Ocena wrażliwości okołopłciowej i aktywacji komórek tucznych gruczołu krokowego w mysim modelu separacji noworodków od matek

Podsumowanie

Mierzymy obwodowo-płciową wrażliwość mechaniczną i aktywację komórek tucznych u samców myszy C57BL/6, które przeszły paradygmat stresu we wczesnym okresie życia - separację noworodków od matek, w celu wywołania przedklinicznego modelu przewlekłego zapalenia gruczołu krokowego/przewlekłego bólu miednicy.

Streszczenie

Przewlekłe zapalenie gruczołu krokowego/przewlekły ból miednicy (CP/CPPS) występuje w ciągu całego życia na poziomie 14% i jest najczęstszą diagnozą urologiczną u mężczyzn poniżej 50 roku życia, jednak jest to najmniej poznane i zbadane przewlekłe zaburzenie bólowe miednicy. Znaczna podgrupa pacjentów z przewlekłym bólem miednicy zgłasza, że doświadczyła stresu lub znęcania się we wczesnym okresie życia, co może znacząco wpływać na funkcjonowanie i regulację osi podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA). Aktywacja komórek tucznych, która, jak wykazano, jest zwiększona zarówno w moczu, jak i w wydzielinach sterczowych u pacjentów z CP/CPPS, jest częściowo regulowana przez dalszą aktywację osi HPA. Separacja noworodków od matek (NMS) jest stosowana od ponad dwóch dekad do badania wyników stresu we wczesnym okresie życia w modelach gryzoni, w tym zmian w osi HPA i wrażliwości trzewnej. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół stosowania NMS jako przedklinicznego modelu CP / CPPS u samców myszy C57BL / 6. Opisujemy metodologię wykonywania NMS, ocenę allodynii mechanicznej okołopłciowej oraz histologiczne dowody aktywacji komórek tucznych. Dostarczamy również dowodów na to, że wczesny stres psychologiczny może mieć długotrwały wpływ na męski układ moczowo-płciowy u myszy.

Wprowadzenie

Przewlekły ból miednicy sam w sobie nie jest chorobą, ale raczej terminem związanym z ciągłym spontanicznym i/lub wywołanym bólem doświadczanym przez pacjentów, u których zdiagnozowano zespół jelita drażliwego (IBS), śródmiąższowe zapalenie pęcherza moczowego/zespół bolesnego pęcherza moczowego (IC/PBS), wulwodynię lub przewlekłe zapalenie gruczołu krokowego/zespół przewlekłego bólu miednicy (CP/CPPS). Zespoły te są często współistniejące i mają wiele wspólnych cech, ponieważ nie mają powiązanej patologii ani zidentyfikowanej etiologii, chociaż wykazano, że dysfunkcja w obrębie układu odpornościowego, ośrodkowego układu nerwowego i obwodowego układu nerwowego przyczynia się do utrzymania i progresji tych zaburzeń^1-3. Pacjenci z przewlekłym bólem miednicy są bardziej narażeni na objawy dodatkowych, niezwiązanych z miednicą zaburzeń bólu czynnościowego i zaburzeń nastroju, w tym lęku, depresji i zespołu lęku napadowego^4-6, co wiąże się ze zmienionym funkcjonowaniem osi podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA)^7-10. Narażenie na stres lub traumę we wczesnym okresie życia jest istotnym czynnikiem ryzyka rozwoju nieprawidłowości HPA i związanych z nimi przewlekłych zespołów bólowych^10,11 i w związku z tym znaczna podgrupa pacjentów z funkcjonalnymi zaburzeniami bólu miednicy zgłasza, że doświadczyła niepożądanych zdarzeń w dzieciństwie, takich jak znęcanie się lub zaniedbanie^12-14.

Modele separacji noworodków (NMS), które polegają na usunięciu młodych od matki na określony czas w okresie przed odsadzeniem, były używane przez ostatnie dwie dekady do badania wyników stresu we wczesnym okresie życia. Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że NMS zwiększa aktywację osi HPA i wynikające z niej zachowania podobne do lęku, bezpośrednio wpływając na ekspresję genów w podwzgórzu, a także zakłócając dalszą regulację ze struktur limbicznych^15-18. Wykazano, że zakłócenie prawidłowego funkcjonowania osi HPA przyczynia się do zwiększonej wrażliwości jelita grubego^19-22 i pochwy¹⁶ wykazywanej przez modele NMS gryzoni, ale pomimo obszernej charakterystyki długoterminowych skutków poporodowego zapalenia pęcherza moczowego^23-25, wpływ stresu we wczesnym okresie życia w dużej mierze nie został zbadany w narządach moczowo-płciowych. Dlatego w poniższym badaniu opisano, jak wykonać NMS u myszy, a następnie ocenić wrażliwość mechaniczną okołopłciową i infiltrację/aktywację komórek tucznych w prostacie, aby potwierdzić zastosowanie samców myszy NMS jako modelu przedklinicznego CP / CPPS.

Spośród wszystkich zdiagnozowanych przewlekłych zaburzeń bólowych miednicy, CP/CPPS jest prawdopodobnie najmniej rozpoznanym i scharakteryzowanym zespołem, pomimo częstości występowania w ciągu życia około 14% ²⁶ i rocznych kosztów leczenia szacowanych na $4,400 (dwa razy więcej niż ból krzyża lub reumatoidalne zapalenie stawów²⁷). Pacjenci z CP/CPPS zgłaszają ból krocza, odbytnicy, prostaty, prącia, jąder i/lub brzucha²⁸, doświadczają wyższego stopnia stresu psychicznego niż pacjenci z grupy kontrolnej²⁹ i często występują u nich objawy przewlekłego bólu miednicy lub zaburzeń nastroju lub u których diagnozuje się współistniejące przewlekłe bóle miednicy lub zaburzenia nastroju^5,29-31. Nawracające infekcje, nieszczelny nabłonek, zapalenie neurogenne i autoimmunizacja zostały uznane za potencjalne przyczyny CP / CPPS^2,32,33, a także aktywacji i degranulacji komórek tucznych³⁴. Wyrażona wydzielina prostaty od mężczyzn z CP / CPPS miała zwiększony poziom tryptazy komórek tucznych i czynnika wzrostu nerwów (NGF)³⁴, a późniejsze badanie potwierdziło, że tryptaza i karboksypeptydaza A (CPA3), marker aktywacji komórek tucznych, były również zwiększone w moczu pacjentów z CP / CPPS³⁵. Potencjalna rola komórek tucznych w powstawaniu i utrzymywaniu CP/CPPS była do tej pory głównym celem badań na zwierzętach nad tym zespołem. Najczęściej stosowanym modelem gryzoni wykorzystywanym do badania CP/CPPS jest eksperymentalny model autoimmunologicznego zapalenia gruczołu krokowego (EAP) generowany przez podskórne wstrzyknięcie antygenu prostaty w adiuwant Freunda Complete, co skutkuje różnym stopniem zapalenia gruczołu krokowego w zależności od gatunku i zastosowanego szczepu^34,36-39. Wykazano, że infiltracja i aktywacja/degranulacja komórek tucznych zwiększają się po indukcji EAP^34,35,40. Myszy transgeniczne z niedoborem komórek tucznych³⁴ lub receptora tryptazy PAR2³⁵ nie rozwijają wrażliwości na taktykę prostaty po EAP, w przeciwieństwie do myszy EAP typu dzikiego. Chociaż ten model przedkliniczny powiela wiele cech ludzkiego CP/CPPS, protokół indukcji nie wskazuje na stan człowieka, który ma zróżnicowaną etiologię i często nie wiąże się z bezpośrednim stanem zapalnym, infekcją lub urazem prostaty.

Wpływ stresu we wczesnym okresie życia na rozwój CP/CPPS u ludzi w dużej mierze nie został zbadany; jednak badanie przeprowadzone przez Hu i wsp.⁴¹, wykazały, że mężczyźni, którzy zgłosili historię fizycznego, emocjonalnego i/lub seksualnego wykorzystywania w dzieciństwie, byli znacznie bardziej narażeni na objawy sugerujące CP/CPPS. Co więcej, wykazali, że zarówno ból, jak i wyniki w oddawaniu moczu były zwiększone u pacjentów z historią przemocy fizycznej i emocjonalnej. Wcześniej wykazaliśmy, że ten sam paradygmat NMS u samic myszy C57BL / 6 powoduje nadwrażliwość pochwy i nieprawidłową ekspresję genów zarówno w pochwie, jak i pęcherzu, co sugeruje dysfunkcyjną oś wyjściową^{HPA 16}. Dowody te w połączeniu z wysoką częstością występowania pacjentów z CP / CPPS z innymi chorobami współistniejącymi⁴², w tym IC / PBS i zaburzeniami nastroju, które wyraźnie wykazano jako związane z ekspozycją na stres we wczesnym okresie życia^12-14, stanowią uzasadnienie dla zastosowania modelu NMS do zbadania CP / CPPS u myszy.

Protokół

Wszystkie eksperymenty opisane w tym protokole są zgodne z wytycznymi NIH zgodnie z wytycznymi określonymi przez University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Separacja noworodków (NMS)

1. Codziennie monitoruj ciężarne matki pod kątem narodzin w miocie.
   Uwaga: Dzień narodzin miotu jest uważany za P0.
2. Na P1 wyjmij zaporę z klatki domowej i umieść ją w czystym pojemniku wtórnym.
3. Wetrzyj garść pościeli w dłonie w czystych rękawiczkach, aby utrzymać zapach domowej klatki.
4. Dodaj głębokość 1-2 cm ściółki z klatki domowej do czystej, odpowiednio oznakowanej szklanej zlewki o pojemności 2 l. Do szklanej zlewki dodać około połowy dodatkowego materiału ściółkowego do wzbogacania materiału wypełniającego, który znajduje się w klatce domowej, np. gniazda, papieru do marszczenia.
5. Delikatnie umieść wszystkie szczenięta z jednego miotu, pojedynczo, w tej samej zlewce.
6. Zlewkę należy natychmiast umieścić w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 33 ^oC i wilgotności 50% przez 180 minut.
7. Wyjmij zaporę z dodatkowego pojemnika i włóż ją z powrotem do klatki domowej. Przywróć klatkę domową do odpowiedniego miejsca w wiwarium.
8. Powtórz tę procedurę dla każdego miotu poddawanego NMS, używając czystych rękawiczek i dodatkowych pojemników dla każdego miotu/matki.
9. Po upływie 180-minutowego okresu separacji należy umieścić mioty z powrotem w klatkach domowych w tej samej kolejności, w jakiej zostały usunięte.
10. Odzyskaj klatkę domową pierwszego miotu, który został oddzielony wcześniej tego dnia. Wyjmij zaporę z klatki domowej i umieść w czystym pojemniku wtórnym.
11. Wyjmij pierwszą zlewkę z inkubatora i wetrzyj garść ściółki w czyste ręce w rękawiczkach, aby utrzymać zapach domowej klatki podczas pracy ze szczeniętami.
12. Delikatnie przenieś szczenięta, pojedynczo, ze zlewki do klatki domowej.
13. Wszelki materiał wzbogacający i ściółkę pozostały w zlewce należy zwrócić do klatki domowej.
14. Zwróć zaporę z pojemnika wtórnego do klatki domowej i umieść ją w odpowiednim miejscu w pomieszczeniu w wiwarium.
15. Opłucz zlewkę wodą i włóż ją z powrotem do inkubatora. Używaj tej samej zlewki dla każdego miotu przez cały czas trwania procedury oddzielania.
16. Powtórz tę procedurę dla każdego miotu poddanego NMS w tej samej kolejności, w jakiej zostały umieszczone w inkubatorze.
17. Powtarzaj całą tę procedurę dla każdego miotu poddawanego NMS codziennie przez P21.
18. Odstaw od piersi NMS i naiwne szczenięta na P22, umieszczając rodzeństwo z miotu tej samej płci razem w czystych klatkach wraz z jedzeniem i wodą. Naiwne szczenięta powinny rodzić się i być trzymane w tych samych warunkach, co myszy NMS, ale nie powinny być poddawane żadnym dodatkowym czynnościom poza normalnymi zadaniami związanymi z hodowlą zwierząt.

2. Okołopłciowa wrażliwość mechaniczna

1. Konfiguracja aparatu von Freya
   1. Przynieś myszy do pokoju testowego i pozwól im zaaklimatyzować się przez 30 minut, pozostając w swoich domowych klatkach.
   2. Przygotuj obszar testowy, umieszczając chłonny podkład pod podwyższonym stołem z siatki drucianej (79 cm x 28 cm), który zapewnia wystarczająco dużo miejsca, aby umożliwić badaczowi podejście od spodu bez płoszenia myszy o wysokości około 55 cm.
   3. Umieść do 12 myszy pojedynczo w przezroczystych, perforowanych plastikowych komorach (11 cm x 5 cm x 3.5 cm) na stole z siatki drucianej. Umieść ciężki przedmiot na komorach, aby zapobiec ucieczce myszy.
   4. Przyzwyczaj myszy przez dodatkowe 30 minut na ekranie przed oceną progu odstawienia.
2. Ocena wrażliwości mechanicznej okołopłciowej
   1. Metodę góra-dół należy wykonać przy użyciu standardowego zestawu stopniowanych monofili von Freya⁴³. Używaj następujących monofili: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g i 4,74 g.
      1. Chwyć podstawę żyłki 3,22 g i odsłoń schowaną żyłkę.
         Uwaga: Niektóre modele mogą nie mieć wsuwanej żyłki.
      2. Ustaw sondę tak, aby żyłka była zorientowana pionowo, a gdy mysz jest czujna, nieruchoma, a jej ciężar ciała rozkłada się równomiernie między tylnymi łapami, przyłóż ją do lewej lub prawej strony moszny, unikając linii środkowej, aż do zaobserwowania lekkiego wygięcia we włóknie.
      3. Przytrzymaj żyłkę na miejscu przez 10 sekund lub do momentu, gdy zwierzę wykaże pozytywną reakcję.
         Uwaga: Za pozytywną reakcję uważa się energiczne szarpnięcie lub skok w odpowiedzi na aplikację żyłki lub lizanie lub gryzienie skierowane w stronę żyłki. Jeśli mysz poruszy się podczas 10-sekundowej aplikacji żyłki bez wyświetlania tych zachowań, żyłka musi zostać ponownie przetestowana po co najmniej 1-minutowym okresie odpoczynku. Jeśli mysz ani się nie rusza, ani nie wykazuje żadnego z wyżej wymienionych zachowań podczas 10-sekundowej aplikacji żyłki, uważa się to za reakcję negatywną.
      4. Zapisz odpowiedź, negatywną lub pozytywną, w notatniku laboratoryjnym lub laptopie i powtórz tę procedurę na wszystkich pozostałych myszach przy użyciu żyłki o gramaturze 3,22 g.
      5. Przetestuj wszystkie myszy ponownie, używając następnej odpowiedniej żyłki. Uwaga: Jeśli mysz wykazała negatywną reakcję na żyłkę 3,22 g, nałóż żyłkę 3,61 g w ten sam sposób i zapisz odpowiedź. Jeśli mysz wykazała pozytywną reakcję na monofilamentkę 3,22 g, zastosuj żyłkę 2,83 g i zapisz odpowiedź.
   2. Kontynuuj testowanie każdej myszy przy użyciu następnej większej lub mniejszej żyłki, w zależności od przypadku, dla dodatkowych 4 aplikacji po zaobserwowaniu pierwszej pozytywnej odpowiedzi.
   3. Wróć myszy do klatek domowych.
   4. Wartość końcowej żyłki von Freya zastosowanej w serii próbnej w jednostkach logarytmicznych należy wykorzystać do obliczenia progu poboru 50 % g zgodnie z opisem w Chaplan i wsp.^{Lokal mieszkalny 43}.

3. Zakwaszone barwienie toluidynowych niebieskich komórek tucznych

1. Przetwarzanie tkanek
   1. Wypreparuj tkankę prostaty⁴⁴ od myszy, które zostały perfundowane śródsercowo lodowatym 4% paraformaldehydem⁴⁵. Utrwalić tkankę w 4% paraformaldehydzie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie krioprotekcjonalizować w 30% sacharozie w 1x PBS w temperaturze 4 °C O/N.
   2. Przygotuj małą (30 ml) kąpiel z heptanem i umieść ją na suchym lodzie.
   3. Opłucz tkankę prostaty w 1x PBS i osusz lekką chusteczką.
   4. Włóż tkankę prostaty do zimnego heptanu, aż zostanie zamrożona.
   5. Natychmiast umieść zamrożoną tkankę prostaty w kriomold zawierającym pożywkę montażową i umieść na suchym lodzie do momentu zamrożenia.
   6. Przechowywać krioformy w temperaturze -20 °C.
   7. Przetnij poprzecznie tkankę prostaty na kriosekcje o grubości 7 μm za pomocą kriostatu.
   8. Umieść 8 - 12 nieseryjnych kriosekcji, które rozciągają się na całej długości tkanki, na dodatnio naładowanych szkiełkach mikroskopowych.
   9. Gotowe preparaty przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszej obróbki.
2. Przygotowanie zakwaszonego błękitu toluidynowego
   1. Dodać 1 g błękitu toluidynowego O do 100 ml 70% etanolu i mieszać aż do roztworu, aby przygotować 1% roztwór podstawowy. Roztwór podstawowy może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez okres do trzech tygodni.
   2. Dodać 1 g NaCl do 100 ml wody w zlewce umieszczonej na mieszance.
   3. Dostosuj pH roztworu NaCl za pomocą 12 M HCl, aż do uzyskania zakresu pH 0,5 - 1,0.
   4. Przygotować 0,25% roztwór roboczy błękitu toluidynowego, łącząc 8 ml roztworu podstawowego błękitu toluidynowego i 32 ml 1% roztworu NaCl. Pipetować w górę i w dół, aby zapewnić całkowite włączenie roztworu podstawowego błękitu toluidynowego i mieszać za pomocą wiru. Roztwór roboczy musi być świeży i wyrzucony po użyciu.
3. Barwienie kriosekcji prostaty
   1. Wyjmij szkiełka przeznaczone do obróbki z zamrażarki i pozostaw do wyrównania do temperatury suchej przez około 30 minut.
   2. Umyj skrawki tkanki, zanurzając szkiełka pojedynczo na około 1 sekundę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej wystarczającą objętość 1x PBS, aby upewnić się, że sekcje tkanek zamontowane na szkiełku będą całkowicie zanurzone. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu na ręczniku papierowym.
   3. Umieść szkiełka w szklanym słoiku do barwienia zawierającym wystarczającą ilość 0,25% roboczego roztworu błękitu toluidynowego, aby zapewnić, że sekcje tkanek zamontowane na szkiełku zostaną całkowicie zanurzone i będą inkubować przez 10 - 15 minut na kołysce platformy ustawionej na 15 obr./min.
   4. Zanurz szkiełka w 1x PBS na około 1 sekundę, aby wypłukać nadmiar błękitu toluidynowego.
   5. Umieść szkiełka w pudełku na suwaki lub stojaku w taki sposób, aby szkiełka znajdowały się na bokach, aby umożliwić drenaż.
   6. Suszyć szkiełka w piekarniku w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny lub O/N przy RT.
   7. Szybko odwodnij szkiełka za pomocą alkoholu, pozwalając im całkowicie wyschnąć między ekspozycjami na alkohol. Wysuszyć szkiełka, odsączając na ręczniku papierowym i wycierając grzbiety i krawędzie lekką chusteczką.
      1. Zanurz szkiełka w 95% EtOH na około 1 sekundę i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Powtórz tę procedurę 1 - 10 razy, aż tkanka wyschnie bardziej niebiesko niż fioletowo.
      2. Zanurz szkiełka w 100% EtOH na około 1 sekundę i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Powtórz tę procedurę 1 - 10 razy, aż tkanka stanie się ciemnoniebieska lub średnio niebieska, ale nie fioletowa.
   8. Napraw plamę, inkubując szkiełka w 100% ksylenie przez 3 minuty. Pozostawić do wyschnięcia.
   9. Szkiełko nakrywkowe należy nakryć trwałymi środkami mocującymi na bazie glicerolu, PBS lub ksylenu. Odcedź nadmiar nośnika i przechowuj w RT.
4. Kwantyfikacja komórek tucznych
   1. Wizualizuj skrawki tkanek zabarwione toluidyną na niebiesko w 20-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopii świetlnej (ryc. 2).
   2. Policz całkowitą liczbę komórek tucznych obecnych w wizualizowanym obszarze i rozróżnij niezdegranulowane i zdegranulowane komórki tuczne. 40-krotne powiększenie może być konieczne, aby potwierdzić stan ziarninacji w niektórych komórkach tucznych.
      Uwaga: Niezdegranulowane komórki tuczne wykazują gęstą metachromazję bez lub ze słabym konturem jądra i/lub bez ziarnistego wytłaczania wokół komórki. Degranulowane komórki tuczne wykazują mniej intensywną metachromazję i mają oczywisty wyraźny zarys jądra i/lub wolnych granulek w cytoplazmie i poza granicą komórki.
   3. Kontynuuj ocenę całkowitej liczby niezdegranulowanych i zdegranulowanych komórek tucznych w całym bieżącym odcinku tkanki. Powtórz tę procedurę na co najmniej 7 dodatkowych oddzielnych odcinkach, obejmujących długość każdej tkanki.
   4. Obliczyć procentową zawartość zdegranulowanych (DG) w stosunku do całkowitej liczby komórek tucznych dla każdej tkanki/myszy zgodnie z następującym równaniem: (DG komórki tuczne / Całkowita liczba komórek tucznych) x 100.

Wyniki

Myszy, które przeszły NMS, wykazały dowody behawioralne wskazujące na CP/CPPS. Podczas testowania z ocenioną serią monofilamentów von Freya, 8 tygodniowych myszy NMS (n = 4) wykazywało allodynię mechaniczną okołogenitalną w porównaniu z naiwnymi odpowiednikami (n = 5, ryc. 2). Świadczy o tym znaczna redukcja (p < 0,01; Test t-Studenta) w mechanicznym progu wycofania, który wywołał pozytywną reakcję behawioralną, rejestrowaną jako energiczne szarpnięcie lub skok w odpowiedzi na aplikację żyłki...

Dyskusja

Protokół ten zawiera metodologię wykorzystania stresu noworodkowego w postaci NMS do wywołania objawów wskazujących na CP / CPPS u dorosłych samców myszy. Jako dorosłe myszy NMS wykazują znaczną allodynię mechaniczną okołopłciową, a także dowody na degranulację komórek tucznych w tkance prostaty. Zastosowanie NMS jest nowatorskim podejściem do opracowania przedklinicznego modelu CP/CPPS, ponieważ odtwarza stres we wczesnym okresie życia, który jest często zgłaszany przez pacjentów z przewlekłym bólem miednicy^12-14

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ciężarne samice myszy C57BL/6	Charles River	027	Ciężarne samice w ciąży z czasem lub bez niego powinny być codziennie monitorowane pod kątem porodu w domu.
Szklana zlewka (zlewki) o pojemności 2 litrów CLS10002L	Sigma-Aldrich		Każdy miot NMS będzie przechowywany w tej samej zlewce przez cały 21-dniowy okres separacji.
Inkubator z wymuszonym obiegiem powietrza VWR, podstawowy	VWR International	414005-124	Inkubator powinien znajdować się na 33° C i 50% wilgotności.
Test dotyku Sensory Evaluator, zestaw 20 sztuk (estezjometr Semmes-Weinstein Von Frey do oceny dotyku)	Stoelting	58011	Do oceny wrażliwości okołopłciowej należy stosować następujące monofilamenty: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g i 4,74 g.
Wybieg dla zwierząt (12 myszy, 6 szczurów)	IITC	435	Pamiętaj, aby umieścić ciężki przedmiot na indywidualnych, akrylowych wybiegach dla zwierząt, aby zapobiec ucieczce myszy.
Stojak siatkowy dla myszy i szczurów (12 myszy 6 szczurów)	IITC	410	Umieść stojak na stabilnym blacie, aby uzyskać wygodny dostęp.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma-Aldrich	P5493	Rozcieńczyć 10x PBS do 1x PBS.
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	4% roztwór paraformaldehydu jest potrzebny do wewnątrzsercowej perfuzji myszy i tkanki postfix w ramach przygotowań do barwienia komórek tucznych.
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect utrwalona tkanka w 30% roztworze sacharozy w 4° C z dnia na dzień.
Heptan	Sigma-Aldrich	246654	Schłodź heptan na suchym lodzie, aby zamrozić tkankę.
Standardowa krioforma	VWR International	4557	Aby pomóc w zamrażaniu tkanki prostaty przed sekcją kriostatu
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	Certyfikowany przez Komisję ds. Barwień Biologicznych. Nadaje się do stosowania jako barwnik metachromatyczny do komórek tucznych.
Etanol, absolutny (200 dowodów)	Fisher Scientific	BP2818-4	Klasa biologii molekularnej, bioodczynniki Fisher; 95% i 100% roztwory będą potrzebne do odwodnienia barwionych kriosekcji przed wizualizacją komórek tucznych.
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S9888	Zakwaszony roztwór NaCl należy przygotować na świeżo przed barwieniem kriosekcji.
GeneMate Sterylne probówki wirówkowe 50 ml	BioExpress	C-3394	Jednorazowe rurki używane do mieszania niebieskich elementów toulidyny lub zanurzania szkiełek w 1xPBS.
Naczynie do barwienia z kopeliny na 10 szkiełek, z pokrywą ze szkła gruntowego	Fisher Scientific	08-815	Pojemność do 10 standardowych 3 x 1 cal. (75 x 25 mm) przesuwa się tyłem do siebie. Użyj oddzielnych naczyń na roztwór roboczy błękitu toluidyny, 95% EtOH, 100% EtOH i ksylenu.
Ksyleny (histologiczne)	Fisher Scientific	X3P	Po odwodnieniu tkanka jest oczyszczana za pomocą ksylenu.
Pudełka na szkiełka mikroskopowe, 100-miejscowe	VWR International	82003	mogą być używane do przechowywania i transportu preparatów.
Pudełko na szkiełka mikroskopowe Fisherbrand	Fisher Scientific	22-363-400	Te pudełka na suwaki są zazwyczaj wystarczająco małe, aby zmieścić się w kriostate.
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glicerol jest tradycyjnym medium montażowym.
Medium montażowe, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Medium montażowe mocno łączy szkiełko nakrywkowe z prowadnicą.
Okulary Micro Cover Square, Nr 1	VWR International	48393-106	Na odwodnioną i oczyszczoną tkankę nakłada się szkiełko nakrywkowe w celu ochrony próbki.
Mikroskop świetlny	Nikon		Zaawansowany zautomatyzowany mikroskop badawczy Eclipse 90i, używany przez nasze laboratorium, został wycofany i zastąpiony Eclipse Ni-E.