Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje metodę ilościowego określania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w zwierzęcym modelu przerzutów nowotworowych.

Streszczenie

Aby zbadać mechanizmy molekularne rządzące przerzutami nowotworowymi, zaproponowano różne testy z wykorzystaniem myszy jako zwierzęcia modelowego. Tutaj pokazujemy prosty test do oceny wynaczynienia komórek nowotworowych lub mikroprzerzutów. W tym teście komórki nowotworowe zostały wstrzyknięte przez żyłę ogonową, a po krótkim czasie płuca zostały wypreparowane i strawione w celu zliczenia nagromadzonych znakowanych komórek nowotworowych. Test ten pomija początkowy etap inwazji guza pierwotnego do naczynia krwionośnego i ułatwia badanie zdarzeń w odległym narządzie, w którym dochodzi do przerzutów guza. Liczba komórek wstrzykiwanych do naczynia krwionośnego może być zoptymalizowana w celu zaobserwowania ograniczonej liczby przerzutów. Doniesiono, że komórki zrębu w odległym narządzie przyczyniają się do przerzutów. W związku z tym test ten może być użytecznym narzędziem do badania potencjalnych leków terapeutycznych lub urządzeń do zapobiegania przerzutom nowotworowym.

Wprowadzenie

Przerzuty nowotworowe odpowiadają za wysoką śmiertelność w chorobach związanych z rakiem. Z punktu widzenia badań na poziomie molekularnym, przerzuty można podzielić na wiele etapów: inicjację guza w miejscu guza pierwotnego, wzrost guza pierwotnego i inwazję na otaczające tkanki, wynaczynienie, krążenie przez naczynia krwionośne, wynaczynienie w odległych narządach i ponowny wzrost guza. Każdy krok obejmuje różne zestawy cząsteczek/sygnałów¹.

Dotychczasowe badania dotyczyły wydarzeń zachodzących w odległych narządach, zanim komórki nowotworowe zaczną krążyć we krwi, co jest również znane jako faza pre-przerzutowa^2,3,4,5^,6. Nasze badania na modelu mysim wykazały, że faza przed przerzutami ułatwia przerzuty do płuc poprzez tworzenie długotrwałych i nisko nasilonych reakcji zapalnych w płucach. Faza przed przerzutami charakteryzuje się nadmierną przepuszczalnością mikrokrążenia, rekrutacją komórek pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC) oraz regulacją w górę cząsteczek cytokinowych / chemokinowych, w tym S100A8 i SAA3^3,4. Doniesiono, że oksydaza lizylowa modyfikuje macierz zewnątrzkomórkową w płucach w celu rekrutacji BMDCs⁷. Inny raport ujawnił znaczenie Angpt2, MMP3 i MMP10 w fazie przed przerzutami⁸. Innymi słowy, skomplikowane interakcje między guzami pierwotnymi, szpikiem kostnym i odległymi narządami muszą być zrozumiane i odpowiednio modulowane (na przykład za pomocą leków, które celują w białka zaangażowane w te interakcje), aby zapobiec przyszłym przerzutom⁹. Aby uregulować fazę przedprzerzutową, należy ją najpierw uwidocznić i ocenić pod kątem interwencji diagnostycznych lub terapeutycznych. W tym miejscu przedstawiamy test rekrutacji komórek nowotworowych płuc, który umożliwia badanie fazy przedprzerzutowej w płucach.

Komórki nowotworowe bezpośrednio wstrzyknięte do naczynia krwionośnego myszy są podobne do krążących komórek nowotworowych u pacjentów z rakiem, chociaż mogą istnieć różnice między hodowanymi komórkami a krążącymi komórkami nowotworowymi. Krążące komórki nowotworowe same ulegają pewnym charakterystycznym zmianom, gdy wchodzą do krążenia z guza pierwotnego. Niemniej jednak hodowane komórki mogą tworzyć guzy u myszy z niedoborem odporności, gdy zostaną wstrzyknięte do żyły ogonowej. Dodatkowo, w systemie modelu mysiego, można zastosować komórki nowotworowe znakowane fluorescencją, które umożliwiają śledzenie tych komórek w organizmie. Zachowanie krążących komórek nowotworowych ma kluczowe znaczenie, ponieważ określają one ostateczne konsekwencje u pacjentów z rakiem¹⁰. Krew nie jest dobrym miejscem do przetrwania komórek nowotworowych². Muszą uciec przed atakiem układu odpornościowego gospodarza i potrzebują sygnałów antyapoptotycznych, aby zapobiec apoptozie z powodu braku wsparcia fizycznego. Komórki nowotworowe o większej zdolności inicjacji guza w miejscach przerzutów generują więcej guzków nowotworowych. Jeśli komórki nowotworowe wykazują specyficzny tropizm narządowy, należy zaobserwować przerzuty w tych konkretnych narządach. W tym teście nie uwzględniono początkowych etapów kaskady przerzutowej (wzrost i inwazja guza pierwotnego), dlatego skupiono się na interakcji między krążącymi komórkami nowotworowymi a komórkami zrębu (komórkami śródbłonka, komórkami nabłonkowymi i komórkami krwi). W konwencjonalnych testach iniekcji komórek nowotworowych naukowcy muszą poczekać, aż guzki nowotworowe urosną do namacalnych rozmiarów, aby wykryć przerzuty. W takim przypadku nie można określić ilościowo dokładnej liczby komórek nowotworowych w naczyniu krwionośnym. Dodatkowo proces ten obejmuje fazę odrastania guza, co wskazuje, że inne czynniki w komórkach nowotworowych mogą wpływać na wynik.

Liczenie oznaczonych komórek nowotworowych pod mikroskopem stereoskopowym fluorescencji jest prostym procesem. Mikroskop stereoskopowy zapewnia szerokie pole widzenia, dzięki czemu można zeskanować całe płuco. Cytometria przepływowa jest również przydatnym narzędziem, które natychmiast podaje dokładną liczbę komórek nowotworowych w tkance. Możliwe jest również liczenie komórek fluorescencyjnych w tkance pod mikroskopem konfokalnym, które wyświetla najdokładniejsze obrazy przerzutowych komórek nowotworowych, ale jest czasochłonne i może dawać stronnicze wyniki, jeśli liczony jest tylko wybrany obszar. Ostatecznym celem tego testu jest zaobserwowanie, jak łatwo komórki nowotworowe gromadzą się w płucach. Jak wspomniano wcześniej^3,4, jeśli płuca są w fazie przedprzerzutowej z powodu sygnalizacji zapalnej z guza pierwotnego, wstrzyknięte komórki nowotworowe są podatne na gromadzenie się w płucach, co oznacza większe szanse na przerzuty do płuc. Inne schorzenia (reumatoidalne zapalenie stawów, astma itp.) oraz ich leczenie środkami przeciwzapalnymi (takimi jak anty-TNFα) mogą osłabić przerzuty do płuc. W związku z tym wnioskujemy, że ten test jest potężnym narzędziem do oceny możliwości przerzutów do płuc.

Protokół

Wszystkie procedury wykonywane na myszach zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami Kobiecego Uniwersytetu Medycznego w Tokio.

1.Iniekcja do żyły ogonowej komórek raka płuc Lewisa (LLC)

1. Utrzymuj komórki LLC w DMEM uzupełnionym 10% FCS, w wilgotnym inkubatorze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Komórki powinny zawierać fluorescencyjny system ekspresji białek (np. GFP).
2. Usunąć komórki z naczynia hodowlanego za pomocą nieenzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek. Postępuj zgodnie z protokołem producenta.
3. Zebrać komórki w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 400 x g przez 3 minuty. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml PBS przez pipetowanie i odwirować probówkę (400 x g, 3 min). Następnie usunąć supernatant.
   1. Powtórz ten krok prania jeszcze raz.
4. Po drugim płukaniu przepuść komórki przez sitko (wielkość porów 40 μm) i ponownie zawieś w PBS, aby uzyskać końcową gęstość komórek 1 x 10⁶ komórek/ml.
5. Wstrzyknąć 0,1 ml zawiesiny komórkowej (1 x 10 5 komórek, igła 29G) każdej myszy C57BL/6 (samce w wieku 8-10 tygodni) przez żyłę ogonową.

2. Izolacja płuc i liczenie komórek pod stereomikroskopem fluorescencyjnym

1. Poddaj myszy eutanazji przez wdychanie CO_{2 .}
2. Usuń skórę z brzusznej powierzchni klatki piersiowej nożyczkami. Następnie odetnij żebra i przeponę, aby odsłonić klatkę piersiową. Przepłukać PBS (100 cmH₂O, łącznie 15 ml) przez prawą komorę za pomocą skrzydełkowej igły do infuzji 25G i rurki.
3. Wytnij serce i grasicę. Chwyć tchawicę kleszczami i podciągnij się, preparując nożyczkami tkanki łączne wokół tchawicy. Wypreparuj płuca i umyj je w PBS.
4. Oderwij każdy płat i obserwuj go pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym.

3. Trawienie płuc

1. Rozpuść 10 mg kolagenazy, 10 mg dypazy i 10 μg DNazy w 10 ml DMEM bez surowicy. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm, aby przygotować roztwór do trawienia enzymatycznego.
2. Izolowany płat ogonowy pokrój w kostkę nożyczkami. Umieścić fragmenty płuc w strzykawce o pojemności 10 ml, a następnie tłok.
3. Zassać roztwór wytrawiający (5 ml) do strzykawki, pociągając za tłok. Przesuwać tłok w górę i w dół, aż płuco zanurzy się w roztworze. Następnie umieść bufor płucny i wytrawiający w probówce o pojemności 50 ml.
4. Potrząsać probówką przez 15 minut w temperaturze 37 °C na wytrząsarce posuwisto-zwrotnej (150 obr./min). Podczas tej inkubacji płuca mogą zostać postrzępione.
5. Pipetować w górę i w dół, aż komórki płuc zostaną całkowicie rozproszone. Potrząsać probówką przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 37 °C na wytrząsarce posuwisto-zwrotnej (150 obr./min).
6. Przepuść komórki płuc przez sitko o wielkości 40 μm. Wiruj komórki w temperaturze 400 x g przez 3 minuty.

4. Cytometria przepływowa komórek płuc

1. Rozpuścić 100 mg BSA w 10 ml PBS i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm, aby przygotować PBS-1% BSA.
2. Usunąć supernatant z próbki otrzymanej w kroku 3.6 za pomocą pipety i dodać 2 ml roztworu do lizy czerwonych krwinek. Następnie wiruj komórki w temperaturze 400 x g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant.
3. Zawiesić komórki w 5 ml PBS-1% BSA przez pipetowanie i odwirować probówkę (400 x g, 3 min). Odrzucić supernatant.
   1. Powtórz ten krok prania jeszcze raz.
4. Zawieś komórki w 1 ml PBS-1% BSA i przepuść przez nowe sitko do komórek 40 μm.
5. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego, aby policzyć komórki nowotworowe (przy użyciu konfiguracji filtra FL1 dla GFP-LLC).

Wyniki

Płuca wykazują obecność wielu komórek GFP-LLC 2 h po wtryskiwaniu (Rysunek 1A). Należy zauważyć, że punkty fluorescencyjne wykryte również w filtrze czerwonym powinny zostać wykluczone z obliczeń liczby komórek. Przeważająca większość komórek LLC znika z płuc 24 h po wtryskiwaniu (Rysunek 1C).

Aby potwierdzić liczbę komórek GFP-LLC w płucach, jeden z płatów można wykorz...

Dyskusja

Możliwe jest wstępne leczenie myszy przeciwciałami, lekami, dietą wysokotłuszczową lub pożywką kondycjonowaną przez guz przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych. Najtrudniejszym krokiem w tym teście jest iniekcja do żyły ogonowej. Niekompletne wstrzyknięcie skutkuje niejednoznacznymi danymi. Żyła ogonowa w C57BL/6 jest szczególnie trudna do zidentyfikowania, co skutkuje nieudanymi iniekcjami. Umieszczenie myszy na poduszce grzewczej (37 °C) pomaga rozszerzyć żyłę ogonową, dzięki czemu wstrzyknięcie staje się łatwiejsze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenaza	Sigma	C6885
Dispase	Gibco	17105-041
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A7030
DPBS	Gibco	14190-144	bez wapnia, bez magnezu
Deoksyrybonukleaza I	Sigma	DN-25	śladowa ilość
buforu do lizy RBC	Sigma	R7757
Sitko do komórek	BD	352340	siatka 40 mikrometrów
Zestaw do etykietowania fluorescencyjnego	Sigma	MIN26-KIT
DMEM	Gibco	11965-092
0,22 μ M Filtr strzykawkowy	Sartorius	17597K
OCT związek	Sakura Finetek	4583
4% roztwór buforowy fosforanu paraformaldehydu	Wako	163-20145