Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Podsumowanie

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Streszczenie

Ostatnie postępy w przeprogramowywaniu pozwalają nam przekształcać komórki somatyczne w indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC). Modelowanie choroby za pomocą specyficznych dla pacjenta hiPSC pozwala na badanie mechanizmu leżącego u podstaw patogenezy, zapewniając również platformę do rozwoju badań przesiewowych leków in vitro i terapii genowej w celu poprawy opcji leczenia. Obiecujący potencjał hiPSC w medycynie regeneracyjnej jest również widoczny w rosnącej liczbie publikacji (7000 >) na temat iPSC w ostatnich latach. Do wytwarzania hiPSC z powodzeniem wykorzystuje się różne typy komórek z różnych linii, w tym fibroblasty skóry, komórki krwiotwórcze i keratynocyty naskórka. Podczas gdy biopsje skóry i pobieranie krwi są rutynowo wykonywane w wielu laboratoriach jako źródło komórek somatycznych do wytwarzania hiPSC, pobieranie i późniejsze wyprowadzanie keratynocytów włosów jest rzadziej stosowane. Keratynocyty pochodzące z włosów stanowią nieinwazyjne podejście do pozyskiwania próbek komórek od pacjentów. Tutaj przedstawiamy prostą, nieinwazyjną metodę uzyskiwania keratynocytów z wyrwanych włosów. Udostępniamy również instrukcje dotyczące konserwacji keratynocytów i późniejszego przeprogramowania w celu wygenerowania bezintegracyjnego hiPSC przy użyciu wektorów episomalnych.

Wprowadzenie

Odkrycie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) zrewolucjonizowało dziedzinę medycyny regeneracyjnej, dostarczając realną metodę generowania komórek macierzystych specyficznych dla pacjenta ^1-3. HiPSC zostały pomyślnie wygenerowane z różnych typów komórek somatycznych, w tym fibroblastów ^4,5, komórek krwiotwórczych ^6,7, komórek nabłonka nerek z moczu ⁸ i keratynocytów ^9,10. Do tej pory fibroblasty skóry i komórki krwiotwórcze stanowią najczęściej wykorzystywane źródła komórek do wytwarzania iPSC specyficznych dla pacjenta. Prawdopodobnie wynika to z faktu, że biopsje skóry i pobieranie krwi są rutynowymi procedurami medycznymi, a w wielu krajach powstały duże biobanki próbek krwi lub skóry pacjentów.

W przeciwieństwie do komórek krwi i fibroblastów skóry, które wymagają inwazyjnych metod ekstrakcji, keratynocyty stanowią łatwo dostępny typ komórek do generowania hiPSC. Keratynocyty to bogate w keratynę komórki nabłonkowe, które tworzą zewnętrzną barierę naskórkową skóry, a także znajdują się w paznokciach i włosach ¹¹. W szczególności keratynocyty można znaleźć na zewnętrznej osłonce korzenia (ORS) mieszków włosowych, zewnętrznej warstwie komórkowej, która pokrywała łodygę włosa wraz z komórkami wewnętrznej osłonki korzenia (IRS) (¹², ryc. 1). Ponieważ pobieranie włosów jest prostą procedurą, która nie wymaga pomocy personelu medycznego, daje pacjentom możliwość pobrania i wysłania własnych próbek włosów do laboratoriów, co znacznie ułatwiłoby pobieranie próbek od pacjentów do wytworzenia hiPSC. Keratynocyty naskórka mają również wyższą wydajność przeprogramowywania i szybszą kinetykę przeprogramowania w porównaniu z fibroblastami, co zwiększa korzyści płynące z używania keratynocytów jako komórek wyjściowych do wytwarzania hiPSC ^9,13. Ponadto hiPSC mogą być również generowane przy użyciu innych populacji komórek w mieszku włosowym, w tym komórek brodawek skórnych znajdujących się u podstawy mieszka włosowego ^14,15.

Poprzednie doniesienia o generowaniu iPSC za pomocą komórek pochodzących z włosów często wykorzystują retrowirusowe lub lentiwirusowe metody przeprogramowania ^9,14,15. Jednak te metody wirusowe wprowadzają niepożądaną integrację genomową obcych transgenów podczas przeprogramowywania. Dla porównania, zastosowanie wektorów episomalnych stanowi wykonalną, niewirusową metodę przeprogramowania w celu wygenerowania iPSC ^{bez integracji 4}. Wcześniej opracowaliśmy prostą, opłacalną i niewirusową metodę skutecznego przeprogramowania keratynocytów w hiPSC przy użyciu wektorów episomalnych ¹³. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół generowania hiPSC pochodzących z keratynocytów, w tym wyprowadzanie keratynocytów z wyrwanych włosów, ekspansję i utrzymanie keratynocytów, a następnie przeprogramowanie w celu wytworzenia hiPSC.

Protokół

Pobieranie próbek ludzkich włosów od osób indywidualnych wymaga etycznego zatwierdzenia przez komisję etyki badań na ludziach w instytucjach goszczących i powinno być przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucji.

1. Izolacja keratynocytów z wyrwanych włosów

1. Rozmrozić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (tj. Matrigel) na lodzie O/N.
2. Za pomocą wstępnie schłodzonych końcówek pipet dodać 200 μl roztworu ECM do 12 ml schłodzonego podłoża DMEM/F12. Pokryć 12-dołkową płytkę 1 ml rozcieńczonego roztworu ECM w każdym dołku. Inkubować powlekaną płytkę O/N w temperaturze 37 °C. Przed użyciem umyć powlekaną płytkę wstępnie podgrzanym podłożem DMEM/F12.
3. Zbierz pierwotne ludzkie włosy z głowy osoby, umieszczając palce blisko nasady włosów i wyrywając włosy jednym szybkim i płynnym ruchem. Sprawdź, czy każdy pobrany włos zawiera nienaruszony mieszek włosowy i określ fazę wzrostu włosa pod mikroskopem preparacyjnym (ryc. 1).
   1. Zbierz 5-10 włosów anagenowych od każdej osoby, aby wydobyć keratynocyty. Wyrywane włosy należy przetwarzać tak szybko, jak to możliwe, aby zapewnić pomyślne wyprowadzenie keratynocytów.
      Uwaga: Rysunek 1 ilustruje morfologię włosów w różnych fazach cyklu wzrostu. Włosy anagenowe są w fazie wzrostu, z widoczną zewnętrzną warstwą nabłonka otaczającą długość włosa, znaną jako ORS. Z drugiej strony, włosy telogenowe reprezentują włosy w fazie spoczynku i nie mają widocznego ORS, ale mają wyraźną kulkę komórek pokrywającą korzeń włosa, znaną jako wybrzuszenie telogenowe.
4. Umieść próbki włosów na szalce Petriego zawierającej 10 ml mieszanki antybiotyków do mycia przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Za pomocą wysterylizowanych nożyczek i kleszczyków odetnij nadmiar łodygi włosa, pozostawiając fragment włosa z nienaruszonym mieszkiem włosowym i około 0,5 - 1 cm łodygi włosa.
6. Ostrożnie przenieś 1 fragment włosa do każdego dołka płytki pokrytej ECM za pomocą kleszczy.
7. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml dodaj około 3 krople medium (~100 - 200 μl) Knockout Serum Replacement (KSR) (~100 - 200 μl) do próbek włosów.
   Uwaga: Utrzymuj fragmenty włosów w bliskim kontakcie z powierzchnią płytki, aby umożliwić przyczepienie się i późniejszy przerost keratynocytów. Dodanie nadmiernej ilości podłoża na tym etapie może spowodować unoszenie się fragmentów włosów i zmniejszenie szans na udane przyczepienie włosów.
8. Próbki włosów należy inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% stężeniem_CO2 i pozwolić mieszkom włosowym na przyłączenie O/N. Następnego dnia delikatnie dodaj kolejne 3 krople pożywki KSR (~100 - 200 μl), aby próbki włosów były wilgotne.
9. Codziennie obserwuj próbki włosów, aby potwierdzić, że mieszki włosowe pomyślnie się przyczepiły. Zazwyczaj przyczepienie mieszków włosowych jest widoczne w ciągu 1-3 dni. Grube włosy są zwykle łatwiejsze do przyczepienia w porównaniu z cienkimi włosami, ponieważ cienkie włosy mają większą tendencję do unoszenia się, co utrudnia proces mocowania.
   1. Gdy włosy przylgną do powlekanej płytki, dodaj 500 μl podłoża KSR do dołka. Zachowaj szczególną ostrożność podczas dodawania podłoża, ponieważ próbki włosów mogły nie przylegać mocno. Od tego momentu zmieniaj media co 2 dni.
      Uwaga: Wyrostki keratynocytów powinny być widoczne z obszaru ORS fragmentu włosa po 3-7 dniach (ryc. 2A-B). Pozwól keratynocytom rosnąć do 14 dni przed pasażowaniem komórek, jak opisano w następnym rozdziale.

2. Utrzymanie i pasażowanie keratynocytów

1. Wstępnie pokryj płytkę 6-dołkową za pomocą zestawu Coating Matrix Kit. Dodać 680 μl pożywki rozcieńczającej z zestawu do każdego dołka, a następnie 6,8 μl roztworu matrycy powlekającej. Potrząśnij płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie roztworu Coating Matrix na płytce.
2. Pozostawić powlekaną płytkę do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór matrycy powlekającej przed posiewem keratynocytów.
3. Dysocjować keratynocyty do zawiesiny jednokomórkowej z 500 μl 0,25% trypsyny na studzienkę przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C. Dezaktywować trypinę za pomocą 500 μl pożywki zawierającej surowicę (np. pożywki dla płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) i zebrać do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Usuń fragment włosów za pomocą wysterylizowanych kleszczy.
4. Określ liczbę pobranych komórek za pomocą hemocytometru.
5. Odwirować komórki przez 3 minuty przy 200 x g. Umyć komórki PBS i powtórzyć wirowanie. Odessać PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżym pożywce keratynocytowej.
6. Płytki 4 × 10⁴ keratynocytów do jednego dołka płytki pokrytej ECM w obecności pożywki keratynocytów. Przechowywać keratynocyty w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 (}ryc. 2C). Zmieniaj pożywkę codziennie i pasażuj komórki, gdy hodowla jest zlewająca się w ~ 80%, co może zająć około 2-7 dni w zależności od liczby pasaży i szybkości proliferacji keratynocytów. Otrzymane keratynocyty należy rozmnożyć w celu wytworzenia wystarczającej ilości zamrożonych zapasów przy użyciu standardowych metod kriokonserwacji^{powolnego zamrażania 16}.
   Uwaga: Opisane warunki hodowli wspierają ekspansję jednorodnej populacji keratynocytów o typowej morfologii bruku (ryc. 2C). Czasami w hodowli można zaobserwować kilka zróżnicowanych keratynocytów, o dużej i płaskiej morfologii, które utraciły potencjał replikacyjny. Charakterystykę keratynocytów można przeprowadzić poprzez barwienie immunologiczne przy użyciu przeciwciał przeciwko cytokeratynie 14, jak opisano wcześniej ¹⁷. Ustalone linie komórkowe keratynocytów powinny być również badane na obecność mykoplazmy po 1-3 pasażach przy użyciu dostępnego na rynku zestawu.

3. Generowanie hiPSC z keratynocytów za pomocą wektorów episomalnych

1. Wstępnie pokryć 6-dołkową płytkę 0,1% żelatyną (2 ml/basenik). Pozostawić żelatynę do pokrycia przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej.
2. Do eksperymentu z przeprogramowaniem należy użyć keratynocytów nie później niż w pasażu 6. Dysocjować keratynocyty do zawiesiny jednokomórkowej z 1 ml 0,25% trypsyny na studzienkę przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C. Dezaktywować trypsynę za pomocą 1 ml pożywki zawierającej surowicę (np. pożywki FBS) i zebrać w probówce o pojemności 15 ml.
3. Odwirować komórki przez 3 minuty przy 200 x g i ponownie zawiesić komórki w pożywce keratynocytowej. Płytka 1 × 10 5-1,5 × 10⁵ keratynocytów na studzienkę w żelatynizowanej płytce O / N.
4. Następnego dnia (Dzień 0) sprawdź płytkę, aby upewnić się, że komórki są zlewające się w 50-60%.
   Uwaga: Jeśli keratynocyty są mniej niż ~50% zlewające się, mogą nie rosnąć dobrze po transfekcji.
5. W dniu 0 należy przeprowadzić transfekcję episomalnych wektorów przeprogramowujących na keratynocytach, stosując stosunek 8 μl odczynnika do transfekcji na 2 μg całkowitego plazmidowego DNA.
   1. Pobrać 0,5 μg dla każdego z 4 plazmidów (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3/4-shP53F, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL) i rozcieńczyć w 100 μl zredukowanej pożywki surowicy (np. OPTI-MEM).
      Uwaga: Plazmid pCXLE-eGFP służy do monitorowania wydajności transfekcji w keratynocytach i nie jest wymagany do pomyślnego przeprogramowania.
   2. Dodać 8 μl odczynnika do transfekcji do rozcieńczonego DNA. Wymieszaj, przesuwając rurkę. Pozostawić mieszaninę reakcyjną DNA do niezakłóconego spoczynku w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
   3. Zastąp pożywkę keratynocytów świeżą pożywką.
   4. Delikatnie dodać mieszaninę reakcyjną DNA do hodowli keratynocytów i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 4 godziny
      Uwaga: Nie zaleca się wykonywania przedłużonej transfekcji O/N w keratynocytach, ponieważ wykazują one niską przeżywalność po transfekcji.
   5. Po 4 godzinach od transfekcji zastąp pożywkę keratynocytów świeżą pożywką.
6. W dniu 1 (1 dzień po transfekcji) zmień pożywkę keratynocytów i sprawdź skuteczność transfekcji, szacując procent komórek eGFP dodatnich pod mikroskopem fluorescencyjnym. Zazwyczaj przy użyciu tego protokołu obserwuje się > 60-70% skuteczności transfekcji dla keratynocytów pierwotnych.
7. W dniu 2 powtórz transfekcję zgodnie z opisem w kroku 3.5. Dwie kolejne transfekcje zazwyczaj osiągają > 90% skuteczności transfekcji. Posiew keratynocytów zwykle osiąga konfluencję pod koniec drugiej transfekcji.
   1. Przygotuj 10-centymetrowe naczynie z karmnikiem dla mysich fibroblastów zarodkowych (MEF) dla każdej reakcji przeprogramowania. Przygotuj mitotycznie inaktywowane podajniki MEF, jak opisano wcześniej ¹⁸.
   2. Wstępnie pokryj 10 cm naczynie 5 ml 0,1% żelatyny przez co najmniej 20 minut. Tabliczka 4 × 10⁶ mitotycznie inaktywowany MEF na 10 cm naczynie w pożywce FBS. Pozostawić komórki do osadzenia się i przyłączyć O/N do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
8. W dniu 3 zbierz keratynocyty z 0,25% trypsyny, jak opisano w krokach 3.2 i 3.3. Ponownie zawiesić keratynocyty w pożywce KSR i umieścić 90% keratynocytów z 1 dołka na płytce 6-dołkowej do 10-centymetrowego naczynia podajnika MEF z pożywką KSR.
9. Począwszy od 4 dnia, należy codziennie wymieniać podłoże KSR.
   1. Alternatywnie po 18 dniu należy wymieniać pożywkę hodowlaną co drugi dzień.
      Uwaga: Nieprzeprogramowane keratynocyty przestaną się namnażać, podczas gdy kolonie hiPSC o określonej granicy, które przypominają ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC), pojawią się od 14 do 21 dnia.
10. Izolować kolonie hiPSC przez ręczną sekcję od 21 dnia. Unikaj kolonii hiPSC, które są blisko siebie skupione i wybieraj tylko te kolonie, które są wyraźnie oddzielone od innych.
    Uwaga: kolonie hiPSC można zbierać wcześniej, ale kolonia o określonych granicach może nie być oczywista we wcześniejszych punktach czasowych, biorąc pod uwagę mały rozmiar kolonii. Wydajność przeprogramowania może się różnić w zależności od keratynocytów pacjenta, a także wpływają na nią inne czynniki, takie jak liczba pasaży lub szybkość proliferacji keratynocytów.
    1. Do ręcznego wypreparowania kolonii hiPSC użyj igły 26G, aby wyciąć kolonie hiPSC pod mikroskopem preparacyjnym. Pokrój kolonię hiPSC na małe kawałki o długości około 300 - 600 μm. Przenieś kawałki z jednej kolonii hiPSC na nową płytkę podającą MEF (2,5 × 10⁴ MEF/cm²), aby ustalić linię klonalną hiPSC. Początkowo należy wyhodować każdą linię klonu hiPSC w jednym dołku na 12-dołkowej płytce lub szalce do hodowli narządów, a następnie rozszerzyć do formatu płytki 6-dołkowej.
    2. Utrzymuj ustalone linie klonalne hiPSC w pożywce KSR na zasilaczach MEF. Gdy hodowla osiągnie 70 - 80% zbieżność z koloniami hiPSC o średnicy ~1,5 mm, należy przejść hiPSC za pomocą standardowych metod pasażowania enzymatycznego (Accutase, Dispase lub Collagenaza IV) zgodnie z instrukcją producenta.
11. Scharakteryzować ustalone linie hiPSC, aby potwierdzić pluripotencję i ich zdolność do różnicowania się w komórki reprezentatywne dla trzech listków rozrodczych in vitro i/lub in vivo^13,19. Ponadto rutynowo testuj ustalone linie hiPSC dla mykoplazmy przy użyciu dostępnych na rynku zestawów, aby upewnić się, że są wolne od patogenów. Rutynowe monitorowanie stabilności genomowej linii hiPSC za pomocą kariotypowania lub analizy zmienności liczby kopii (CNV) opartej na macierzy.

Wyniki

Włosy przechodzą przez 3 różne fazy cyklu wzrostu: anagen (faza wzrostu), katagen (faza regresji) i telogen (faza spoczynku) ^20,21. Mieszek włosowy anagenu zawiera wiele warstw nabłonka; warstwy te obejmują ORS, IRS i łodygę włosa (ryc. 1). Włos anagenowy ostatecznie przechodzi w fazę katagenu, która objawia się apoptozą ORS i zakończeniem różnicowania łodygi włosa. Wreszcie włosy katagenowe przechodzą w fazę telogenu, w której apoptoza ustaje, a mieszek telogenowy przechodzi w stan spoczynku ...

Dyskusja

Wytwarzanie specyficznych dla pacjenta hiPSC oferuje unikalne podejście do badania patogenezy chorych typów komórek in vitro, a także stanowi platformę do badań przesiewowych leków w celu identyfikacji nowych cząsteczek, które mogą uratować fenotypy choroby. To podejście do modelowania chorób z wykorzystaniem hiPSC przyniosło obiecujące wyniki w przypadku różnych chorób, w tym zespołu wydłużonego odstępu QT, choroby Huntingtona, choroby Parkinsona i stwardnienia zanikowego bocznego ²². Podjęto już kil...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mieszanka antybiotyków:
250 ng / ml Przeciwgrzybicza amfoterycyna B	Sigma	A2942-20ml	Mieszanka antybiotyków składa się z PBS.
1X Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15140-122
PBS (-)	Invitrogen	14190-144
Wymiana surowicy nokautującej (KSR) średnia:			Pożywka KSR jest filtrowana za pomocą Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) przed użyciem. bFGF jest dodawany świeży do podłoża przed użyciem.
20% zamiennik surowicy nokautującej (KSR)	Invitrogen	10828-028
DMEM/F12 z glutamax	Invitrogen	10565-042
1 razy; MEM endogenny aminokwas	Invitrogen	11140-050
0,5 razy; Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15140-122
0,1 mM β-merkaptoetanol	Invitrogen	21985
bFGF (10 ng/ml, dodane świeże)	Millipore	GF003
Pożywka keratynocytu:
EpiLife z 60  &mikro; M Calcium	Invitrogen	M-EPI-500-CA
1 razy; Ludzki suplement na wzrost keratynocytów (HKGS)	Invitrogen	S-001-5
Płodowa surowica bydlęca (FBS) średnia:			Pożywka FBS jest filtrowana za pomocą Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) przed użyciem.
10% płodowa surowica bydlęca (FBS)	Invitrogen	26140079
DMEM	Invitrogen	11995-073
0,5x Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15140-122
2 mM L-glutamina	Invitrogen	25030
0,25% trypsyna-EDTA	Invitrogen	25200-056
Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM):
Matrigel	Corning	354234	Zapas Aliquot Matrigel i przechowywanie w -80° C zgodnie z instrukcją producenta s instrukcje. Stężenie zapasów Matrigel różni się nieznacznie w zależności od partii (~9 mg / ml). Zalecamy stosowanie 200µ l matryca do powlekania płytki 12-dołkowej (~150µ g/dobrze).
Zestaw matryc do powlekania	Plazmidy Invitrogen	R-011-K
:			Należy pamiętać, że pCXLE-eGFP jest używany tylko do monitorowania wydajności transfekcji i nie jest wymagany do przeprogramowywania.
-                  pCXLE-eGFP	Addgene	27082
-                  pCXLE-hOct3/4-shP53F	Addgene	27077
-                  pCXLE-hSK	Addgene	27078
-                  pCXLE-hUL	Addgene	27080
Odczynnik do transfekcji Fugene HD	Promega	E231B
Żelatyna (ze skóry wieprzowej)	Sigma	G1890	Uzupełnić 0,1% żelatyny w wodzie destylowanej. Autoklaw przed użyciem.
Zredukowana pożywka surowicy: OPTI-MEM	Invitrogen	31985062
Accutase	Sigma	A6964-100ml
Podajnik mysich fibroblastów zarodkowych (MEF)	MEF może być inaktywowany przez leczenie mitomycyną C lub napromienianie, jak opisano wcześniej 16.
Igła 26G	Terumo	NN2613R
płytka 6-dołkowa (poddana działaniu kultur tkankowych)	BD Biosciences	353046
płytka 12-dołkowa (poddana działaniu kultur tkankowych)	BD Biosciences	353043
10 cm szalka (poddana działaniu kultur tkankowych)	BD Biosciences	353003
Dispase	Invitrogen	17105-041	Stosować w dawce 10 mg/ml
Kolagenaza IV	Invitrogen	17104-019	Stosować w dawce 1 mg/ml
przeciwciało TRA-160	Milipore	MAB4360	Stosować w dawce 5 &mikro; g / ml
OCT4 przeciwciało	Santa Cruz	SC-5279	Stosować przy 5 &mikro; g/ml
przeciwciało NANOG	R& D Systems	AF1997	Zastosowanie przy 10 &mikro; g/ml
Zestaw detekcyjny MycoAlert	Lonza	LT07-418