Dostarczanie białek, peptydów lub nieprzepuszczalnych dla komórek małych cząsteczek do żywych komórek przez inkubację z odczynnikiem endosomolitycznym dfTAT

Podsumowanie

Opisujemy, jak dostarczać białka i nieprzepuszczalne dla komórek małe cząsteczki do hodowanych komórek ssaków za pomocą prostego protokołu koinkubacji z odczynnikiem, który powoduje nieszczelność organelli endocytarnych.

Streszczenie

Strategie dostarczania makromolekularnego zazwyczaj wykorzystują szlak endocytarny jako drogę wejścia do komórki. Jednak uwięzienie endosomalne poważnie ogranicza efektywność, z jaką makrocząsteczki przenikają do cytozolowej przestrzeni komórek. Ostatnio obeszliśmy ten problem, identyfikując odczynnik dfTAT, dimer wiązania dwusiarczkowego peptydu TAT znakowany fluoroforem tetrametylorodaminą. Uzyskaliśmy znakowany fluorescencyjnie dimer prototypowego peptydu penetrującego komórki (CPP) TAT, DFTAT, który wnika do żywych komórek i dociera do przestrzeni cytozolowej komórek ze szczególnie wysoką wydajnością. Cytozolowe dostarczanie dfTAT osiąga się w wielu liniach komórkowych, w tym w komórkach pierwotnych. Co więcej, dostarczanie nie wpływa zauważalnie na żywotność komórek, proliferację ani ekspresję genów. dfTAT może dostarczać małe cząsteczki, peptydy, przeciwciała, biologicznie aktywne enzymy i czynnik transkrypcyjny. W tym raporcie opisujemy protokoły związane z syntezą dfTAT i dostarczaniem komórkowym. W manuskrypcie opisano, w jaki sposób można kontrolować ilość białka dostarczanego do przestrzeni cytozolowej komórek poprzez różnicowanie ilości białka podawanego zewnątrzkomórkowo. Na koniec omówiono obecne ograniczenia tej nowej technologii i kroki związane z walidacją dostarczania. Opisane protokoły powinny być niezwykle przydatne w testach komórkowych, a także w manipulacji ex vivo i przeprogramowywaniu komórek.

Wprowadzenie

Dostarczanie białek, peptydów lub małych cząsteczek nieprzepuszczalnych dla komórek do żywych komórek jest często pożądane w wielu zastosowaniach biologicznych lub biotechnologicznych (obrazowanie komórkowe, testy funkcjonalne, przeprogramowanie komórek, itp.)^1-4. Opisano już wiele metod podawania, w tym mikroiniekcję, elektroporację lub stosowanie środków niosących (np. peptydów penetrujących komórki, takich jak TAT, lipidy)^5-7. Każda technika ma zazwyczaj określone zalety i wady, które mogą sprawić, że te podejścia będą odpowiednie dla niektórych zastosowań, ale nie dla innych. Typowe problemy obejmują niską wydajność dostarczania i/lub brak kontroli nad ilością dostarczanego materiału^8,9, toksyczność lub szkodliwy wpływ fizjologiczny^10,11, brak kontroli czasowej, dostarczanie w kilku komórkach, ale nie w całej populacji (np. mikroiniekcja)¹² oraz złożone schematy koniugacji chemicznej lub formulacji¹¹.

Ostatnio opracowaliśmy nowatorską strategię dostarczania, która pozwala obejść te ograniczenia. Strategia ta opiera się na peptydzie o nazwie dfTAT (dimer fluorescencyjny TAT)¹³. dfTAT wywodzi się z dobrze znanego peptydu penetrującego komórki (CPP) TAT. dfTAT zawiera dwie dwusiarczkowe kopie TAT znakowane fluoroforem tetrametylorodaminą. Pomimo podobieństw, TAT i dfTAT różnią się znacznie pod względem aktywności. TAT jest zwykle internalizowany do komórek przez endocytozę. Ten CPP pozostaje jednak w większości uwięziony w endosomach (zwykle prowadzi to do punktowego rozkładu peptydu wewnątrz komórek podczas badania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej). Podobnie jak TAT, dfTAT jest skutecznie endocytozowany przez komórki. Jednak dfTAT nie pozostaje uwięziony w endosomach. Zamiast tego pośredniczy w wycieku endosomalnym w sposób, który jest niezwykle skuteczny. Aktywność endosomolityczna dfTAT może być następnie wykorzystana do dostarczania makrocząsteczek za pomocą prostego testu inkubacyjnego.

Obecne rozumienie procesu dostarczania jest następujące. dfTAT indukuje makropinocytozę. W rezultacie komórki inkubowane za pomocą dfTAT pobierają rozpuszczalne białka, peptydy lub małe cząsteczki (cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania, MOI) obecne w pożywkach przez endocytozę w fazie płynnej (patrz ryc. 1). Interakcje między dfTAT i MOI nie są konieczne, o ile obie jednostki komunikują się razem w szlaku endocytarnym. Gdy dfTAT osiąga pewien próg w świetle organelli endocytarnych, wyraża swoją endosomalną aktywność wyciekową (szczegóły molekularne pozostają do pełnego scharakteryzowania). Zawartość światła nieszczelnych organelli, a tym samym MOI, jest następnie uwalniana do komórek. Takie podejście jest zatem bardzo wygodne, ponieważ nie są wymagane żadne schematy koniugacji ani formułowania z MOI. Co więcej, ponieważ dfTAT nie modyfikuje bezpośrednio MOI, nie powinien również zakłócać funkcji MOI po osiągnięciu dostarczania wewnątrzkomórkowego. Ponadto stężenie zużytego dfTAT jest niezależne od stężenia MOI w pożywkach. Na przykład stężenie dfTAT może być utrzymywane na stałym poziomie między różnymi eksperymentami, aby zagwarantować powtarzalną skuteczność w przypadku wycieku endosomalnego. W przeciwieństwie do tego, stężenie MOI w pożywkach może być stopniowo zmieniane, aby osiągnąć pożądane poziomy MOI dostarczanego w cytozolu.

Wysoka skuteczność przecieku endosomalnego osiągnięta za pomocą dfTAT jest niezwykle nieszkodliwa dla wielu komórek testowanych do tej pory. Jest to niespodzianka, ponieważ organelle endocytarne są ważnym składnikiem komórek i można by się spodziewać, że dramatycznemu wyciekowi, w którym pośredniczy dfTAT, będą towarzyszyć szkodliwe odpowiedzi komórkowe. Jednak leczone komórki namnażają się w tym samym tempie co komórki nieleczone i nie wykazują żadnych znaczących zmian w swoim transkryptomie. Co więcej, poród można powtórzyć w ciągu kilku minut z powtarzalną wydajnością dostarczania, co wskazuje, że komórki mogą tolerować lub regenerować się po procesie dostarczania bez utraty zdolności do endocytozy lub wycieku endosomalnego. Subtelne reakcje komórkowe mogą mieć miejsce podczas dostarczania dfTAT, a molekularne szczegóły tego, jakie mogą być te reakcje, pozostają do zbadania. Jednak dzięki połączeniu wysokiej wydajności, wygody protokołów i braku toksyczności, to podejście do dostarczania powinno okazać się natychmiast przydatne w wielu zastosowaniach opartych na komórkach. Przedstawione w niniejszym dokumencie protokoły mają na celu udostępnienie tej technologii środowisku naukowemu.

Protokół

1. SPPS: CK(TMR)TATG (fTAT) Synteza

Uwaga: dfTAT jest wytwarzany w dwóch etapach: synteza monomeru fTAT przez syntezę peptydu w fazie stałej, a następnie dimeryzacja wiązań dwusiarczkowych do utworzenia dfTAT.

1. Pęcznieć 500 mg żywicy amidowej MBHA w dimetyloformamidzie (DMF) w standardowym naczyniu SPPS o pojemności 50 ml przez 1 godzinę.
2. Wykonaj deprotekcję Fmoc poprzez inkubację żywicy chronionej Fmoc w 20% roztworze piperydyny (20% piperydyny w DMF, 10 ml (0,30 mmol). Etapy odbezpieczania należy przeprowadzić dwukrotnie (1 x 5 min i 1 x 15 min) z etapem płukania przy użyciu DMF (etap mycia obejmuje wielokrotne płukanie żywicy o łącznej objętości około 150 ml DMF i usunięcie rozpuszczalnika przez filtrację próżniową) pomiędzy reakcjami.
3. Zsyntetyzuj CK(TMR)RKKRRQRRRG (fTAT) na lodowisku z żywicy amidowej MBHA. Stosuj następujące aminokwasy chronione przez Fmoc: Fmoc-Lys(Mtt)-OH (tylko na N-końcu), Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH i Fmoc-Cys(Trt)-OH. Przeprowadzić reakcję przy użyciu_N2 (20 PSI) w celu zamieszania reakcji. Wykonaj wszystkie reakcje w temperaturze pokojowej.
   1. Przeprowadzaj każdą reakcję sprzęgania aminokwasów przez 4 godziny. Do każdego sprzężenia należy użyć aminokwasu chronionego Fmoc (1,2 mmol), N,N,N′,N′ -Tetrametylo-O-(1 H-benzotriazol-1-ylo)heksafluorofosforan uronu (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol) i diizopropyloetyloamina (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) rozpuszczonych w DMF. Po 4-godzinnym sprzęgle umyj żywicę DMF i wykonaj krok deochrony Fmoc zgodnie z opisem w kroku 1.2.
   2. Powtarzaj, aż zostanie zsyntetyzowany liniowy łańcuch peptydowy fTAT (Liniowy łańcuch peptydowy: CKRKKRRQRRRRG no TMR).
   3. Następnie dokładnie umyj żywicę za pomocą najpierw DMF, a następnie dichlorometanu (DCM). Przepłukać żywicę wielokrotnie łączną objętością około 150 ml DMF lub DCM i usunąć rozpuszczalnik przez filtrację próżniową.
   4. Użyj MALDI-TOF, aby potwierdzić, że otrzymany peptyd ma prawidłową masę cząsteczkową.
      1. Sporządzić mieszaninę matrycy, dodając 1 mg matrycy do roztworu składającego się z 50 μl 0,01% TFA w roztworze wodnym i 50 μl acetonitrylu.
      2. Aby potwierdzić liniową masę łańcucha peptydowego, użyj kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego. Uruchomić analityczną HPLC surowego peptydu i zebrać 50 μl z wierzchołka czystego piku.
      3. Aby przygotować próbkę do płytki na płytce MALDI: Dodać 8 μl peptydu do 2 μl roztworu matrycy i umieścić na płytce MALDI do wyschnięcia na powietrzu lub na płytce grzewczej o temperaturze 37 °C.
         Uwaga: Arginina jest znana jako aminokwas trudny do sprzężenia w SPPS. Udane sprzężenie ustala się poprzez wykonanie testu Kaisera¹⁴ (np. testu ninhydryny). Test ten pozwala na wykrycie wolnych amin, które mogą pozostać niesprzężone na żywicy. W przypadku wykrycia niebieskiego koloru (wskazującego na obecność wolnych amin), kroki sprzęgania są powtarzane.
4. Dla CK(-NH-TMR)TATG (fTAT) rozszczepić grupę ochronną Mtt w grupie -aminowej Lys na CK(-NH-Mtt)TATG roztworem złożonym z 1% kwasu trifluorooctowego (TFA) i 2% triizopropylosilanu (TIS) w DCM.
   1. Ponieważ usunięcie grupy ochronnej MTT spowodowałoby pojawienie się żółtego koloru, należy inkubować żywicę z 20 ml powyższego roztworu przez 5 minut, powtarzać tę czynność, aż nie będzie obserwowany żółty kolor. Pomiędzy nimi umyj żywicę za pomocą DCM i DMF. Dodatkowo, ponieważ TIS jest zmiataczem, który oczyszcza MTT, w obecności MTT w roztworze nie pojawia się żaden żółty kolor.
   2. Dodaj dodatkowy roztwór z 1% TFA w DCM (bez TIS) do żywicy, aby upewnić się, że MTT nie zostanie już usunięty, a roztwór pozostanie klarowny.
5. Rozpuścić trzy składniki: karboksytetrametylodaminę (TMR), HBTU i DIEA (równoważność 4, 3,9 i 10 w odniesieniu do ilości żywicy (w mg)) w DMF i dodać tę mieszaninę do żywicy i przeprowadzić reakcję O/N przy użyciu suchego_N2 w celu zapewnienia mieszania.
6. Po deprotekcji Fmoc i koniugacji aminokwasów, umyj żywicę DCM i pozostaw do wyschnięcia. Aby uzyskać całkowite rozszczepienie peptydu z żywicy, dodaj roztwór zawierający 92,5% TFA, 2,5%_H2O, 2,5%, TIS i 2,5% etanedithiolu (EDT) (całkowita objętość = 4 ml) do żywicy peptydylo-restynowej przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, aby uzyskać globalną deprotekcję i rozszczepienie z żywicy.
   1. Surowe produkty peptydowe należy wytrącić za pomocą zimnego bezwodnego eteru etylowego (Et₂O), spuszczając roztwór z etapu 1.6 do 40 ml Et₂O, odwirować go w temperaturze 4 °C i 4 000 x g przez 20 - 25 minut. Powtórzyć ten krok, aby umożliwić przepłukanie osadu zimnym bezwodnym Et₂O.
   2. Ponownie zawiesić osady w wodzie (5 ml lub do całkowitego rozpuszczenia osadu) i liofilizować. Następnie ponownie zawiesić otrzymane produkty w 0,1% wodnym roztworze TFA/acetonitrylu.
7. Przeprowadzić analizę HPLC za pomocą analitycznej kolumny C18 (5 μm, 4 x 150 mm) w celu analizy każdego peptydu. Stosować natężenie przepływu 1 ml/min i detekcję przy 214 nm i 550 nm.
8. Wykonać półpreparatywną HPLC na kolumnie C18 10 x 250 mm w celu oczyszczenia peptydów. Stosować natężenie przepływu 4 ml/min i detekcję przy 214 nm i 550 nm. Dla wszystkich przebiegów należy stosować gradienty liniowe 0,1% wodnego roztworu TFA (rozpuszczalnik A) i 90% acetonitrylu, 9,9% wody i 0,1% TFA (rozpuszczalnik B).
9. Potwierdź poprawną tożsamość peptydów przez MALDI-TOF zgodnie z protokołem producenta: fTAT, oczekiwana masa: 2 041,17, obserwowana masa: 2040,66. DEAC-K9, oczekiwana masa: 1 412,97, obserwowana masa: 1 415,59. Użyj matrycy kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego do MALDI-TOF.

2. Reakcja utleniania: Generacja dfTAT

1. Napowietrzać sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) o pH 7,4 przez 1 godzinę (co najmniej 5 ml dla poniższej reakcji).
2. Rozpuścić fTAT (0,3 mg, 1,5 x ^10-4 mmol) w napowietrzonym PBS o pH 7,4 (5 ml). Upewnij się, że pH wynosi od 7,0 do 7,5 po dodaniu peptydu. Jeśli nie, dodać wodorotlenek sodu (1 M, małymi krokami 1 - 5 μl), aby przywrócić pH do 7,4.
3. Uwaga: Tlen rozpuszczony w PBS działa w celu utlenienia grup tiolowych na fTAT i utworzenia wiązania dwusiarczkowego.
4. Nutować reakcję O/N, aby umożliwić jej reakcję aż do zakończenia (100% wydajność na podstawie analizy HPLC). Oczyścić produkt za pomocą HPLC z odwróconymi fazami i przeanalizować za pomocą spektrometrii mas (MALDI-TOF), jak w kroku 1.9. Oczekiwana masa: 4 080,34, obserwowana masa: 4 084,21.
5. Liofilizować czysty dfTAT (0,71 ^x10-4 mmol) i ponownie zawiesić w 200 μl wody (stężenie czystego dfTAT = 356,3 μM).

3. Pomiar stężenia dfTAT

1. Zawiesić podwielokrotność oczyszczonego dfTAT (zazwyczaj 1 μl w zależności od ilości oczyszczonego peptydu) w 149 μl 50 mM roztworu TCEP.
2. Uwaga: Na tym etapie dfTAT jest redukowany do swojego monomerowego odpowiednika fTAT w celu wyeliminowania wygaszania absorbancji, które występuje z powodu bliskiego sąsiedztwa fluoroforu TMR w dfTAT (współczynnik ekstynkcji ε TMR w dfTAT jest zmniejszony w porównaniu z ε TMR w zredukowanym fTAT).
3. Pozostawić próbkę do reakcji przez około 20 minut (do potwierdzenia powstania fTAT można użyć analitycznej HPLC).
4. Dodać cały roztwór do kuwety kwarcowej i zmierzyć absorbancję przy 556 nm.
5. Korzystając z prawa Beera ( A = εcl : ε = 91 500 ^{M-1 cm-1}) do obliczenia stężenia fTAT, określ stężenie dfTAT i podziel [fTAT] przez dwa.

4. Eksperymenty z dostarczaniem komórkowym

1. Zasiej komórki (HeLa, HDF itp.) w naczyniu o zbiegu 80 - 90% (np. szalka 8-dołkowa lub 24-dołkowa). Hoduj komórki w odpowiednim podłożu (np. DMEM uzupełnionym 10% FBS i Pen/Strep) do 80 - 90% konfluencji w wilgotnej atmosferze o temperaturze 37 °C zawierającej 5% CO₂ .
2. Umyj komórki trzykrotnie (3X) PBS (dodając 200 μl PBS, a następnie trzykrotnie usuwając).
3. Uzyskać stężenie robocze dfTAT 5 μM, rozcieńczając zapas dfTAT (w wodzie) w pożywce nrL-15 (dla naczynia 8-dołkowego całkowita objętość powinna wynosić 200 μl). Stężenie 5 μM dfTAT prowadzi do efektywnego dostarczania (wysoki poziom dostarczania cytozolowego w ponad 90% komórek obecnych w naczyniu) w większości testowanych do tej pory typów komórek (ryc. 3). Jednak niższe lub wyższe stężenia mogą być bardziej odpowiednie dla typów komórek o wysokiej lub niskiej skłonności do penetracji.
   UWAGA O POŻYWCE: nrL-15 jest używany do dostarczania dfTAT, ponieważ nie zawiera cysteiny, która mogłaby zmniejszyć wiązanie dwusiarczkowe w dfTAT. Jednak nasze dane wskazują, że zarówno zwykła L-15 (z cysteiną), jak i DMEM mogą być stosowane jako media dostarczające. L-15 zawiera aminokwas redukujący cysteinę, ale cysteina prawdopodobnie utlenia się w pożywce, tworząc cystynę (DMEM jest sformułowany z cystyną). dfTAT pozostaje zatem nienaruszony w tych pożywkach, a podawanie działa z taką samą wydajnością, jak w przypadku nrL15.
4. Inkubować komórki za pomocą dfTAT (5 μM) z ładunkiem lub bez ładunku (np. EGFP (10 μM)) i utrzymywać w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (czas inkubacji można skrócić, ale dfTAT zwykle wymaga około 30 do 45 minut do wywołania wycieku endosomalnego).
5. Przemyć komórki heparyną (1 mg/ml) w L-15 (zalecane są 3 przemycia) w celu usunięcia dfTAT związanego z błoną plazmatyczną komórek.
6. Inkubuj komórki z nieprzepuszczalnym dla komórek barwnikiem jądrowym, np. Sytox Blue, Sytox Green (2 μM w nrL-15), aby określić, czy błona plazmatyczna komórek jest naruszona (martwe komórki zostaną wybarwione, podczas gdy żywe komórki nie) zgodnie z protokołem producenta.
7. Obrazuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (100-krotne zanurzenie w oleju lub 20-krotny obiektyw). Obraz dfTAT przy użyciu filtra RFP (Ex = 560 ± 20 nm/Em = 630 ± 35 nm).
   Uwaga: Pomyślne dostarczenie prowadzi do rozproszonej fluorescencji dfTAT w całej komórce (ocena dostarczania białka lub peptydu będącego przedmiotem zainteresowania będzie zależeć od zastosowania). Barwienie jąderek przez fTAT (zredukowany produkt dfTAT po wniknięciu cytozolu) może być wykorzystane jako wskazanie, że wykryta fluorescencja jest wewnątrzkomórkowa. fTAT ulegnie degradacji w ciągu kilku godzin. W tym momencie fluorescencja fragmentów degradacji pojawi się jako punktowa. Nie należy tego mylić z rozkładem punktowym, który jest również widoczny, jeśli dfTAT pozostaje nieskutecznie uwięziony w endosomach (może się to zdarzyć, jeśli dfTAT jest obecny w zbyt niskim stężeniu).

5. Kontrolowanie stężenia dostarczonego MOI

1. Zidentyfikuj stężenie "optymalnego dostarczania" wymagane do osiągnięcia skutecznego cytozolowego uwalniania dfTAT w używanym typie komórki. Wykonaj mikroskopię fluorescencyjną na komórkach inkubowanych z rosnącym stężeniem dfTAT. Optymalne stężenie dfTAT definiuje się jako minimalne stężenie, które prowadzi do klarownej cytozolowej "rozproszonej" fluorescencji TMR w około 100% komórek w hodowli.
2. Zmieniaj stężenie MOI stosowane w protokole wspólnej inkubacji, utrzymując stężenie dfTAT na stałym poziomie (np. przy użyciu optymalnego stężenia dostarczania dfTAT). Zmiana czasu inkubacji na mniej niż 1 godzinę może być również opcją zmiany ilości dostarczanego MOI.

Wyniki

Aby ocenić różnicę między fTAT a dfTAT, komórki HeLa inkubowano przez 1 hr z każdym z peptydów w celu określenia różnic w ich lokalizacji komórkowej. Internalizację obu CPP oceniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Rycina 2 pokazuje, że fTAT (20 µM) lokalizuje się w rozkładzie punktowym. Rozkład ten jest zgodny z uwięzieniem peptydów wewnątrz endosomów. W przeciwieństwie do tego, sygnał fluorescencji dfTAT (5 µM) wykazuje jednorodny rozkład w całej cytozolu i jądrze komórkowym. Rycina 3

Dyskusja

Komórki używane do dostarczania dfTAT nie powinny być nadmiernie zlewające (>90% konfluencji), ponieważ może to wpłynąć na wydajność dostarczania. Komórki powinny być również zdrowe: martwe komórki w hodowli mogą uwalniać apoptotyczne fragmenty, z którymi dfTAT może wchodzić w interakcje (np. DNA ze zdegradowanych jąder). To z kolei może wpływać na wydajność dostarczania i jakość obrazowania. Komórki należy dokładnie umyć, aby usunąć FBS przed dodaniem dfTAT. BSA obecne w FBS może wiązać się z dfTAT, co może obn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Heparyna	Sigma	CAS 9041-08-1
SYTOX Blue	Invitrogen	S11348
SYTOX Green	Invitrogen	S7020
nrL15 L-15 (–) cysteina	Hyclon		Na specjalne zamówienie
Aminokwasy chronione Fmoc	Novabiochem
dfTAT			Próbki zostaną dostarczone na życzenie (kontakt: pellois@tamu.edu)
			bezpieczeństwa biologicznego
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny	Olympus	model IXB1	wyposażony w stopień grzewczy utrzymywany na poziomie 37 stopni; C oraz z podświetlaną kamerą Rolera-MGI Plus z urządzeniem EMCCD (Qimaging) z podświetlanym światłem elektronowym.
37 &stopnie; C nawilżany, 5% inkubator
Syntezator peptydów lub naczynie do przygotowania ręcznej syntezy