Obrazowanie termowizyjne do nieinwazyjnego badania stresu u nieskrępowanych ptaków

Podsumowanie

Istnieje potrzeba nieinwazyjnej oceny stresu. W artykule opisano prosty protokół wykorzystujący obrazowanie termiczne do wykrywania znaczącej reakcji temperatury okolicy oczu u dzikich sikorek modraszkich na łagodny ostry stresor.

Streszczenie

Stres, centralne pojęcie w biologii, opisuje zestaw awaryjnych reakcji na wyzwania. Wśród innych reakcji, stres prowadzi do zmiany przepływu krwi, która powoduje napływ netto krwi do kluczowych narządów i wzrost temperatury głębokiej. Ta hipertermia wywołana stresem służy do oceny stresu. Jednak pomiar temperatury rdzenia jest inwazyjny. Gdy przepływ krwi jest przekierowywany do rdzenia, peryferia ciała mogą się ochłodzić. W artykule opisano protokół, w którym obwodowa temperatura ciała jest mierzona nieinwazyjnie u dzikich sikorek modraszków (Cyanistes caeruleus) za pomocą termografii w podczerwieni. W terenie stworzyliśmy zestaw do ustawiania ptaków w idealnej pozycji przed kamerą za pomocą pudełka z przynętą. Kamera rejestruje krótki termowizyjny obraz ptaka, który nie jest zakłócony, a następnie stosuje łagodny stresor (zamyka pudełko, a tym samym chwyta ptaka), a następnie rejestruje reakcję ptaka na uwięzienie. Goła skóra w okolicy oczu jest najcieplejszym obszarem na obrazie. Pozwala to na automatyczne wyodrębnienie maksymalnej temperatury obszaru oczu z każdej klatki obrazu, a następnie dalsze kroki ręcznego filtrowania danych, usuwając najczęstsze źródła błędów (rozmycie ruchu, mruganie). Protokół ten zapewnia szereg czasowy temperatury obszaru oka z dokładną rozdzielczością czasową, która pozwala nam nieinwazyjnie badać dynamikę reakcji na stres. Dalsze prace muszą wykazać przydatność tej metody do oceny stresu, na przykład do zbadania, czy reakcja na temperaturę w okolicy oka jest proporcjonalna do siły stresora. Jeśli uda się to potwierdzić, będzie to stanowić cenną alternatywną metodę oceny stresu u zwierząt i będzie przydatne dla szerokiego grona badaczy, od ekologów, biologów zajmujących się ochroną przyrody, fizjologów po badaczy zajmujących się dobrostanem zwierząt.

Wprowadzenie

Stres to centralne pojęcie w biologii, opisujące awaryjną reakcję organizmu w odpowiedzi na wyzwanie środowiskowe próbujące przywrócić homeostazę ^1,2. Pod wpływem stresu wzrasta poziom glukozy we krwi, kwasów tłuszczowych i aminokwasów, tętno, częstość oddechów i tempo przemiany materii, a krew jest kierowana z obwodów do narządów rdzeniowych ². Ten ogólny wzorzec zmian fizjologicznych przygotowuje zwierzę do szybkiego i adaptacyjnego reagowania na szereg wyzwań społecznych i fizjologicznych. Podczas gdy rozpoznawanie i rozumienie stresu leży u podstaw zarówno czystych, jak i stosowanych badań na zwierzętach, ocena stresu u nieskrępowanych zwierząt pozostaje wyzwaniem.

Powszechnie stosowanym fizjologicznym markerem stresu jest wzrost poziomu krążących hormonów glikokortykosteroidowych, takich jak kortyzol i kortykosteron ^1,2. Dużą zaletą tego podejścia jest to, że ich stężenia rosną proporcjonalnie do intensywności stresora, co pozwala na ilościowe określenie stresu. Glikokortykosteroidy nie są jednak same w sobie hormonami stresu, lecz mobilizatorami magazynów energii ². W związku z tym poziom glikokortykosteroidów zmienia się również wraz z zapotrzebowaniem na energię, porą dnia, wiekiem i statusem rozrodczym ^3,4, a także w odpowiedzi na pozornie pozytywne sytuacje, takie jak możliwość krycia ⁵. Poziomy glikokortykosteroidów należy zatem interpretować ostrożnie i w określonym kontekście. Pomiar odpowiedzi glikokortykosteroidów na ostry stres ma również pewne ograniczenia. Ostry stresor wyzwala dynamiczną reakcję polegającą na początkowym wzroście poziomu glikokortykosteroidów, a następnie powrocie do poziomu wyjściowego ^1,2. Próbki glikokortykosteroidów są zwykle uzyskiwane inwazyjnie, poprzez pobieranie próbek krwi, które same w sobie są stresorem i dlatego mogą wpływać na mierzone poziomy glikokortykosteroidów ⁶. Co więcej, poziomy glikokortykosteroidów mogą być mierzone tylko w jednym lub bardzo niewielu punktach czasowych, które mogą nie uchwycić zmian w szczytowych poziomach i czasie lub czasie trwania odpowiedzi, ograniczając naszą zdolność do badania zmian w czasie dynamicznej reakcji na stres u osób. Nieinwazyjne metody pobierania próbek hormonów, takie jak z kału ⁷, włosów lub piór ⁸, mierzą średnie poziomy glikokortykosteroidów w dłuższej skali czasowej, dni lub miesięcy, chociaż przydatne do badania przewlekłych stresorów, nie mają zastosowania w badaniu ostrego stresu. Ponieważ nawet najlepiej sprawdzone metody oferują jedynie ograniczoną perspektywę na zmienność ostrego stresu u poszczególnych osób, istnieje potrzeba alternatywnej metodologii pomiarów stresu fizjologicznego.

Ponieważ reakcja na stres obejmuje szereg efektów fizjologicznych, istnieją inni kandydaci, którzy mogą wskazywać na stres. Między innymi zwężenie naczyń krwionośnych za pośrednictwem układu współczulnego kieruje krew z obwodu do rdzenia ciała. To stężenie krwi, a co za tym idzie ciepła, wraz z różnymi formami termogenezy wywołanej stresem, ogrzewa rdzeń ⁹. W związku z tym ocieplenie rdzenia, określane jako hipertermia wywołana stresem (SIH), było również wykorzystywane jako marker ostrego stresu w badaniach farmaceutycznych ¹⁰. SIH zazwyczaj podnosi temperaturę głębokiego ciała o 0,5–1,5 °C w ciągu 10–15 minut od wystąpienia ostrego czynnika stresogennego ¹⁰. Jest to stosunkowo dobrze udokumentowane zjawisko, że powszechnie stosowany eksperymentalny stresor związany ze łapaniem i obchodzeniem się ze zwierzęciem może podnieść temperaturę ciała u wielu gatunków ssaków i ptaków ^11–17. Co ważne, SIH koreluje z innymi ustalonymi wskaźnikami stresu, takimi jak tętno ¹⁸, poziom glukokortykosteroidów ¹⁹ i zachowanie ^20,21. Podobnie jak w przypadku poziomów glikokortykosteroidów, temperatura rdzenia jest liniowo związana z poziomem stresu u niektórych gatunków ²². Jednak, podobnie jak w przypadku pobierania krwi, pomiar temperatury głębokiej jest sam w sobie inwazyjny i wymaga wprowadzenia lub wszczepienia sondy ¹⁰. Podstawowa temperatura rdzenia stopniowo wzrasta za każdym razem, gdy konieczne jest powtórzenie obsługi lub włożenia sondy wywołującej naprężenia ²³. Niedawne osiągnięcia w zakresie urządzeń do rejestrowania temperatury, które umożliwiają zdalny dostęp do danych, mogą stanowić rozwiązanie, przynajmniej w przypadku dużych zwierząt ²⁴.

W tym samym mechanizmie, który generuje SIH, znajduje się jeszcze jeden potencjalny marker stresu: obwodowe zwężenie naczyń krwionośnych, które przenosi krew, a wraz z nią ciepło, do rdzenia, jednocześnie chłodzi skórę ¹⁷. W przeciwieństwie do temperatury wewnętrznej, temperaturę skóry można mierzyć całkowicie nieinwazyjnie, za pomocą termografii w podczerwieni (IRT). IRT przekształca promieniowanie podczerwone emitowane z powierzchni obiektu na temperaturę ²⁵. Ponieważ powierzchnia zwierzęcia ma zazwyczaj kilka gołych plam, z których można bezpośrednio określić temperaturę skóry, wymaga to dostępu do naturalnie odsłoniętej skóry (np. obszaru wokół oka) lub stworzenia gołej plamy poprzez przycinanie futra lub piór. Pod warunkiem, że dostęp do odpowiednio odsłoniętego obszaru skóry i zwierzę może znajdować się w polu widzenia kamery, kamery IRT mogą być używane do zdalnego rejestrowania ciągłych pomiarów temperatury skóry, co może pozwolić na sfilmowanie pełnej reakcji temperaturowej i porównanie jej między osobami. Chociaż wykazano już u kurcząt, że temperatura powierzchni reaguje na ostry stres ²⁶, nowość tego badania polega na tym, że mierzy ono temperaturę powierzchni ciała dzikich zwierząt w dokładniejszej rozdzielczości czasowej niż poprzednie badania, a także pokazuje, że oczekiwany spadek temperatury skóry można wykryć na polu, na którym temperatura, Wilgotność i pogoda są zmienne. Celem pracy jest opisanie niezbędnej metodyki pomiaru temperatury skóry zwierzęcia nieskrępowanego za pomocą obrazowania termicznego. Używamy chwytania do wywołania łagodnego ostrego stresu u wolno żyjących sikorek modraszkich (Cyanistes caeruleus, Linnaeus 1758) i opisujemy, jak uchwycić odpowiednie obrazy, przeanalizować obrazy i przetworzyć dane w celu uzyskania krzywych odpowiedzi na temperaturę w czasie, które wykazują znaczne ochłodzenie temperatury skóry ptaków w odpowiedzi na łagodny stresor. Może to stanowić cenną alternatywną metodę oceny stresu u zwierząt dzikich i żyjących w niewoli, przydatną dla szerokiego grona badaczy, od ekologów, biologów zajmujących się ochroną przyrody i fizjologów po badaczy zajmujących się dobrostanem zwierząt.

Badanie zostało przeprowadzone w okresie od 17^grudnia 2013 do^{4 stycznia} 2014 w lesie dębu liściastego (Quercus spp.) w Szkockim Centrum Ekologii i Środowiska Naturalnego (SCENE), University of Glasgow na wschodnim brzegu Loch Lomond, zachodnio-centralna Szkocja (56.13°N, 4.13°W). Protokół obejmuje trzy główne kroki: (1) stworzenie odpowiednich warunków, w których można uchwycić obrazy termiczne zwierzęcia żyjącego na wolności, (2) zastosowanie ostrego stresora podczas nagrywania filmu termicznego oraz (3) wyodrębnienie i przetworzenie danych z obrazów termowizyjnych, które następnie można wykorzystać do scharakteryzowania reakcji zwierzęcia na ostry stresor. W naszym przypadku zwabiliśmy wolno żyjącego wróblowatego, modraszka modraszka, do budki do karmienia (zestaw do filmowania), gdzie zoptymalizowano warunki do przechwytywania obrazu termicznego, a następnie zastosowaliśmy stres związany z chwytaniem, zdalnie zamykając karmę, gdy ptak był w środku. Opis przechwytywania obrazów termowizyjnych i ekstrakcji danych jest specyficzny dla używanego przez nas sprzętu i może się różnić w zależności od systemu termowizyjnego. Przetwarzanie danych jest opisane za pomocą oprogramowania typu open source.

Protokół

Oświadczenie etyczne:

Praca polegała na rutynowej metodzie łapania wolno żyjących małych wróblowatych zatwierdzonej przez British Trust for Ornithology, a protokół chwytania wywołujący łagodny stres u ptaków został przeprowadzony na podstawie licencji brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych.

1. Przygotowanie do filmowania

1. Stwórz zestaw do filmowania, w którym ptaki są zachęcane do ustawiania się przed kamerą (Rysunek 1). Ptak wchodzi do zestawu przez otwór w jednej ścianie końcowej i ma dostęp do pożywienia w pobliżu przeciwległej ściany końcowej.
2. Aby przyzwyczaić ptaki do tego ustawienia, należy zapewnić odpowiedni pokarm (np. ziarna orzeszków ziemnych) w karmniku na kilka tygodni przed rejestracją. Oprócz dostarczania jedzenia, pozostaw ustawienie w spokoju. W tym okresie umieść atrapę statywu przed karmnikiem, aby ptaki mogły również przyzwyczaić się do kamery.
3. W dniu nagrywania należy zmniejszyć dostępność ziaren orzeszków ziemnych w zestawie, usuwając cały pozostały pokarm z karmnika i zastępując go pokarmem znajdującym się w przezroczystym pojemniku z małym otworem pośrodku na górze, przez który ptaki mogą uzyskać dostęp do pokarmu. Umieść ten pojemnik na żywność na środku klatki na końcu naprzeciwko otworu wejściowego.
4. Umieść mały kwadrat czarnej taśmy izolacyjnej o emisyjności znanej jako emisyjność naturalna w jednym z rogów siatki pudełka, tak aby pojawiała się na wszystkich obrazach. Przymocuj czarną taśmę izolacyjną do termopary połączonej z rejestratorem temperatury, który rejestruje temperaturę czarnej taśmy izolacyjnej z rozdzielczością 0,1 °C co 1 sek.
5. Umieść kamerę termowizyjną w odległości 50 cm od środka pułapki, tak aby cała skrzynka zmieściła się w polu widzenia kamery, a ptaki żerujące z przezroczystego pojemnika zostaną umieszczone w strefie ostrości kamery. Podłącz kamerę do laptopa, ustaw kamerę tak, aby nagrywała obrazy średnio z prędkością 7,5 klatki na sekundę (ze znacznikiem czasu) i wysyłaj obrazy na dysk twardy laptopa, aby tam je zapisać.
6. Przymocuj żyłkę wędkarską do obrotowych drzwi zestawu i rozwiń ją do pozycji, w której eksperymentator jest ukryty przed wzrokiem ptaków, ale ustawienie można nadal obserwować - około 20 m od ustawienia.

2. Filmowanie reakcji ptaka na łagodny ostry stres

1. Gdy ptak wejdzie do karmnika, pozostaw go w spokoju w budce na ok. 5 sekund.
2. Pociągnij za żyłkę po spędzeniu przez ptaka ok. 5 sekund w pudełku, aby zamknąć karmnik. Uważaj, aby ptak nadal znajdował się na drugim końcu pudełka, aby zminimalizować ryzyko zranienia ptaka.
3. Natychmiast podejdź do karmnika i stój nieruchomo za kamerą przez około 3 minuty. Następnie wyjmij ptaka z pudełka i puść go.

3. Ekstrakcja temperatury okolicy oka z obrazów termowizyjnych

1. Wyodrębnij maksymalną temperaturę z każdej klatki. Uwaga: Maksymalna temperatura była praktycznie zawsze rejestrowana w obszarze wokół oka, ograniczonym przez odsłoniętą skórę pierścienia okołoocznego (ryc. 2) i jest dalej określana jako temperatura okolicy oka.
   1. W oprogramowaniu do analizy termowizyjnej kliknij prawym przyciskiem myszy na obraz, "dodaj" nowy wykres dla maksimum obrazu. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy wykres, który eksportuje dane (temperaturę obszaru oka i czas wykonania klatki) do pliku CSV.
2. Usuń z pliku CSV wszystkie linie z ramek, w których obszar oczu ptaka nie był widoczny
.
3. Wykreślić maksymalną temperaturę w funkcji czasu w R ²⁷, ręcznie określić punkty, w których skoki temperatury > +0,2 °C między dwoma kolejnymi odczytami, gdy błona nazębna została naciągnięta na oko (mruganie) oraz punkty o niskich wartościach poza zakresem temperatur ciała dla ptaków ²⁸ (tj. gdy obszar oka był widoczny, ale rozmyty przez ruch przez wiele klatek), a następnie usunąć odpowiednie linie z pliku danych CSV utworzonego w kroku 3.1.
4. Zmierz temperaturę otoczenia.
   1. Pobierz dane (czas i temperaturę rejestratora) z rejestratora temperatury na komputer i wyeksportuj do arkusza kalkulacyjnego.
   2. Aby uzyskać temperaturę otoczenia z obrazu termicznego, w oprogramowaniu do analizy obrazu termicznego narysuj kwadrat na czarnej taśmie izolacyjnej, która pokryła sondę rejestratora temperatury, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy kwadrat i wybierz "dodaj nowy wykres" dla średniej temperatury kwadratu.
   3. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy ten wykres, aby wyeksportować dane (czas i temperaturę IRT) do pliku CSV. Połącz dwa wynikowe szeregi czasowe temperatury dla rejestratora temperatury i dopasowania obrazu termicznego dla czasu w jednym arkuszu kalkulacyjnym.
5. Dostosuj temperaturę okolicy oczu do temperatury otoczenia. Wyeksportuj arkusz kalkulacyjny utworzony w kroku 3.4 do pliku CSV dopasowując czas. Do każdej zatrzymanej temperatury okolicy oka dodaj różnicę między rejestratorem temperatury a wartościami temperatury uzyskanymi z obrazowania termicznego (temperatura rejestratora – temperatura IRT) zmierzonymi w tym samym czasie.
6. Przeprowadź automatyczne filtrowanie, aby usunąć mniej dokładne wartości niskiej temperatury w okolicy oka za pomocą algorytmu wyszukiwania wartości szczytowych (patrz Plik kodu uzupełniającego), aby automatycznie wyodrębnić najwyższe (a tym samym najdokładniejsze) punkty w danych.
   Uwaga: Algorytm wyszukiwania szczytów reorganizuje dane dotyczące temperatury w wektor o zdefiniowanej przez użytkownika szerokości (rozpiętości), zalecany zakres = 3, wyodrębniając wartość środkową w wierszach, w których liczby po obu stronach są niższe, tj. szczyty.
7. Użyj interpolacji liniowej, aby zamknąć przerwy pozostawione przez sekwencje, gdy żaden pik nie został wyodrębniony i gdy obszar oka nie był widoczny. Użyj polecenia na.approx (pakiet zoo v1.7-11 w R ²⁷), aby podać pojedynczą wartość temperatury na sekundę dla każdej osoby.
8. W pliku danych CVS dodaj wartość 0,2 do każdej temperatury obszaru oka, aby skorygować efekt wykonywania zdjęć przez siatkę.
   Uwaga: Testy wykazały, że gdy ciało doskonale czarne, podgrzane do przybliżonej średniej temperatury ciała ptaka wynoszącej ~41 ºC w fazie aktywnej ²⁸, było obrazowane przez okienko siatki o tym samym rozmiarze siatki, jaki został użyty w konfiguracji do filmowania, temperatury zarejestrowane przez kamerę termowizyjną w obszarach niezasłoniętych przez druty były o 0,2 ºC niższe niż wartości uzyskane bez siatki interweniującej (średnia różnica = -0,2 ºC ± 0,085 SD, n = 30, zakres temperatur ciała doskonale czarnego = 41,6–42,5 ºC).
   Uwaga: Jest to współczynnik korekcyjny specyficzny dla warunków w tym badaniu i prawdopodobnie będzie się różnił w zależności od marki przyrządu oraz rodzaju i szerokości siatki między zwierzęciem a kamerą, a w każdej sytuacji musi być ustalony dla konkretnych warunków badania.
9. Z maksymalnych temperatur okolicy oczu zarejestrowanych przed zamknięciem pudełka należy wybrać najwyższą wartość, która będzie stanowić podstawową temperaturę okolicy oczu niezakłóconego ptaka. Dodaj tę podstawową temperaturę obszaru oczu jako nową kolumnę do pliku CVS (linia bazowa). Następnie odejmij wartość bazową od każdej zachowanej maksymalnej wartości temperatury w okolicy oka, generując nową kolumnę w pliku danych CVS.
   Uwaga: Ta nowa wartość wyraża teraz reakcję ptaka na łagodny ostry stres jako odchylenie od niezakłóconej temperatury wyjściowej.
10. Wykreśl odchylenia maksymalnej temperatury okolicy oka od podstawowej temperatury okolicy oka wszystkich osobników po zamknięciu pułapki za pomocą polecenia ggplot (pakiet ggplot2 v1.0.0 w R ²⁷). Wygeneruj bootstrapowane 95% przedziały ufności za pomocą opcji mean_cl_boot (pakiet ggplot2 v1.0.0 w R ²⁷). Szczegółowe informacje można znaleźć w pliku kodu uzupełniającego.

Wyniki

Przedstawiono wyniki uzyskane od 9 wolno żyjących modraszek, które ilustrują informacje możliwe do uzyskania za pomocą obrazowania termowizyjnego i wykazują, że przewidywany sygnał stresu w temperaturze okolic oczu ptaka może zostać wykryty u zwierząt żyjących na wolności. Każdy ptak był filmowany średnio przez 5,1± 0,9 s (n=9) przed zamknięciem drzwiczek pudełka. Pozwoliło to na obliczenie temperatury okolic oczu niezakłóconego ptaka (temperatury bazowej), do której można odnieść wszystkie kolejne pomiary. W testach przeprowadzonych na 20-sekundowych klipach wideo z termowizji przedstawiających niezakłócone modraszki przylatujące i żerujące w pułapce (n=9 ptaków innych niż te wykorzystane do aplikacji łagodnego stresora), stwierdzono korelacje r > 0,7 między maksymalną temperaturą okolic oczu zarejestrowaną w ciągu pierwszych 5 s a maksymalną temperaturą zarejestrowaną w pierwszych 10, 15 i 20 s (Rycina 3). Zinterpretowano to jako wskazanie, że maksymalna wartość zarejestrowana w pierwszych kilku sekundach po wejściu do pułapki była reprezentatywna dla poziomu długoterminowego, a średnią temperaturę okolic oczu z około 5 s bezpośrednio poprzedzających zamknięcie pudełka przyjęto jako wartość bazową. Modraszki w tej próbie miały średnią bazową temperaturę okolic oczu wynoszącą 38,4 ± 0,5 °C (średnia ± SE), w zakresie od 35,8 do 39,9 °C (n=9). Po tym, jak ptak żerował przez 5 s, co umożliwiło obliczenie bazowej temperatury okolic oczu, eksperymentator zamknął drzwiczki pudełka. Wszystkie ptaki zauważyły zamknięcie pudełka, o czym świadczyły ich próby ucieczki w locie.

Po zamknięciu pułapki temperatura w obrębie oczu gwałtownie spadła i osiągnęła minimalną wartość o ok. 1,3 °C niższą od temperatury bazowej po ok. 10 s (Rysunek 4). Rysunek 4 przedstawia krzywą złożoną, opartą na średniej maksymalnej temperaturze w obrębie oczu dla wszystkich dziewięciu osobników obliczonej dla każdej sekundy. Ponieważ czas i wielkość spadku temperatury w obrębie oczu różnią się między osobnikami, krzywa złożona maskuje rzeczywisty zakres odpowiedzi temperaturowej. Średni spadek temperatury obliczony osobno dla każdego osobnika wynosi 2,0 ± 0,2 °C, a najniższy punkt zostaje osiągnięty po 9,4 ± 2,8 s (średnia ± SE). Od tego momentu temperatura w obrębie oczu stopniowo wracała do temperatury bazowej w ciągu kolejnych 2-3 min, jednak do końca próby nie osiągnęła w pełni wartości wyjściowej.

Rycina 1. Arena filmowania. Układ w terenie został zaprojektowany tak, aby wabić ptaki w pole widzenia kamery za pomocą karmnika, gdzie można było zastosować łagodny stresor ostry. Układ składał się z drewnianej skrzynki z dykty o wymiarach 25 na 14 cm i wysokości 16,5 cm, z przednim panelem z ocynkowanej siatki drucianej o rozmiarze oczek 1 na 2,5 cm. Siatka przepuszcza promieniowanie podczerwone, co umożliwia filmowanie ptaków znajdujących się wewnątrz układu. Wybrano siatkę drucianą, ponieważ szkło i większość tworzyw sztucznych nie transmitują promieniowania podczerwonego. W lewej ścianie końcowej wycięto otwór o średnicy 60 mm, aby umożliwić ptakom wejście do układu i dostęp do pokarmu umieszczonego w prawej części skrzynki. Sonda rejestratora temperatury, umieszczona między dwoma kwadratami czarnej taśmy izolacyjnej (oznaczona czarną strzałką), jest przymocowana do prawego górnego rogu przedniego panelu w celu rejestracji temperatury referencyjnej. Łagodny stresor ostry jest stosowany wobec ptaka wewnątrz poprzez zamknięcie skrzynki. Pociągnięcie za żyłkę wędkarską przymocowaną do obrotowych drzwiczek w otworze wejściowym pozwalało eksperymentatorowi zamknąć skrzynkę, gdy ptak znajdował się wewnątrz. Kamera termowizyjna ustawiona przed pułapką rejestruje całą sekwencję zdarzeń. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2. Obraz termowizyjny modraszki. Większość ciała wróbla jest dobrze izolowana przez pióra (lub w mniejszym stopniu przez łuski na nogach), natomiast skóra wokół oka pozostaje odsłonięta i w normalnych warunkach oddaje najwięcej ciepła, będąc otoczoną przez chłodniejszy naskórek lub tło. Na niniejszym obrazie termowizyjnym jest to widoczne jako kolor żółty (najwyższa temperatura) wokół oka; kolory pomarańczowy, czerwony, fioletowy i niebieski oznaczają odpowiednio coraz niższe temperatury. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3. Powtarzalność temperatury bazowej mierzonej w różnych odstępach czasu.Współczynniki korelacji między maksymalną temperaturą zarejestrowaną w pierwszych 1-8 s klipu a „średnią z maksimumów” w zakresie 0,5º od najwyższej wartości zarejestrowanej dla pierwszych 10, 15 i 20 s klipu (reprezentowanych odpowiednio przez linie czerwoną, niebieską i zieloną). Wszystkie klipy trwały 20 s (n=9). Podczas wstępnej analizy z wykorzystaniem większego zbioru danych szereg „średnich z maksimumów” zostało obliczonych na podstawie tylko jednej wartości, co dawało taką samą wartość rho we wszystkich porównaniach. Klipy te usunięto z analizy, pozostawiając jedynie te, w których średnie zostały obliczone z więcej niż 3 pomiarów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4. Reakcja temperatury w okolicach oka na schwytanie. W zmianie temperatury w okolicach oka w czasie widoczny jest bardzo wyraźny i znaczący sygnał zdarzenia schwytania. Aby umożliwić porównanie osobników różniących się temperaturą bazową, na osi pionowej naniesiono rezydualną temperaturę w okolicach oka, zdefiniowaną jako różnica między temperaturą rzeczywistą a temperaturą bazową danego osobnika. Wartości te przedstawiono w funkcji czasu, przyjmując moment zamknięcia pułapki za punkt 0, natomiast ptaka usunięto z pułapki po 3 min. Czerwona linia przedstawia średnią temperaturę rezydualną, a szary obszar oznacza 95% przedział ufności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Celem pracy jest opisanie niezbędnej metodyki pomiaru zmian temperatury skóry zwierzęcia wolno żyjącego w odpowiedzi na ostry czynnik stresogenny. Badanie to wykazało, że gwałtowne zmiany temperatury skóry związane z ostrą reakcją na stres u dzikich ptaków można uchwycić nieinwazyjnie za pomocą IRT. Procedura ta obejmowała pięć ważnych etapów: (1) zaprojektowanie odpowiedniej konfiguracji terenowej przy użyciu przenośnego systemu termowizyjnego, (2) pomiar temperatury wyjściowej, (3) zastosowanie łagodnego czynnika stresogennego polegającego na schwytaniu ptaka w konfiguracji, (4) automatyczne pobieranie próbek temperatury w okolicy oka post hoc oraz (5) kalibracja uzyskanych danych dotyczących temperatury. Opisana tu metodologia została zastosowana do odłowu dzikich sikorek modraszek. Reprezentatywne podstawowe temperatury okolicy oka można było uchwycić w ciągu zaledwie 5 sekund. Szacowany czas potrzebny na zarejestrowanie jednego ptaka w terenie wynosił około 1 godziny, przy czym kolejna godzina była potrzebna na przetworzenie 3-minutowej sekwencji wideo termicznego.

Zebranie dobrych danych na temat temperatury skóry zwierzęcia wymaga wysokiej jakości obrazów termowizyjnych. Kamery termowizyjne różnią się zasadniczo od kamer wykorzystujących światło widzialne tylko pod względem długości fali wykrywanego przez nie promieniowania elektromagnetycznego, a zatem wiele pojęć mających zastosowanie w fotografii (np. pole widzenia, głębia ostrości) ma również zastosowanie w termografii. Jak powszechnie praktykują fotografowie dzikiej przyrody, każde miejsce, które zwierzę odwiedza w sposób przewidywalny, w którym naturalne (np. miejsca gniazdowania) lub sztuczne (np. karmniki) może być wykorzystane do zbierania obrazów termowizyjnych. Przyciąganie zwierząt do kamery, zamiast prób podążania za nimi przez ich środowisko, ma tę zaletę, że pozwala nam ustawić kamerę z wyprzedzeniem, aby zebrać wysokiej jakości obraz przy minimalnych zakłóceniach, gdy tylko zwierzę pojawi się w polu widzenia. Jednak przy takim podejściu ważne jest, aby zbadać lub uwzględnić wpływ tego konkretnego kontekstu pomiaru na stres lub temperaturę skóry. Na przykład w tym przypadku ptaki mierzono w kontekście karmienia, a jedzenie wykorzystywano do aktywnego zwabiania modraszkich do zestawu. Badania na kurczakach sugerują, że ostre pozytywne doświadczenia, takie jak oczekiwanie i spożycie nagrody w postaci jedzenia w próbie uczenia się asocjacyjnego ^{, mogą} również obniżyć temperaturę oczu. W związku z tym na "poziomy wyjściowe" osób wchodzących w ten konkretny układ może mieć wpływ związek tego aktu z nagrodą. Możliwość ta wymaga dalszych badań, choć oczekuje się, że jeśli wystąpi, zwiększy to spadek w stosunku do już zaobserwowanych poziomów wyjściowych. Co więcej, termogeneza zachodzi wraz z trawieniem pokarmu, chociaż nie oczekuje się, że specyficzne efekty pokarmu spożywanego podczas pomiaru podstawowego znacząco podniosą temperaturę w ciągu 3-minutowego okresu pułapkowania ³⁰.

Biorąc pod uwagę to ograniczenie, mierzenie wszystkich zwierząt w tym samym kontekście jest również wielką zaletą tego podejścia. Reprezentatywne wyniki wykazały, że przed zastosowaniem ostrego stresora występowały duże różnice w temperaturze okolicy oka między osobami. Zmienność wyjściowej temperatury oka (współczynnik zmienności = 3,9%) może być częściowo spowodowana błędem pomiaru lub prawdziwym odzwierciedleniem różnic między osobnikami. Okres, w którym kamera IRT rejestrowała temperaturę czarnej taśmy izolacyjnej przez 5 sekund, gdy temperatura taśmy się nie zmieniała, średni współczynnik zmienności wynosił 0,26% (zakres od 0,08% do 0,59%). Chociaż błąd pomiaru może być większy u poruszającego się ptaka, to jednak wskazuje, że większość tych różnic w wyjściowej temperaturze okolicy oczu występuje rzeczywiście między osobnikami. Przekonanie o stosunkowo małym błędzie pomiarowym w przypadku poruszających się ptaków jest dodatkowo wspierane przez wysoką powtarzalność temperatury okolicy oka przez ponad 20 sekund podczas pomiarów podstawowych (ryc. 3). Kontrolując kontekst, możemy upewnić się, że wszystkie ptaki angażowały się w tę samą aktywność. Możemy również zminimalizować wpływ środowiska w czasie pomiaru na różnice w temperaturze skóry między osobnikami, na przykład poprzez zapewnienie, że miejsce jest chronione przed zakłócającym promieniowaniem, które w przypadku obrazowania termicznego doprowadziłoby do przeszacowania temperatury powierzchni zwierzęcia. Można to zrobić, pracując w cieniu lub strategicznie rozmieszczone klosze, w tym większość przezroczystych tworzyw sztucznych, które blokują długość fali podczerwonej. Przedstawiony tutaj protokół pokazuje prostą konfigurację, którą można łatwo zastosować w sytuacji zimujących sikorek modraszek. Sikora modra została sfilmowana w karmniku z solidnym dachem, który pozwalał uniknąć ekspozycji na bezpośrednie działanie promieni słonecznych. Tę konfigurację można również zastosować do wielu innych wróblowych, które regularnie pojawiają się w sztucznych karmnikach w określonych porach roku. Ponieważ modraszki są stosunkowo małymi zwierzętami, należy je filmować z bliska, aby uchwycić dobry poziom szczegółów. Podobnie jak w przypadku aparatów fotograficznych, zbliżenie się do obiektu — zarówno pod względem rzeczywistej odległości, jak i powiększenia — znacznie zmniejsza głębię ostrości. Aby ptaki znalazły się jak najszerzej w polu widzenia, konieczne było filmowanie ich z minimalnej odległości ustawiania ostrości aparatu, która w tym przypadku wynosiła 500 mm i zmniejszyła głębię ostrości do 40 mm. W związku z tym wszystkie elementy zestawu do filmowania muszą być zaprojektowane w taki sposób, aby zachęcać zwierzęta do pokazywania głowy w stosunkowo wąskiej strefie ostrości ostrości danej używanej kamery.

W odpowiedzi na dobrze znany ostry łagodny stresor u zwierzęcia spodziewaliśmy się gwałtownych zmian we wzorcu przepływu krwi, od obwodu do rdzenia, poprzez zwężenie naczyń krwionośnych za pośrednictwem układu współczulnego, które ^{obniża temperaturę skóry}. Obszar okołooczodołowy został wybrany, ponieważ był to jedyny obszar ciała, który nie był izolowany i jest związany z bogatą, przemieszaną siecią małych naczyń krwionośnych, rete oftalmicum, która może wpływać na utratę ciepła z oka ³¹. Szybka liczba klatek na sekundę w technice filmowania termicznego była w stanie pokazać spadek temperatury okolicy oka o około 2 °C w ciągu 10 sekund, a następnie wzrost temperatury do 0,5 °C od wartości wyjściowej w ciągu 3 minut. Chociaż ochłodzenie obwodowe w odpowiedzi na łagodny stres było wcześniej rejestrowane w odstępach około 1 minuty ^{17,26, 32}, ta technika wykazała, że maksymalny spadek temperatury może być niezwykle szybki. Przy niższej rozdzielczości czasowej wielkość tego efektu może zostać pominięta. Może to być ważne przy porównywaniu różnic w reakcji na stres u różnych osób. Ponowne ogrzanie ptaka po szybkiej reakcji "walcz lub uciekaj" nie powróciło do poziomu wyjściowego, ponieważ ptak pozostał w pudełku, co wskazuje, że ptak pozostał fizjologicznie zestresowany. Ptaki zostały wypuszczone z układu doświadczalnego po arbitralnie wybranym punkcie odcięcia wynoszącym ok. 3 min, aby zminimalizować okres unieruchomienia zwierzęcia wolno żyjącego. Jednak w przyszłości badania mogą wymagać dłuższego czasu, aby zarejestrować pełną reakcję na temperaturę, dopóki temperatura w okolicy oczu zwierzęcia nie powróci do poziomu wyjściowego, jeśli jest to logistycznie możliwe.

Ten nowy protokół obejmujący serię obrazów zebranych przed i po zastosowaniu stresora pozwala teraz na szczegółowe badanie dynamiki reakcji na ostry stres i porównania wielu punktów czasowych między poszczególnymi zwierzętami. Powtórzenie tego badania u osób w różnych porach roku lub warunkach środowiskowych może pozwolić na rozwikłanie wpływu środowiska na temperaturę skóry na poziomie wyjściowym lub po ostrym stresie, jako możliwą drogę do oceny przewlekłego stresu. .

Temperatura skóry ptaka zależy nie tylko od metabolicznej produkcji ciepła i przepływu krwi, ale także od wymiany ciepła z promieniowania słonecznego, prędkości wiatru i zwilżania ²⁵. Uniemożliwia to dokładne zapisy termograficzne w mokrych i wietrznych warunkach. Temperatura okolicy oka zarejestrowana przez kamerę termowizyjną może być czasami niedoszacowana (błąd ujemny) lub przeszacowana (błąd dodatni). Znaczny błąd dodatni wymagałby wkładu energii, ale udało się tego uniknąć dzięki temu, że ptak w karmniku był osłonięty przed słońcem. Innym źródłem błędu dodatniego było mrugnięcie ptaka. Od czasu do czasu ptak na krótko naciąga swoją błonę nakłuwającą na okolicę oka, a ponieważ jest ona przechowywana wewnętrznie w temperaturze bliższej temperaturze rdzenia ciała, mruganie daje anomalnie wysoki odczyt temperatury, gdy zakrywa gałkę oczną. Jest to jednak łatwe do wykrycia, ponieważ pozostawia bardzo wyraźny podpis, a dotkniętą ramką można usunąć. Głównym powodem negatywnego błędu w naszych zapisach było rozmycie ruchu. Każdy ruch zbyt szybki, aby mógł być uchwycony ostro przez liczbę klatek na sekundę aparatu, powoduje zakłócenie danych przechwyconych z małego, ciepłego obszaru oka obrazu z danymi z otaczającego go chłodnego obszaru (rozmycie ruchu), co skutkuje niedoszacowaniem temperatury obszaru oczu. Tak więc, po usunięciu błędów dodatnich, maksymalna temperatura zmierzona z obszaru oka jest najdokładniejszym pomiarem, a automatyczne filtrowanie za pomocą polecenia funkcji pików usuwa mniej prawdopodobne niższe wartości maksymalnych temperatur obszaru oka.

Ponadto, ponieważ promieniowanie podczerwone jest pochłaniane przez parę wodną, na zarejestrowaną temperaturę powierzchni będzie miała wpływ wilgotność względna otoczenia. Można to uwzględnić, wprowadzając temperaturę powietrza, wilgotność względną i odległość od obiektu do analitycznego oprogramowania do analizy obrazu termicznego. Jednak bardziej dokładnym i efektywnym podejściem (podjętym w tym przypadku) jest włączenie w pole widzenia ciała odniesienia o znanej temperaturze i emisyjności. W naszym przypadku był to kwadrat czarnej taśmy izolacyjnej o emisyjności 0,97, co jest w przybliżeniu równoważne naturalnej powłoce ³³. Pozwala to na kalibrację temperatury okolicy oka przy użyciu różnicy między rzeczywistymi a wynikającymi z obrazowania termicznego wartościami temperatury zmierzonymi dla taśmy izolacyjnej. Temperatura powierzchni ciała doskonale czarnego może być następnie wykorzystana do kalibracji obrazów w sposób ciągły przez cały okres pomiaru.

Dzięki postępowi technologicznemu w rozwoju kamer termowizyjnych mogą one być obecnie wykorzystywane jako małe, lekkie kamery, zdolne do zbierania wielu klatek na sekundę przez dłuższy czas. Chociaż obrazowanie termowizyjne jest szeroko stosowaną techniką w badaniach nad ptakami ²⁵, rozmiar i koszt systemów termowizyjnych ograniczyły jej zastosowanie w środowisku naturalnym. W tym badaniu system był bardzo przenośny, kosztował ok. 6 000 funtów i zapewniał obraz termowizyjny o wysokiej rozdzielczości, zdolny do nieinwazyjnego rejestrowania dokładnych danych o temperaturze od wolno żyjących zwierząt bez konieczności zajmowania się ptakami. Nagrywanie z prędkością wielu klatek na sekundę pozwala na pomiary szeregów czasowych temperatury obwodowej o wysokiej rozdzielczości, a tym samym daje możliwość zbadania dynamiki reakcji na ostry stres. Jest to trudne do osiągnięcia w przypadku konwencjonalnej próbki glikokortykosteroidów, która jest ograniczona liczbą próbek, które można pobrać w określonym czasie. Tutaj wyodrębniliśmy szereg czasowy temperatury okolicy oka w odstępie 1 sekundy, co było wystarczające do zademonstrowania reakcji temperatury obszaru oka na ostry stresor (przechwytywanie), ale możliwa byłaby również wyższa rozdzielczość czasowa. Nagromadzenie dużej liczby obrazów wymaga jednak pewnego poziomu automatyzacji w wydobywaniu informacji z obrazów. Protokół opisuje prosty, półautomatyczny proces wydobywania maksymalnej temperatury z każdego obrazu. Udało nam się to zrobić, ponieważ obszar zainteresowania, obszar oka, był zawsze najcieplejszym punktem na obrazie. Analiza może być bardziej problematyczna, jeśli obszary zainteresowania są bardziej złożone i mogą wymagać specjalnie zaprojektowanego oprogramowania do rozpoznawania wzorców (np. ³⁴). W tym badaniu wymagane było ręczne filtrowanie w sytuacjach, w których temperatura w okolicy oka była zawyżona lub niedoszacowana, ale były one łatwe do wykrycia, ale oczywiście pożądana jest dalsza automatyzacja. Pomiary chłodzenia obwodowego wywołanego stresem za pomocą obrazowania termicznego stanowią cenne uzupełnienie innych fizjologicznych pomiarów stresu, a nieinwazyjny aspekt tej techniki jest bardzo korzystny dla dalszych badań na zwierzętach żyjących w niewoli i dzikich.

Termografia w podczerwieni, która rejestruje pełną reakcję na stres, ma ogromny potencjał jako narzędzie do oceny stresu. Aby jednak stać się nieinwazyjną alternatywą dla ustalonych testów hormonalnych i temperatury głębokiej, konieczna będzie walidacja krzyżowa między tymi miarami i określenie, czy temperatura skóry wykazuje taką samą proporcjonalność do intensywności stresora, tj. zakres reakcji na temperaturę skóry może odzwierciedlać siłę stresora. Przyszłe badania powinny również dotyczyć tego, czy temperatura skóry wychwytuje przewlekły stres. Podczas gdy oczekuje się, że SIH w odpowiedzi na ostry stresor będzie przejściowy, nawracające narażenie na ostre stresory fizyczne lub psychiczne może powodować przewlekłe podwyższenie temperatury ciała ^35,36. To, czy trwające zwężenie naczyń krwionośnych przyczynia się do tego uniesienia rdzenia, nie zostało wyraźnie przetestowane. Jednak badania korelacyjne na ludziach cierpiących na przewlekłą chorobę związaną ze stresem wykazują obniżoną temperaturę palców ³⁷. Ostatnim atrybutem do zbadania jest wartościowość: zdolność do odróżniania pozytywnych od negatywnych wydarzeń. Testy hormonalne nie są w stanie rozróżnić wartościowości ⁵, przy czym poziomy glikokortykosteroidów wydają się odzwierciedlać poziom pobudzenia, a nie stres. Badania nad temperaturą grzebienia u kur domowych narażonych na awersyjne i pozytywne bodźce sugerują, że temperatura skóry może być podobnie zbliżona do ogólnego pobudzenia ^22,29. Jednak u ludzi różne stany emocjonalne wywołują regionalne zmiany temperatury skóry, na przykład ocieplenie okołooczodołowe i chłodzenie policzków po zaskoczeniu ³⁸, ale ogólnie obniżona temperatura skóry podczas śmiechu ³⁹. Porównania między różnymi regionami mogą jeszcze ujawnić stan emocjonalny. Korzystając z zaleceń przedstawionych w tym artykule, możliwe będzie znalezienie odpowiedzi na wszystkie te pytania i walidacja temperatury skóry jako nieinwazyjnego markera stresu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kamera termowizyjna	FLIR	A65 (f=25 mm)	Kompaktowa (106 x 40 x 43 mm) i tania
Oprogramowanie do analizy obrazu termicznego	FLIR	ResearchIR v3.4	Umożliwia szybki zapis obrazu termicznego i analizę wzorców termicznych
Rejestrator temperatury	Gemini Rejestratory danych	Tinytag Talk 2 TK-4023-PK	Monitory od -40 do +125 ° C za pomocą dołączonej sondy temperatury