utlenionego alginianu opisaną poniżej przez Bouhadira et al30 .
    1. Aby przygotować 5% roztwór utlenionego alginianu, rozpuść 1 g alginianu sodu w 100 ml wody destylowanej. Dodaj wodny roztwór nadwęglanu sodu (0,25 M, 0,25 mmol), który pełni rolę utleniacza, aby otrzymać 5% roztwór utleniania. Mieszaj przez 19 hr w RT. Po 24 hr dodaj do roztworu 40 ml glikolu etylenowego, aby przerwać reakcję.
    2. Rozpuść 2,5 g chlorku sodu w roztworze. Dodaj nadmiar alkoholu etylowego (w stosunku 2:1), aby wytrącić utlenione alginiany. Odwiruj roztwór przy 1 000 ×g, aby zebrać osad, a następnie ponownie rozpuść go w wodzie destylowanej. Powtórz przemywanie etanolem.
    3. Liofilizuj granulki utlenionego alginianu i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  2. Wyznacz stopień utlenienia, mierząc procent zużytego nadwęglanu sodu przed przerwaniem reakcji glikolem etylenowym.
    1. Przygotuj roztwór jodku potasu (20% w/v, bufor fosforanowy sodu o pH 7,0) oraz roztwór tiodeny (10% w/v, bufor fosforanowy sodu o pH 7,0). Wymieszaj oba roztwory z utlenionym alginianem w RT.
    2. Stopniowo dodawaj kroplami przereagowany alginian i roztwór nadwęglanu sodu do mieszaniny roztworów jodku potasu i tiodeny. Zmierz spektrofotometrycznie absorbancję mieszaniny przy 426 nm. Po osiągnięciu maksimum zapisz zużytą objętość roztworu alginianu i nadwęglanu sodu jako V1.
    3. Reakcja przebiega zgodnie z Równanie reakcji redox z udziałem jonów jodynowych i nadjodynowych; symboliczny wzór chemiczny.. Ilość nieprzereagowanego nadwęglanu sodu wynosi Równanie rozcieńczenia z obliczeniem procentowym w/v, wzór dla korekty stężenia w analizie wolumetrycznej.
    4. Odejmij ilość nieprzereagowanego nadwęglanu sodu od stężenia początkowego, aby wyznaczyć ilość zużytego nadwęglanu sodu. Korzystając z poprzedniego wzoru, wyznacz końcowy stopień utlenienia alginianu.

3. Konjugacja alginianu z peptydem

  1. Przymocuj ligandy z odsłoniętą sekwencją argininy-glicyny-asparaginianu (peptyd) do wcześniej przygotowanego utlenionego alginianu, stosując metodę konjugacji RGD-Alginian opisaną poniżej przez Rowley et al31, aby wspomóc adhezję i rozprzestrzenianie się komórek.
  2. Do konjugacji użyj chemii wodnej karbodiimidu z G4RGDSP31.
  3. Rozpuść 1 g 5% utlenionego alginianu w 0,1 M buforze kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES), pH = 4. Dodaj 1-etylo-(dimetylaminopropylo)karbodiimid (EDC, 0,54 mmol) oraz N-hydroksysukcynimid (NHS, 0,27 mmol) w stosunku 2:1, aby utworzyć produkt pośredni w formie amidu.
  4. Dodaj 0,28 mmol peptydu, łącząc go z szkieletem polimeru alginianu poprzez terminalną grupę aminową. Mieszaj w RT przez noc (O/N).
  5. Zatrzymaj reakcję sprzęgania, dodając do roztworu 2,5 g chlorku sodu. Dodaj nadmiar etanolu (stosunek 2:1), aby wytrącić utlenione alginiany. Odwiruj mieszaninę przy 4 000 ×g przez 5 min w celu zebrania osadu. Odessij medium w komorze do hodowli komórkowej i ponownie rozpuść osad w wodzie destylowanej. Powtórz przemywanie etanolem.
  6. Liofilizuj osady do całkowitego wysuszenia (powstanie biała substancja proszkowa) i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

4. Hodowla komórek szczątkowych tkanki tłuszczowej człowieka (hADSC)

  1. Hoduj ludzkie komórki pochodzące ze zrazów tkanki tłuszczowej (hADSC) w traktowanych kolbach do hodowli komórkowej o powierzchni 75 cm² (kolby T75), wypełnionych 15 ml pożywki DMEM o niskiej zawartości glukozy z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny, 1% glutaminy oraz 1% antymycyny. W komorze z laminarnym przepływem powietrza wymieniaj pożywkę co dwa dni, aż komórki osiągną konfluencję (80-90%).
  2. Po osiągnięciu konfluencji przenieś kolby T75 do komory hodowlanej i zawieś komórki hADSC, stosując metodę trawienia enzymatycznego trypsyną.
    1. W komorze odessij całą pożywkę z hodowli komórkowej. Przepłucz komórki 5 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym według Dulbecco z dodatkiem wapnia i magnezu (DPBS ++). Odessij DPBS++ z komórek.
    2. W komorze przygotuj roztwór trypsyny i DPBS++, mieszając 1 ml trypsyny oraz 4 ml DPBS++. Każda kolba wymaga 5 ml roztworu, dlatego przygotuj objętość odpowiednią do liczby konfluencyjnych kolb. Dodaj 5 ml mieszaniny trypsyny/DPBS++ do każdej kolby i wstaw je do inkubatora na 2 min.
    3. Po 2 min wyjmij kolby i lekko postukaj w ich ścianki, aby odczepić komórki od dna. Sprawdź każdą kolbę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są zawieszone. Wstaw kolby z powrotem do komory hodowlanej i dodaj do każdej 3 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowej. Pozwoli to zatrzymać reakcję trypsyny.
    4. Przenieś pożywkę z komórkami z każdej kolby do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Odwiruj je przy 1 000 x g przez 5 min. Komórki powinny utworzyć mały biały pellet na dnie probówki. Przenieś probówki z powrotem do komory hodowlanej i odessij pożywkę. Resuspenduj komórki w 2 ml pożywki do hodowli komórkowej.
    5. Policz komórki za pomocą hemocytometru pod mikroskopem. Po policzeniu komórek, w komorze hodowlanej, odmierz objętość pożywki zawierającą ~1,3 miliona komórek i przenieś ją do probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Ponownie odwiruj probówkę 15 ml z komórkami przez 5 min przy 1 000 x g.
    6. W komorze hodowlanej przesiej pozostałe komórki do kilku kolb T-75, dodając do każdej kolby stężenie ~350 000 komórek. Dodaj 15 ml pożywki DMEM i przenieś do inkubatora aż do ponownego osiągnięcia konfluencji.
    7. Po zakończeniu cyklu wirowania przenieś probówkę 15 ml do komory hodowlanej. Odessij pożywkę z pelletu komórkowego i resuspenduj komórki w wodnym roztworze alginianu przy stężeniu 1,3 miliona komórek na mililitr biotuszu, często potrząsając roztworem, aby zapewnić jednorodne rozmieszczenie komórek w biotuszu. Napełnij sterylną strzykawkę 3 ml kompatybilną z drukarką roztworem z komórkami i zakręć sterylną plastikową końcówką 22 G.

5. Konfiguracja biodrukarki

  1. Włącz biodrukarkę, komputery każdego z dozowników oraz cyrkulacyjną kąpiel wodną.
    1. Ręcznie ustaw temperaturę cyrkulacyjnej kąpieli wodnej dla mechanizmu żelowania.
    2. Ręcznie ustaw parametry drukowania dla każdego dozownika na odpowiadającym mu komputerze. Ustaw objętość dozowania na 230 nl, liczbę kroków wstecznych na 0 oraz szybkość dozowania na 10μl –sec.
  2. Otwórz oprogramowanie do projektowania oraz program do podglądu obrazu z kamery USB na komputerze.
    1. Za pomocą oprogramowania ręcznie wprowadź współrzędne dla macierzy 5 x 5 kropli z odstępem 2,4 mm między nimi.
    2. Ustaw parametry drukowania następująco: odległość między końcem końcówki a powierzchnią podłoża = 0,1 mm; wysokość podniesienia strzykawki między aplikacjami = 20 mm; czas jednej aplikacji = 1 sec.
    3. Zapisz program i prześlij go do robota.
  3. Umieść szalkę Petri zawierającą żelatynę/TiO2 na stole drukarki o temperaturze 4 °C. Zamknij i zablokuj drzwi komory.
  4. Użyj sterownika PLC, aby uruchomić źródła światła ultrafioletowego i wysterylizować komorę przez 90 sec.
  5. Po zakończeniu sterylizacji otwórz komorę i załaduj do Gun 1 strzykawkę zawierającą hADSC zawieszone w alginianie. Zamknij i zablokuj drzwi komory.
  6. Użyj sterownika PLC, aby włączyć system wentylatorów i odczekaj 30 sec do wyrównania ciśnienia wewnętrznego.
  7. Na komputerze uruchom program zawierający ścieżkę geometryczną i parametry drukowania.
  8. W trakcie procesu drukowania obserwuj podgląd z kamery USB na komputerze, aby potwierdzić dokładność i jednorodność druku.
  9. Po zakończeniu drukowania pozostaw konstrukty do żelowania na 40 min.

6. Ocena żywotności komórek

  1. Konstrukcje, które nie zostaną poddane obrazowaniu bezpośrednio po drukowaniu, należy przykryć DMEM i przechowywać w inkubatorze do czasu obrazowania.
  2. Aby ocenić przeżywalność konstrukcji, należy poddać je barwieniu przy użyciu fluorescencyjnego testu żywotności/cytotoksyczności, a następnie obrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej.
    1. Zgodnie z instrukcją do zestawu, należy przygotować roztwór barwiący zawierający calcein AM i etydyniowy homodimer-1. Aby przygotować 10 ml roztworu barwiącego, należy dodać 20 μl etydyniowego homodimeru-1 oraz 5 μl calcein AM do 10 ml sterylnego, przeznaczonego do hodowli tkankowych roztworu soli fizjologicznej Dulbecco z buforem fosforanowym (+magnez, +wapń; DPBS++).
    2. Biodrukowane konstrukcje należy zanurzyć w roztworze barwiącym na 15 min w ciemności.
    3. Zabarwione konstrukcje należy obrazować za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego w dniu 0 i 8. Należy wykonać wiele zdjęć każdej biodrukowanej konstrukcji, stosując parametry Z-stack obejmujące 30 plastrów optycznych na głębokości 300 μm, a następnie ręcznie policzyć komórki. Komórki żółte lub zielone należy liczyć jako żywe, a czerwone jako martwe.
  3. Procent przeżywalności komórek oblicza się jako liczbę żywych komórek podzieloną przez całkowitą liczbę komórek w konstrukcji; Przeżywalność komórek = liczba żywych komórek (zielone+żółte)/ całkowita liczba komórek (zielone+żółte+czerwone) x 100%.
  4. Ilość proliferacji komórek dla każdej próbki oblicza się jako liczbę komórek w dniu 8 podzieloną przez liczbę komórek w dniu 0; Proliferacja komórek = liczba żywych komórek w dniu 8/ liczba żywych komórek w dniu 0 x 100%.

7. Analiza konjugacji peptydów RGD

  1. Aby przeanalizować sukces konjugacji peptydów RGD z alginianem, porównaj alginian skoniugowany z RGD oraz alginian nieskoniugowany. W tym celu wykonaj obrazowanie wydrukowanych konstrukcji przy użyciu barwników (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) oraz faloidyny.
    1. Przygotuj roztwór roboczy faloidyny, rozcieńczając 5 μl mętnego roztworu zapasowego w metanolu w 200 μl DPBS++. Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    2. Przygotuj 300 μM roztwór zapasowy barwnika DAPI zgodnie z równaniem: (0,10509 g/L)/(350,3 g/mol)=3 × 10-4 M=0,0003 M=0,300 mM=300 μM. Przygotuj roztwór roboczy DAPI, rozcieńczając roztwór zapasowy 1:100 w DPBS++, aby otrzymać roztwór o stężeniu 3 μM. Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  2. Całkowicie zanurz próbkę w 4% paraformaldehydzie. Inkubuj przez 1 hr w temperaturze pokojowej (RT). Przemyj trzy razy DPBS++, pozwalając roztworowi działać przez 5 min podczas każdego płukania. Przenieś próbkę żelu z dołka na szkiełko przedmiotowe, odwracając żel podczas tego procesu. Zanurz żel w 0,1% Triton X-100 (0,1 g/ 100 ml) w DPBS++ na 10 min. Przemyj trzy razy DPBS++, poświęcając 5 min na każde płukanie.
  3. Zbarw wydrukowane konstrukcje faloidyną, zanurzając je w roztworze roboczym. Przykryj folią i inkubuj przez 4 hr. Usuń barwnik faloidynowy i przemyj trzy razy DPBS++. Pierwsze płukanie powinno być szybkie, a kolejne powinny trwać po 5 min.
  4. Zbarw wydrukowane konstrukcje DAPI, zanurzając je w roztworze roboczym DAPI. Przykryj folią i inkubuj w RT przez 30 min. Przemyj trzy razy DPBS++, pozwalając każdemu płukaniu trwać 5 min. Przeanalizuj i wykonaj obrazowanie próbek przy użyciu konfokalnego systemu mikroskopowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki wykazują, że biodrukarka jest w stanie precyzyjnie i spójnie nanosić hydrożele z zawieszonymi komórkami w określonych lokalizacjach trójwymiarowych przy użyciu oprogramowania wspomaganego komputerowo. Programy te określają rozmieszczenie każdej kropli i kontrolują wiele parametrów dozowania (Rycina 3,4). Powtarzalność biodrukarki w zakresie prawidłowego nanoszenia biomateriałów jest kluczowa dla jej sukcesu w zastosowaniach inżynierii tkankowej.

Żywotność komórek, będąc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Głównym celem inżynierii tkankowej jest wypełnienie luki między niedoborem narządów a potrzebami transplantacyjnymi poprzez opracowanie biologicznych substytutów zdolnych do przywrócenia, utrzymania lub poprawy funkcji tkanek natywnych. Doprowadziło to do bezpośredniego wytwarzania rusztowań o złożonej, anatomicznie poprawnej geometrii zewnętrznej i precyzyjnej kontroli nad wewnętrznym geometrem. Bioprinting trójwymiarowy to metodologia stosowana do generowania trójwymiarowych konstrukcji o różnych rozmiarach i kształtac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez wsparcie rządowe w ramach grantu nr. EPS-0903795 przyznany przez National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI) oraz Grant 8P20 GM103444 (YM PI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Robot pozycjonujący (JR2000 XYZ)Janome 
Dozowniki: SDAV Napęd liniowy Inteligentne dozownikiFishman Corporation
Optyczne czujniki światła: Keyensce
Laser wyporowy: OD MiniSICK
Recyrkulacyjna kąpiel wodna: PolystatCole-ParmerEW-12122-02
Kamery USB: Dino-Lite Premier 5MPAnMo Electrionics/YSC TechnologiesAD7013MT
Kompatybilne z drukarką oprogramowanie do projektowania komputerowego: JR-C PointsJanomeW zestawie z zakupem robota Janome
Oprogramowanie do rysowania wspomaganego komputerowo: Visual PathBuilderRatioServMożna pobrać pod adresem: www.ratioserv.com/index.php/downloads
Drukarka 3 cc Strzykawki: Fishman Corporation122051
22 G Końcówki dozownikaFishman CorporationZ520122 
Chlorek wapnia dwuwodnySigma-Aldrich10035-04-8
Chlorek soduSigma-Aldrich7647-14-5
Żelatyna wieprzowaSigma-Aldrich9000-70-8
Dwutlenek tytanuSigma-Aldrich13462-67-7
Protanal LF 20/40 Alginian (alginian sodu)FMC BioPolymer9005-38-3
Kwas solnySigma-Aldrich7647-01-0
Glikol etylenowyMallinckrodt Baker, Inc9300-01
Periodynian soduSigma-Aldrich7790-28-5
hADSCLonzaPT-5006Przechowywać w fiolkach w ciekłym azocie do czasu użycia.
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle's MediumGibco Life Technologies11965-092Ciepły w 37 stopniach; C woda przed użyciem.
Trypsyna/EDTALonzaCC-5012Ciepły w 37 stopniach; C woda przed użyciem.
Calcein AMGibco Life TechnologiesC3100MPPrzechowywać w ciemności w temperaturze -80 stopni; C do momentu użycia.
Zestaw do oznaczania żywotności żywych/martwych ssakówInvitrogen Life TechnologiesL-3224Przechowywać w ciemności w temperaturze -80 stopni Celsjusza; C do momentu użycia.
MES HydratSigma-AldrichM2933
N-hydroksysukcynimidSigma-Aldrich130672
1-etylo-(dimetyloaminopropylo)karbodimid (EDC)Sigma-AldrichE1769 10 gramów
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco, +Wapń, +Technologie MagnezuŻycia14040133ciepła w 37 stopniach; C woda przed użyciem.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco, -wapń, -magnezLife Technologies14190144ciepła w 37 stopniach; C woda przed użyciem.
RGD PeptidesInternational Peptides
Alexa Fluor 546 Phalloidin StainInvitrogen Life TechnologiesA22283Przechowywać pod adresem -20 & C do czasu użycia
(4', 6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek) (DAPI) StainLife TechnologiesR37606Przechowywać w temperaturze -20 &; C do momentu użycia

Bibliografia

  1. Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  2. Derby, B. Review: Printing and Prototyping of Tissues and Scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
  3. Kachurin, A. M., et al. Direct-Write Construction of Tissue-Engineered Scaffolds. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 698, 10-1557 (2002).
  4. Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on the Application of Solid Freeform Fabrication Technology to the Production of Tissue Engineering Scaffolds. European Cells and Materials. 5, 29-40 (2003).
  5. Yeong, W. Y., Chua, C. K., Leong, K. F. Rapid Prototyping in Tissue Engineering. Challenges and Potential. Trends Biotechnol. 22 (12), 643-652 (2004).
  6. Landers, R., Pfister, A., Hubner, U., John, H., Schmelzeisen, R., Mulhaupt, R. Fabrication of Soft Tissue Engineering Scaffolds by means of Rapid Prototyping Techniques. Journal of Materials Science. 37 (15), 3107-3116 (2002).
  7. Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of Hydrogels for Bio–Printing Applications. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101A (1), 272-284 (2013).
  8. Burg, K. J. L., Boland, T. Minimally Invasive Tissue Engineering Composites and Cell Printing. IEEE Eng Med Biol Mag. 22 (5), 84-91 (2003).
  9. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A Review of Trends and Limitations in Hydrogel-Rapid Prototyping for Tissue Engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  10. Khalil, S., Nam, J., Sun, W. Multi–Nozzle Deposition for Construction of 3D. Biopolymer Tissue Scaffolds. Rapid Prototyping Journal. 11 (1), 9-17 (2005).
  11. Pataky, K., Braschler, T., Negro, A., Renaud, P., Lutolf, M. P., Brugger, J. Microdrop Printing of Hydrogel Bioinks into Three–Dimensional Tissue–Like Geometries. Adv Mater. 24 (3), 391-396 (2011).
  12. Pati, F., Shim, J. H., Lee, J. S., Cho, D. W. Three-Dimensional Printing of Cell–Laden Constructs for Heterogeneous Tissue Regeneration. Manufacturing Letters. 1 (1), 49-53 (2013).
  13. Gruene, M., et al. Laser Printing of Three–Dimensional Multicellular Arrays for Studies of Cell–Cell and Cell–Environment Interactions. Tissue Eng. 17 (10), 973-982 (2011).
  14. Khalil, S., Sun, W. Bioprinting Endothelial Cells With Alginate for 3D Tissue Constructs. J Biomed Eng. 131 (11), 1-8 (2009).
  15. Xu, T., et al. Hybrid Printing of Mechanically and Biologically Improved Constructs for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biofabrication. 5 (1), 1-10 (2012).
  16. Zhang, T., Yan, K. C., Ouyang, L., Sun, W. Mechanical Characterization of Bioprinted in vitro Soft Tissue Models. Biofabrication. 5 (4), 1-10 (2013).
  17. Chung, J. H. Y., et al. Bio–ink Properties and Printability for Extrusion Printing Living Cells. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1 (7), 763-773 (2013).
  18. Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The Design of Scaffolds for Use in Tissue Engineering. Part II. Rapid Prototyping Techniques. Tissue Engineering. 8 (1), 1-11 (2002).
  19. Ferris, C. J., Gilmore, K. G., Wallace, G. G., Panhuis, M. Biofabrication: An Overview of the Approaches Used for Printing of Living Cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (10), 4243-4258 (2013).
  20. Lu, L., Mikos, A. G. The Importance of New Processing Techniques in Tissue Engineering. MRS Bull. 21 (11), 28-32 (1996).
  21. Wake, M. C., Gupta, P. K., Mikos, A. G. Fabrication of pliable biodegradable polymer foams to engineer soft tissues. Cell Transplant. 5, 465-473 (1996).
  22. Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J. Organ Printing: Tissue Spheroids as Building Blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  23. Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E. Scaffold–free Vascular Tissue Engineering Using Bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
  24. Devillard, R., et al. Cell Patterning by Laser–Assisted Bioprinting. Methods Cell Biol. 119, 159-174 (2014).
  25. Binder, K. W., Allen, A. J., Yoo, J. J. Drop–on–Demand Inkjet Bioprinting: a Primer. Gene Ther Reg. 6 (1), 33(2011).
  26. Xu, T., et al. Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures Generated by the Inkjet Printing Method. Biomaterials. 27 (19), 3580-3588 (2006).
  27. Calvert, P. Inkjet Printing for Materials and Devices. Chem Mater. 13 (10), 3299-3305 (2001).
  28. Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K. Direct–Write Bioprinting Three–Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 98 (1), 160-170 (2011).
  29. Li, M. G., Tian, X. Y. A Brief Review of Dispensing–Based Rapid Prototyping Techniques in Tissue Scaffold Fabrication: Role of Modeling on Scaffold Properties Prediction. Biofabrication. 1 (3), 1-10 (2009).
  30. Bouhadir, K. H., Lee, K. Y., Alsberg, E., Damm, K. L., Anderson, K. W., Mooney, D. J. Degradation of Partially Oxidized Alginate and its Potential Application for Tissue Engineering. Biotechnol Prog. 17 (5), 945-950 (2001).
  31. Rowley, J. A., Madlambaya, G. Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  32. Smith, C. M., Christian, J. J., Warren, W. L. Characterizing Environmental Factors that Impact Viability of Tissue–Engineered Constructs Fabricated by a Direct–Write Bioassembly Tool. Tissue Engineering. 13 (2), 373-383 (2007).
  33. Ozbolat, I., Yu, Y. Bioprinting Towards Organ Fabrication: Challenges and Future Trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 691-699 (2012).
  34. Peltola, S. M., Melchels, F. P., Grijpma, D. W., Kellomaki, M. A. A Review of Rapid Prototyping Techniques for Tissue Engineering Purposes. Annals of Medicine. 40 (4), 268-280 (2008).
  35. Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv Mat. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  36. Murphy, S. V., Atala, A. 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).
  37. Jia, J., et al. Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).
  38. Forty, R. A., Steinberg, M. S. The Differential Adhesion Hypothesis: a Direct Evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
  39. Wang, L., Shansky, J., Borselli, C., Mooney, D., Vandenburgh, H. Design and Fabrication of a Biodegradable, Covalently Crosslinked Shape–Memory Alginate Scaffold for Cell and Growth Factor Delivery. Tis Eng Part A. 18 (19-20), 2000-2007 (2012).
  40. El–Sherbiny, I. M., Yacoub, M. H. Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges. Global Cardiology Science, & Practice. 3 (38), 316-342 (2013).
  41. Smith, C. M., et al. Three–Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs. Tissue Engineering. 10 (9–10), 1566-1576 (2004).
  42. Ozbolat, I. T., Chen, H. Development of a ‘Multi-arm Bioprinter’ for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs. Robotics and Computer–Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).
  43. Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell–Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X. Adv Mater. X, x-y (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Drukarka trzystrzykawkowaludzkie komórki stromalne tkanki tłuszczowejbioatrament z alginianu sprzężonego z utlenionym RGDanaliza za pomocą mikroskopii konfokalnejżywotnośćproliferacja i migracja komórekprojektowanie i wytwarzanie wspomagane komputerowometoda swobodnego formowania ciał stałychkonstrukty zorganizowane przestrzenniepowtarzalne parametry produkcji
Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.