Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Podsumowanie

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego. Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Streszczenie

Model danio pręgowanego to nowy system do badania zaburzeń nerwowo-mięśniowych. W badaniach nad chorobami nerwowo-mięśniowymi integralność błony mięśniowej jest krytycznym wyznacznikiem choroby. Do tej pory wiele schorzeń nerwowo-mięśniowych objawia się degeneracją włókien mięśniowych z nieprawidłową integralnością błony; Najczęściej obserwuje się to w dystrofiach mięśniowych. Niebieski barwnik Evansa (EBD) jest niezbędnym, przepuszczalnym dla komórek barwnikiem, który jest szybko wchłaniany do komórek degenerujących, uszkodzonych lub apoptotycznych; W przeciwieństwie do tego, nie jest pobierany przez komórki z nienaruszoną błoną. Wstrzyknięcie EBD jest powszechnie stosowane w celu ustalenia integralności mięśni w mysich modelach chorób nerwowo-mięśniowych. Jednak takie eksperymenty EBD wymagają rozbioru mięśni i/lub sekcji przed analizą. Natomiast wychwyt EBD przez danio pręgowanego jest wizualizowany w żywych, nienaruszonych preparatach. W tym miejscu demonstrujemy prostą i nieskomplikowaną metodologię wykonywania iniekcji i analizy EBD u żywych ryb pręgowanych. Ponadto demonstrujemy strategię koiniekcji w celu zwiększenia skuteczności analizy EBD. Ogólnie rzecz biorąc, ten artykuł wideo zawiera zarys wykonywania iniekcji i charakterystyki EBD w modelach choroby nerwowo-mięśniowej danio pręgowanego.

Wprowadzenie

Dystrofie mięśniowe stanowią grupę powszechnych i niejednorodnych chorób mięśni ludzkich o specyficznych cechach histopatologicznych^1,2. Objawy zwykle związane z tą wyniszczającą grupą chorób obejmują osłabienie mięśni, zwyrodnienie mięśni, utratę motoryki i wczesną śmiertelność^1,3. Głównymi patomechanizmami dystrofii mięśniowych jest utrata białek, które stabilizują sarkolemmę, zakotwiczają kompleksy transbłonowe i pośredniczą w sygnalizacji komórkowej przez błonę^4-6. Na przykład całkowita utrata białka dystrofiny, głównego białka rusztowania kompleksu dystrofina-glikoproteina, powoduje destabilizację błony mięśniowej w dystrofii mięśniowej^{Duchenne'a 7}. Ze względu na fakt, że większość dystrofii mięśniowych wynika z mutacji w białkach, które uczestniczą w połączeniu między macierzą zewnątrzkomórkową a cytoszkieletem sarkolemmalnym, częstą obserwacją na poziomie komórkowym jest utrata integralności krzyżowej^8,9. To zrozumienie głównych patomechanizmów związanych z dystrofiami mięśniowymi jest wynikiem wielu lat badań z wykorzystaniem systemów modeli zwierzęcych^2,10-15. Jednak pomimo postępów w tej dziedzinie, nadal istnieją ograniczone możliwości terapeutyczne w zakresie leczenia lub zarządzania szeregiem podtypów dystrofii. To ograniczenie skutecznych terapii wynika z kilku kluczowych czynników: 1) trudności strategii terapii genowej, 2) wysokiej częstotliwości przypadków chorób de novo i związanego z tym braku translowalnych modeli zwierzęcych oraz 3) braku rygorystycznych strategii testowania fizjologicznych konsekwencji domniemanych środków terapeutycznych za pomocą jasnych i odtwarzalnych miar wyników.

Aby przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń, liczne laboratoria, w tym nasze, wykorzystują danio pręgowanego jako system do modelowania i badania ludzkich chorób nerwowo-mięśniowych². Do tej pory danio pręgowany okazał się cennym narzędziem w badaniach nad chorobami. Model danio pręgowanego został wykorzystany do identyfikacji i walidacji nowych mutacji powodujących chorobę u ludzi^16,17, wyjaśnienia niescharakteryzowanych mechanizmów wywołujących chorobę^17,18 oraz identyfikacji nowych strategii terapeutycznych^12,19. Postępy te zostały częściowo osiągnięte dzięki kanonicznym zaletom systemu danio pręgowanego, takim jak ich przejrzystość optyczna, łatwość manipulacji genetycznej i zdolność do rozmnażania się w^{dużych ilościach.} Danio pręgowany okazał się również podatny na badania przesiewowe leków na dużą skalę²¹, co jest cenną metodą identyfikacji nowych terapii^22-24. Jeśli chodzi o badania nad chorobami mięśni, mocne strony te są uzupełnione przez zdolność do izolowania pojedynczych włókien mięśni szkieletowych danio pręgowanego poprzez dysocjację²⁵ oraz przez zdolność do badania organizacji mięśni in vivo przy użyciu zjawiska optycznego zwanego dwójłomnością²⁶, co łącznie pozwala na szybkie określenie makroskopowej integralności mięśni. Niezależnie od tych dostępnych narzędzi, ciągły rozwój narzędzi jest wymagany w celu poczynienia postępów w badaniach.

My, wraz z innymi, dostosowaliśmy protokół wstrzykiwania i analizy EBD w modelu danio pręgowanego. EBD jest niezbędnym, przepuszczalnym dla komórek barwnikiem, który jest pobierany przez uszkodzone, degenerujące się lub apoptotyczne komórki, a następnie wizualizowany pod wpływem fluorescencji²⁷. Do tej pory analiza EBD była szeroko stosowana do analizy integralności błony mięśniowej w mysich modelach chorób mięśni szkieletowych i serca^8,9,27. Jednak w preparatach ssaków pobrane mięśnie zazwyczaj wymagają pracochłonnego cięcia lub sekcji przed analizą. W przypadku danio pręgowanego możliwa jest bezpośrednia analiza w dużych ilościach przy użyciu żywych i nienaruszonych zwierząt. W tym artykule wideo zademonstrujemy metodologię wykonywania iniekcji i analizy EBD u żywych larw danio pręgowanego, z reprezentatywnymi obrazami wychwytu EBD w zmutowanej linii dystrofii danio pręgowanego sapje^15,28. Ponadto przedstawiamy strategię koiniekcji, która pozwala na zwiększenie ilościowej oceny preparatów EBD.

Protokół

1. Przygotowanie płytek iniekcyjnych do agaru (Czas: 45 min)

1. Zagotuj od 2% do 3% agarozy w pożywce E3 i pozostaw roztwór do lekkiego ostygnięcia na ławce. Uwaga: Liczba przygotowywanych płytek iniekcyjnych decyduje o wymaganej ilości agarozy. Na każdą płytkę iniekcyjną potrzeba około 35 ml roztworu agarozy.
2. Po ugotowaniu pozostaw agarozę do ostygnięcia, aż zostanie osiągnięta żądana temperatura (np. 45 ^°C) zgodnie z instrukcjami producenta formy wtryskowej.
3. Wlać około 35 ml schłodzonej agarozy do naczynia o średnicy 100 mm.
4. Umieść jeden koniec preferowanej formy wtryskowej w roztworze, a następnie połóż pozostałą część formy na roztworze agarozy (pomoże to zmniejszyć występowanie pęcherzyków powietrza).
5. Pozostawić roztwór agarozy do zestalenia się w temperaturze pokojowej lub 4 ^°C przez około 30 minut.
6. Za pomocą szpatułki oddziel jeden koniec formy od stałej agarozy. Powoli usuń pozostałą część formy.

2. Przygotowanie mieszanki iniekcyjnej Evans Blue Dye (EBD) (Czas: 30 min)

1. Zrób 1% zapasu EBD w roztworze 1X Ringera (155 mM NaCl; 5 mM KCl; 2 mM CaCl₂; 1 mM MgCl₂; 2 mM Na₂HPO₄; 10 mM HEPES; 10 mM glukozy; pH do 7,2), który można przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Sporządzić roztwór podstawowy izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dekstranu MW 10 000 kDa o stężeniu 25 mg/ml w roztworze 1X Ringera i przechowywać w temperaturze -20 ^°C.
3. Przygotować mieszaninę iniekcyjną, rozcieńczając EBD do 0,1% bezpośrednio w roztworze podstawowym FITC-dekstranu (tj. dla końcowej objętości roboczej 100 μl: zmieszać 10 μl 1% EBD z 90 μl dekstranu FITC).
4. Dokładnie zwiruj mieszankę iniekcyjną (powinna zmienić kolor na zielony) i trzymaj z dala od bezpośredniego światła, owijając rurkę z mieszanką do wstrzykiwań w folię aluminiową.

3. Przygotowanie do iniekcji EBD (czas: około 30 min)

Uwaga: Protokół działa najlepiej z larwami od 3-7 dni po zapłodnieniu (dpf).

1. Wstępnie ciepła płyta wtryskowa do RT.
2. Ustaw aparat iniekcyjny, ustawiając mikromanipulator na metalowej płytce i stań obok mikroskopu używanego do wstrzykiwania. Włącz sterownik mikroiniekcji napędzany powietrzem. Uwaga: Preferowany system wstrzykiwań różni się w zależności od laboratorium i nie powinien zmieniać wyniku analizy.
3. Igła do wstrzykiwań z tyłu wypełniona około 2-4 μl mieszanki EBD.
4. Skalibrować objętość wtrysku do około 5 nl mieszanki EBD. Uwaga: Kalibracja objętości wtrysku będzie zależeć od metody kalibracji. Wtrysk napędzany tłokiem może być bezpośrednio ustawiony na określoną objętość wtrysku, podczas gdy wtryskiwacze ciśnieniowe gazu będą wymagały kalibracji objętości wtrysku za pomocą bolusa objętościowego za pomocą mikrometru.
5. Zwilż płytkę iniekcyjną 1X roztworem Ringera i usuń nadmiar z dołków.
6. Wstępnie potraktuj larwy 0,04% solą metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu (trikainą) rozcieńczoną w roztworze 1X Ringera w celu unieruchomienia larw przed rozpoczęciem wstrzykiwania. Uwaga: Upewnienie się, że larwy są całkowicie nieruchome, jest ważne, ponieważ prawidłowe wstrzyknięcie jest trudne przy każdym szczątkowym ruchu.
7. Umieścić znieczulone larwy w dołkach płytek iniekcyjnych agaru za pomocą szklanej pipety. Upewnij się, że larwy znajdują się całkowicie w studni i leżą na boku. Uwaga: Liczba larw w studzience zależy od eksperymentatora.
8. Po umieszczeniu larw w studzienkach usuń nadmiar roztworu Ringera, aby zminimalizować ruch larw w studni. Pozostaw pozostałą ilość roztworu, aby larwy się nie odwodniły.

4. Iniekcja osierdziowa larw danio pręgowanego z EBD (Czas: Zależny od liczby wstrzykniętych larw, szacowany 1-3 godziny)

1. Umieścić płytkę iniekcyjną zawierającą larwy na lunecie sekcyjnej, w której będą wykonywane zastrzyki.
2. Umieścić igłę do pipety iniekcyjnej zawierającą mieszaninę EBD na larwie danio pręgowanego.
3. Ponownie umieścić płytkę iniekcyjną, obracając ją tak, aby igła do wstrzykiwań znajdowała się w pobliżu serca larwy i około 45^° brzusznie od osi przednio-tylnej.
4. Wprowadzić igłę do wstrzykiwań do wspólnej żyły kardynalnej (CCV) w obszarze żyły w przedniej części żółtka, gdzie żyła początkowo obraca się w kierunku grzbietowym (ryc. 1). Uwaga: Powiększenie do 40x może być przydatne, aby wyraźnie zobaczyć CCV.
5. Wstrzyknąć 5 nl mieszanki EBD i trzymać igłę do wstrzykiwań w odpowiedniej pozycji przez 5-8 sekund, aby zminimalizować natychmiastowy wyciek mieszanki EBD. Uwaga: Dobre wstrzyknięcie będzie miało zabarwienie barwnikiem widoczne w komorach serca (ryc. 1). Jeśli mieszanina EBD nie zostanie zaobserwowana w sercu, wstrzyknięcie dodatkowych 5 nl mieszaniny EBD może być wystarczające do wywołania wychwytu barwnika. Alternatywnie zarodek można wyrzucić.
   Uwaga: W niektórych sytuacjach serce może przestać bić. W takim przypadku należy kontynuować monitorowanie larw przez 20-40 sekund. Zazwyczaj serce wznawia bicie, gdy barwnik przepływa przez układ krążenia.
6. Przejdź do następnych larw i powtórz.
7. Zidentyfikuj pomyślnie wstrzyknięte zarodki, obserwując obecność FITC-dekstranu w naczyniach krwionośnych bezpośrednio po wstrzyknięciu (ryc. 2).

5. Inkubacja i absorpcja EBD (Czas: 4-6 godzin)

1. Po wstrzyknięciu żądanej liczby larw, wstrzyknięte larwy należy umieścić z powrotem w roztworze 1X Ringera bez tricainy w szalkach 100 mm.
2. Naczynia należy przechowywać zawinięte w folię aluminiową. Uwaga: Trzymanie wstrzykniętych larw w ciemności znacznie zwiększa przeżywalność i zapewnia największą spójność siły sygnału. Owijanie w folię aluminiową jest szczególnie ważne w okresie, w którym larwy znajdują się poza inkubatorem.
3. Pozostawić larwy do inkubacji w temperaturze 28,5 ^°C przez 4-6 godzin, aby zapewnić wystarczające pobieranie EBD.

6. Wizualizacja EBD w mięśniu (czas: zależny od liczby wstrzykniętych larw i rodzaju mikroskopii, szacowany na 0,5-3 godziny)

1. Przed obrazowaniem należy znieczulić larwy 0,04% tricainą, aby zapobiec ruchom.
2. Zobacz larwy pod wpływem czerwonej fluorescencji, aby określić, czy wychwyt EBD występuje w mięśniach szkieletowych (ryc. 3).

Wyniki

Mieszaninę wstrzykiwaną EBD wstrzykiwano do CCV homozygotycznych mutantów sapje oraz ich rodzeństwa typu dzikiego w 3. dniu po zapłodnieniu (dpf). W przypadku wstrzykiwań, które wypełniły komory serca (Rycina 1B), analizowano poprawność procedury poprzez wizualizację dekstranu FITC w układzie naczyniowym przy użyciu zielonej fluorescencji (Rycina 2).

Po 4-godzinnym okresie inkubacji pobieranie EBD badano na poziomie somytów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Rodzeństwo typu dzikiego nie wykazywało fluorescencji EBD w żadnych widocznych włóknach mięśniowych (Rysunek 3A), natomiast mutanty homozygotyczne sapje wykazały pobieranie EBD, co wskazuje na uszkodzenie błony mięśniowej¹⁵ (Rysunek 3B).

Rysunek 1. Wstrzykiwanie mieszaniny EBD do wspólnej żyły głównej (CCV) zarodka danio pręgowanego. (A) Zarodek niewstrzyknięty. Strzałka wskazuje optymalne miejsce wstrzyknięcia do CCV. (B) Prawidłowe wstrzyknięcie do CCV. Barwnik dostaje się do komór serca (strzałka) i zaczyna być pompowany przez układ naczyniowy. (C) Nieudane wstrzyknięcie do CCV skutkuje dostaniem się części lub całości barwnika do pęcherzyka żółtkowego zarodka (strzałka). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Zarodki można sortować pod kątem udanego wstrzyknięcia, obserwując rozkład FITC-dekstranu w całej sieci naczyniowej pod wpływem zielonej fluorescencji bezpośrednio po wstrzyknięciu i przed pobraniem EBD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: EBD zostanie wchłonięty przez włókna z uszkodzonymi błonami. (A) Rodzeństwo typu dzikiego nie wykazuje fluorescencji EBD we włóknach mięśniowych. (B) Sapje mutant homozygotyczny z fluorescencją EBD w wielu włóknach mięśniowych (strzałki). Wszystkie larwy zostały wstrzyknięte mieszaniną EBD i przeanalizowane po 4-godzinnym okresie inkubacji w 3 dpf. Rodzeństwo i mutanty zostały posegregowane pod kątem odrywania się włókien mięśniowych przed wstrzyknięciem CCV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Danio pręgowany staje się potężnym narzędziem do badania chorób nerwowo-mięśniowych^2,29. Do tej pory system danio pręgowanego był wykorzystywany do walidacji nowych mutacji powodujących choroby mięśni^16,17,30, wyjaśniania nowych patomechanizmów¹⁸ i identyfikowania potencjalnie nowych leków terapeutycznych^12,24. Te zbiorowe wysiłki ustaliły przydatność danio pręgowanego do modelowania ludzkich chorób nerwowo-mięśniowych. Jednak pomimo postępów poczynionych w modelach danio pręgowanego i ssaków, istnieją ograniczone możliwości leczenia pacjentów w szerokim spektrum schorzeń nerwowo-mięśniowych. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na opracowanie terapii dla tej grupy wyniszczających chorób. Równolegle z tym zapotrzebowaniem na terapie idzie w parze potrzeba ciągłych innowacji eksperymentalnych, a także rygorystycznych analiz w celu weryfikacji nowych modeli zwierzęcych i przypuszczalnych strategii terapeutycznych.

Analiza EBD jest powszechnie stosowana w modelach mysich do badania uszkodzeń tkanek i komórek w mózgu, sercu i mięśniach szkieletowych^27,31. Przede wszystkim EBD jest szeroko stosowany w mysich modelach różnych podtypów dystrofii mięśniowej, aby pokazać nasilenie niestabilności i uszkodzenia błony mięśniowej⁸. Zastosowanie EBD w celu ujawnienia uszkodzenia błony mięśniowej jest parametrem pomocniczym określającym podobieństwo modelu zwierzęcego do stanu chorobowego^{człowieka 9}. Moc EBD u myszy skłoniła kilka laboratoriów, w tym nasze, do opracowania i zastosowania EBD w modelach chorób nerwowo-mięśniowych danio pręgowanego. Ze względu na możliwość zastosowania analizy EBD, technika ta jest aktywnie wdrażana w celu potwierdzenia modeli danio pręgowanego w stanie chorobowym^{człowieka 11,15,22,24,32}. Larwy z uszkodzonymi błonami mięśniowymi będą miały wychwyt EBD, a tym samym czerwoną fluorescencję we włóknach mięśniowych. Fluorescencja obserwowana w przestrzeni międzywłóknistej, ale nie w obrębie pojedynczych włókien mięśniowych, może również informować o odłączaniu się włókien od błony podstawnej przy braku uszkodzenia błony, dostarczając użytecznych szczegółów diagnostycznych. Analiza EBD ma potencjalne zastosowanie wykraczające poza walidację modeli zwierzęcych. Wysiłki naszego laboratorium wykazały niedawno, że analiza EBD jest korzystna w walidacji potencjalnie nowych leków terapeutycznych²⁴. Ustalenie, czy potencjalne terapie zmniejszają lub znoszą wychwyt EBD w modelach chorób nerwowo-mięśniowych, może oznaczać odpowiednie działanie terapeutyczne⁸. Ten rodzaj analizy może pomóc w ustaleniu mechanizmu (mechanizmów) terapii i rozszerza zastosowanie analizy EBD.

Podobnie jak w przypadku wielu technik, analiza EBD ma kilka zastrzeżeń, które należy zaobserwować podczas projektowania i praktyki eksperymentalnej. Na przykład zidentyfikowanie CCV może być trudne ze względu na pogrubienie tkanki wraz z wiekiem. Ponadto łatwo jest uszkodzić larwy podczas przygotowań przed i w trakcie iniekcji osierdzia, co zmniejsza liczbę doświadczalną i zwiększa potrzebę przygotowania dużej liczby larw. Co więcej, fizyczne uszkodzenia larw podczas obchodzenia się z nimi i wstrzykiwania mogą skutkować fałszywie dodatnimi wynikami, ponieważ uszkodzone mięśnie mogą wchłonąć EBD. Aby przezwyciężyć niektóre z tych przeszkód, w tym artykule wideo opisaliśmy strategię koiniekcji, która umożliwia łatwą i niezawodną identyfikację larw z udanym wlewem barwnika natychmiast po wstrzyknięciu i przed późniejszą analizą. Jednoczesna iniekcja FITC-dekstran kontroluje skuteczne wstrzyknięcie, umożliwiając potwierdzenie EBD w układzie naczyniowym przed jego wychwytem przez włókna mięśniowe. Może to być szczególnie przydatne, ponieważ fluorescencja EBD staje się wysoce rozproszona u larw po kilku godzinach, jeśli nie zostanie zebrana we włóknach mięśniowych; W związku z tym może być trudny do wykrycia. Ponadto pominięcie CCV i wstrzyknięcie EBD do żółtka lub jamy ciała może, po inkubacji, spowodować rozproszoną czerwoną fluorescencję podobną do zarodków kontrolnych, ale ze zmniejszonym prawdopodobieństwem wychwytu przez uszkodzone włókna mięśniowe. Łącznie te zastrzeżenia sugerują, że wstrzyknięcie EBD wymaga cierpliwości i praktyki, aby osiągnąć spójne i wiarygodne wyniki.

Podsumowując, opisujemy praktyczną i prostą metodę przeprowadzania analizy EBD na larwach danio pręgowanego. Do tej pory wykorzystanie danio pręgowanego jako systemu modelowego, zwłaszcza jako modelu choroby człowieka, szybko się rozwija. Ekspansja ta jest częściowo spowodowana ciągłym rozwojem i modyfikacją technik eksperymentalnych, które poprawiają obecne zalety systemu danio pręgowanego. Technika iniekcji EBD stanowi dodatkowe i potężne narzędzie do arsenału badaczy do walidacji i badania modeli chorób mięśni danio pręgowanego. Trwające wdrażanie i modyfikowanie tej techniki może pomóc w odkryciu nowych strategii terapeutycznych, a także mechanizmów powodujących choroby.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran MW 10 000	Sigma	FD10S
		TW100F-4	Do igły iniekcyjnej
Agaroza	Bioshop	AGA001	Forma wtryskowa
mikroiniekcji	Adaptacyjne narzędzia naukowe	TU-1	Forma wtryskowa
Chlorek sodu	Bioshop	SOD001	Roztwór Ringera
Chlorek potasu	Bioshop	POC888	Roztwór Ringera
Chlorek magnezu sześciowodny	Sigma	M2670	Roztwór Ringera
Sodu fosforan jednozasadowy	jednowodny Sigma	S9638	Roztwór Ringera
HEPES	Sigma	H4034	Roztwór Ringera
Glukoza	BioBasic	GB0219	Roztwór Ringera
Chlorek wapnia	Sigma	C1061	Roztwór Ringera