Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Podsumowanie

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje metodę używaną do generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty (PDX) z krążących komórek nowotworowych (CTC). Generowanie modeli PDX z CTC zapewnia alternatywny model eksperymentalny do badania raka prostaty; Najczęściej diagnozowany nowotwór i częsta przyczyna zgonów z powodu raka u mężczyzn.

Streszczenie

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) zyskują na popularności w badaniach nad rakiem i są używane do przedklinicznej oceny leków, identyfikacji biomarkerów, badań biologicznych i strategii medycyny spersonalizowanej. Krążące komórki nowotworowe (CTC) odgrywają kluczową rolę w przerzutach nowotworowych i zostały wyizolowane od pacjentów z kilkoma typami nowotworów. Ostatnio CTC zostały wykorzystane do generowania eksperymentalnych modeli PDX raka piersi i prostaty. Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje metodę generowania modeli PDX raka prostaty na podstawie CTC opracowanych przez naszą grupę. Zaletą tej metody w porównaniu z konwencjonalnymi modelami PDX jest niezależność od chirurgicznego pobierania próbek i generowanie modeli eksperymentalnych na różnych etapach choroby. Wirowanie w gradiencie gęstości, a następnie liza czerwonych krwinek i zubożenie komórek jednojądrzastych CD45 dodatnich metodą cytometrii przepływowej stosuje się do wzbogacenia CTC z próbek krwi obwodowej pobranych od pacjentów z chorobą przerzutową. CTC są następnie wstrzykiwane myszom z obniżoną odpornością; Wygenerowane następnie ksenoprzeszczepy mogą być wykorzystane do badań funkcjonalnych lub pobrane w celu charakterystyki molekularnej. Podstawowym ograniczeniem tej metody jest metoda selekcji negatywnej stosowana do wzbogacania CTC. Pomimo tego ograniczenia, generowanie modeli PDX z CTC zapewnia nowatorski model eksperymentalny, który można zastosować w badaniach nad rakiem prostaty.

Wprowadzenie

Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów są coraz bardziej popularnymi modelami eksperymentalnymi wykorzystywanymi do badań nad rakiem. Mogą być wykorzystywane do charakterystyki biomarkerów i szlaków biologicznych, przedklinicznej oceny skuteczności leków oraz tworzenia awatarów do spersonalizowanych terapii przeciwnowotworowych ^1,2. Wcześniej inne grupy badawcze opracowały modele PDX poprzez wszczepianie lub wstrzykiwanie zawiesin pojedynczych komórek nowotworowych lub całych eksplantatów guza myszom z obniżoną odpornością ¹. Te modele PDX wymagają chirurgicznego pobrania świeżego guza litego, złośliwego wodobrzusza lub wysięku opłucnowego od pacjenta poddawanego zabiegowi chirurgicznemu, który jest zarówno kosztowny, jak i naraża pacjenta na zwiększone ryzyko zachorowalności jatrogennej.

Znaczącym osiągnięciem w badaniach nad rakiem było wykrywanie, izolacja i charakterystyka krążących komórek nowotworowych. Te komórki nowotworowe uciekają z pierwotnej masy guza i wchodzą do krążenia, gdzie odgrywają kluczową rolę w przerzutach i nawrotach, najczęstszej przyczynie śmiertelności związanej z rakiem ³. Ocena i charakterystyka CTC z kilku typów guzów litych dostarczyły informacji klinicznych do diagnozy, rokowania i monitorowania choroby resztkowej ³. Do skutecznego izolowania CTC 4 można wykorzystać różne obecnie stosowane podejścia oparte na właściwościach fizycznych, ekspresji biomarkerów lub cechach funkcjonalnych CTC ⁴. Istniejące metody izolacji CTC w skali makro obejmują wirowanie w gradionym gradieniu gęstości, fizyczną filtrację z porami filtracyjnymi i separację od cząsteczek powierzchniowych. Najczęściej stosowane metody izolacji CTC opierają się na wychwytywaniu CTC na podstawie przeciwciał. Zarówno pozytywna, jak i negatywna selekcja markerów powierzchni komórek może być wykorzystana do wyizolowania CTC z krwi obwodowej. Pozytywna selekcja CTC w krążeniu obwodowym zwykle wykorzystuje markery nabłonkowe (np. EpCAM), które ulegają ekspresji na CTC, ale nie na komórkach krwiotwórczych. Wadą tej metody jest to, że CTC z potencjałem przerzutowym często przechodzą przemianę nabłonkowo-mezenchymalną (EMT), która obniża poziom markerów powierzchni nabłonka ³. W celu wyizolowania CTC z potencjałem przerzutowym można zastosować metodologię selekcji negatywnej, która wykorzystuje marker powierzchni hematopoetycznej, CD45, w celu zubożenia normalnej populacji komórek leukocytów ⁵.

Rak prostaty jest najczęściej diagnozowanym nowotworem i główną przyczyną zgonów związanych z rakiem u mężczyzn ⁶. Mechanizmy progresji i agresywności nowotworu nie są w pełni poznane, dlatego generowanie i charakteryzacja modeli eksperymentalnych, które podsumowują heterogeniczność molekularną raka gruczołu krokowego, są bardzo interesujące. Modele PDX raka gruczołu krokowego zostały wcześniej wygenerowane przez wszczepienie ludzkich komórek raka prostaty myszom z obniżoną odpornością ^7,8. Jednak generowanie takich modeli zostało utrudnione przez niski wskaźnik wszczepiania raka prostaty myszom z obniżoną odpornością, co przypisuje się przede wszystkim powolnemu charakterowi choroby. Ostatnio CTC zostały wykorzystane do wygenerowania modeli PDX raka piersi ⁹, raka płuc ¹⁰ i raka prostaty ¹¹. Te badania potwierdzające słuszność koncepcji wprowadziły możliwość generowania modeli PDX niezależnie od konieczności pobierania próbek chirurgicznych. W tym artykule szczegółowo opisujemy metodę generowania tego nowatorskiego modelu eksperymentalnego.

Protokół

Ten protokół został przeprowadzony w naszej instytucji za zgodą instytucjonalnej komisji etyki badań i jest zgodny ze wszystkimi instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobra człowieka.

1. Pobieranie krwi obwodowej od pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty

Uwaga: Wybierz pacjentów z przerzutowym rakiem prostaty. Uzyskaj pisemną zgodę pacjenta i zapisz charakterystykę kliniczną pacjentów, w tym wiek w momencie izolacji oraz wcześniejszą chemioterapię i leczenie hormonalne. Pacjenci z chorobą przerzutową będą mieli potencjalnie najwyższe stężenie CTC we krwi obwodowej.

1. Pobieranie próbek krwi po uzyskaniu świadomej zgody i zgodnie z odpowiednim protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną. Przez cały czas trwania zabiegu należy nosić rękawice lateksowe i fartuch laboratoryjny.
2. Podłącz igłę motylkową 25 G i rurkę do uchwytu igły. Za pomocą wacika nasączonego alkoholem oczyść obszar żyły łokciowej między bicepsem a przedramieniem, a następnie załóż opaskę uciskową na ramię pacjenta.
3. Włóż igłę motylkową do żyły łokciowej i wepchnij probówkę do pobierania krwi do uchwytu igły, aby rozpocząć pobieranie. Zebrać około 10 ml krwi do probówek zawierających kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), aby zapobiec zakrzepom.
4. Wyjąć igłę motylkową z pacjenta i uciskać sterylnym gazikiem w miejscu nakłucia żyły przez 1 minutę. Przykryj miejsce sterylnym bandażem.

2. Izolacja komórek jednojądrzastych

Uwaga: Krew pobrana z kroku 1 będzie zawierała komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) (np. limfocyty i monocyty) oprócz jednojądrzastych CTC.

1. Pipetą serologiczną o pojemności 5 ml odpipetować krew pełną do 50 ml polistyrenowej probówki stożkowej i dodać zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) w stosunku 1:1. Delikatnie odpipetować mieszaninę do homogenizacji.
2. Dodać 15 ml komercyjnie przygotowanego roztworu (Ficoll-Paque) w celu oddzielenia składników krwi przez wirowanie w gradionym spadku gęstości z małą prędkością do pustej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
3. Delikatnie odpipetować krew pełną i mieszaninę HBSS, z kroku 2.1, do rurki polistyrenowej z kroku 2.2, aby utworzyć wyraźną warstwę wierzchnią. Ustaw pipetę na najniższe ustawienie, aby zminimalizować mieszanie roztworów, zapewni to skuteczną separację.
4. Wirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (25 °C). Ustaw opóźnienie na najniższe ustawienie, aby zapobiec mieszaniu się roztworów po rozdzieleniu. Przyspieszenie można ustawić na dowolną prędkość.
5. Po odwirowaniu zidentyfikuj cienki biało-szary pasek PBMC i CTC umieszczony między osoczem na górze a roztworem rozdzielającym na dnie probówki.
6. Zebrać komórki z biało-szarego paska w kroku 2.5 do probówki z polistyrenu o pojemności 50 ml za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia.
7. Dodać HBSS do 50 ml polistyrenowej probówki stożkowej z PBMC i CTC i ponownie odwirować przy 400 x g przez 10 minut RT do mycia.
8. Zdekantować płyn i ponownie zawiesić osad w 50 ml HBSS i ponownie odwirować przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w celu umycia.
9. Odrzucić sklarowany osad, zawiesić pozostały osad z 5 ml buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubować roztwór przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
10. Usunąć bufor do lizy krwinek czerwonych przez odwirowanie przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
11. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS 1x uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w celu zablokowania przed barwieniem przeciwciałami.

3. Barwienie komórek jednojądrzastych przeciwciałem CD45-FITC do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)

1. Określić ilościowo liczbę żywotnych (trypanowo-ujemnych) komórek (od kroku 2.11) za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Przygotować zawiesinę 1 x 10⁶ komórek/ml (w PBS 1x z 10% FBS) i umieścić ją na lodzie na 1 godzinę.
2. Ilościowo oznaczoną zawiesinę komórek z poprzedniego etapu rozprowadzić do dwóch probówek. Oznacz probówki jako kontrolne i barwienie CD45.
3. Do probówki kontrolnej dodać IgG1κ-FITC (2,5 μg/ml) w rozcieńczeniu 1:250. W probówce do barwienia CD45 dodać sprzężone przeciwciało pierwszorzędowe CD45 FITC (2,5 μg/ml) w rozcieńczeniu 1:250 i inkubować zawiesiny komórek na lodzie przez 30 minut. W celu wykluczenia komórek krwiotwórczych stosuje się znakowanie antygenem CD45.
4. Odwirować komórki przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
5. Przemyć komórki dwukrotnie, zawieszając każdą granulkę sterylnym 1 x PBS uzupełnionym 10% FBS, a następnie odwirować przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
6. Zawiesić komórki w 1 ml roztworze PBS 1x zawierającym 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) w stężeniu 10 μg/ml.
7. Przefiltruj końcowy roztwór przez nasadki sitka 35 μm do rurek polistyrenowych o wymiarach 12 mm x 75 mm.

4. Izolacja CTC prostaty przez FACS

Uwaga: Użyj cytometru przepływowego do zbierania żywych ujemnych CTC CD45.

1. Ustaw kontrolki kompensacji za pomocą komórek z rurki oznaczonej "Kontrola".
2. Utwórz bramki, które wykluczają zanieczyszczenia i skupiska komórek, używając odpowiednich parametrów rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego.
3. Ustal bramki FITC za pomocą zawiesin komórek z probówki oznaczonej "CD45-FITC".
4. Bramka żywotnych komórek (DAPI-ujemnych) wykorzystujących pacyficzny kanał blue-A.
5. Zbierz populację CD45 ujemną do sterylnej 15 ml polistyrenowej stożkowej probówki zawierającej 2 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% FBS.
6. Odwirować posortowaną zawiesinę komórek nowotworowych prostaty o sile 400 x g przez 3 minuty, a następnie ponownie zawiesić granulki w 200 - 500 μl RPMI uzupełnionym 10% FBS.

5. Wstrzykiwanie CTC myszom i monitorowanie wzrostu ksenoprzeszczepu

Uwaga: Przeprowadzaj wszystkie procedury na zwierzętach zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami. Protokół ten został przeprowadzony w naszej instytucji zgodnie ze specjalnym Protokołem Wykorzystania Zwierząt zatwierdzonym przez nasz Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami zgodnie i zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi agencjami regulacyjnymi i instytucjonalnymi, przepisami i wytycznymi.

1. Wymieszaj posortowaną zawiesinę komórek nowotworu prostaty z macierzą zewnątrzkomórkową w stosunku 1:1 i umieść na lodzie.
2. Znieczulić mysz przed implantacją podskórną w komorze dostarczającej 5% (v/v) wziewnego izofluranu w 1 l/min tlenu. Zapewnij odpowiednie znieczulenie, sprawdzając, czy u myszy nie ma utraty odruchu rogówkowego i palca u stóp.
3. Za pomocą igły 25 G i strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć podskórnie 250 μl zawiesiny komórek nowotworu prostaty i komórek macierzy zewnątrzkomórkowej w obie górne strony 8-10-tygodniowego samca myszy z niedoborem odporności. Wstrzyknąć 250 μl niezależnie od stężenia CTC, ponieważ objętość wstrzyknięcia jest ważną wartością. Maksymalne podanie SQ u myszy wynosi nie więcej niż 1 ml.
4. Monitoruj myszy, wykonując cotygodniowe badanie palpacyjne miejsc wstrzyknięć myszy pod kątem wzrostu podskórnej gęstości guzkowej i mierząc masę myszy dwa razy w tygodniu.
5. Poddaj myszy eutanazji przez uduszenie dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy i pobierz podskórne ksenoprzeszczepy ludzkiego raka prostaty, gdy rozmiar guza jest większy niż 0,5 cm i mniejszy niż 1 cm w największej średnicy, aby zapewnić wystarczającą ilość tkanki nowotworowej do analiz molekularnych i seryjnego pasażu. Eutanazja myszy z objawami niepokoju lub utratą masy ciała o 15%, mimo że guz nie jest wyczuwalny.

Wyniki

Niniejszy protokół prowadzi do generowania modeli PDX z wyizolowanych, CD45-ujemnych krążących komórek nowotworowych (CTC) raka prostaty. Ze względu na zastosowaną w naszym protokole metodę selekcji negatywnej konieczne jest wykluczenie martwych komórek za pomocą barwienia DAPI. Procent CD45-ujemnych komórek wykrytych metodą cytometrii przepływowej jest zmienny i zależy od obciążenia nowotworowego pacjenta (Ryc. 1A). Barwienie immunofluorescencyjne nieposortowanych komórek z użyciem CD45 i DAPI (w celu i...

Dyskusja

W artykule opisano metodę generowania modeli PDX raka gruczołu krokowego na podstawie CTC. Wykorzystanie CTC do generowania modeli PDX ma kilka potencjalnie ważnych zalet w porównaniu z istniejącymi metodami. Po pierwsze, dostępne pobieranie CTC z krwi obwodowej umożliwia generowanie modeli eksperymentalnych od tego samego pacjenta w różnych stadiach choroby. Po drugie, pobieranie krwi stanowi bezpieczniejszą i tańszą metodę izolowania komórek nowotworowych w porównaniu z istniejącymi metodologiami, któr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicylina Streptomycyna	Gibco Life Technologies	15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 &mikro; m Sitko do komórek	BD Falcon	352340
50 ml polistyrenowa rurka stożkowa	Crystalgen	23-2263
Bufor do lizy czerwonych krwinek	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Rurki polistyrenowe z nasadką sitową BD	Falcon
BD Vacutainer Lawendowe probówki do pobierania krwi z EDTA
BD Winged Blood Collection Set z przyciskiem Igła do cofania 23 gauge
BD Vacutainer Jednorazowy uchwyt
Lateksowa opaska
Rękawiczki
lateksowe lub nielateksoweWaciki nasączone alkoholem
2 x 2 bawełniane gaziki
Bandaż
Igła 25 G
			1 ml

352235na igłęuciskowasamoprzylepny Strzykawka