Artykuł metodologiczny

Badanie stechiometrii receptora naskórkowego czynnika wzrostu w nienaruszonych komórkach przy użyciu mikroskopii korelacyjnej

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53186

⸱

11 września 2015

 , 
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, University of Saarland

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje znakowanie receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) na komórkach fibroblastów COS7, a następnie korelacyjną mikroskopię świetlną i elektronową całych komórek w stanie uwodnionym. Etykieta zawierała fluorescencyjne kropki kwantowe. Protokół może być wykorzystany do badania stechiometrii EGFR na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Streszczenie

Ten protokół opisuje znakowanie receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) na komórkach fibroblastów COS7, a następnie korelacyjną mikroskopię fluorescencyjną i środowiskową skaningową mikroskopię elektronową (ESEM) całych komórek w stanie uwodnionym. Fluorescencyjne kropki kwantowe (QD) sprzężono z EGFR za pomocą dwuetapowego protokołu znakowania, zapewniając wydajne i specyficzne znakowanie białek, unikając jednocześnie grupowania receptora wywołanego znacznikiem. Mikroskopia fluorescencyjna dostarczyła obrazów przeglądowych lokalizacji komórkowych EGFR. Detektor skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM) został wykorzystany do wykrycia znaczników QD z rozdzielczością nanoskali. Uzyskane obrazy korelacyjne dostarczają danych na temat komórkowego rozkładu EGFR i stechiometrii na poziomie pojedynczej cząsteczki w naturalnym kontekście uwodnionej, nienaruszonej komórki. Obrazy ESEM-STEM ujawniły, że receptor jest obecny w postaci monomeru, homodimera i w małych skupiskach. Znakowanie dwoma różnymi QD, tj. jednym emitującym przy 655 nm i przy 800 wykazało podobne wyniki charakterystyczne.

Wprowadzenie

Niedawno wprowadzono nowe podejście, aby obrazować całe komórki z oznakowanymi białkami w stanie ciekłym za pomocą STEM1-3 lub korelacyjnej mikroskopii fluorescencyjnej i STEM4-7. Metodologia ta jest w stanie badać przestrzenne rozmieszczenie białek błonowych i kompleksów białkowych, w tym ich stechiometrię na poziomie pojedynczej cząsteczki w nienaruszonych błonach plazmatycznych całych komórek. W tym miejscu opisujemy protokół obejmujący dwuetapowe specyficzne znakowanie białek receptorowych za pomocą fluorescencyjnych kropek kwantowych (QDs)8 oraz korelacyjną mikroskopię świetlną i ESEM-STEM. Na przykład badaliśmy EGFR, białko błonowe należące do nadrodziny kinaz białkowych. Po związaniu liganda receptor aktywuje się, a następnie tworzy dimer z innym aktywowanym EGFR; Następująca po tym kaskada sygnałowa napędza proliferację komórek9. Mutacje prowadzące do nieprawidłowej ekspresji lub aktywności EGFR odgrywają kluczową rolę w wielu typach nowotworów10. Badanie przestrzennego rozmieszczenia tego receptora błonowego w całych komórkach dostarcza ważnych informacji kontekstowych na temat jego funkcji i możliwych zmianw niej 11-14. Wyzwaniem pozostaje jednak zbadanie rozkładu monomerów, dimerów i klastrów EGFR bezpośrednio na poziomie (sub)komórkowym za pomocą biochemicznych lub konwencjonalnych metod mikroskopowych15. Nasza metoda jest w stanie uwidocznić EGFR z rozdzielczością przestrzenną kilku nanometrów, dzięki czemu można określić położenie białek w kompleksie. Co najważniejsze, uzyskana informacja o rozkładzie stechiometrycznym odnosi się do natywnej sytuacji białka w nienaruszonej komórce.

Aby osiągnąć niewielką odległość między etykietą a receptorem, EGFR został bezpośrednio oznaczony za pomocą swojego liganda EGF, używając wiązania biotyna-streptawidyna z QD. Znacznik ten można wykryć zarówno za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak i elektronowej. Użyliśmy tego znacznika do korelacyjnego obrazowania komórek COS7 w cieczy zamkniętej w komorze mikroprzepływowej wcześniej1,16,17. Jednak ze względu na wielokrotność cząsteczek streptawidyny na QD, znacznik ten może indukować grupowanie receptorów, co prowadzi do niskiej skuteczności znakowania lub dość kosztownych eksperymentów i nie jest możliwe wyciągnięcie wniosków na temat stechiometrii badanego białka. Grupowania receptorów indukowanego znakowaniem można całkowicie uniknąć, stosując przedstawioną tutaj dwuetapową procedurę znakowania, w wyniku której powstaje sonda zawierająca biotynylowany EGF, do której sprzężona jest tylko jedna kropka kwantowa streptawidyny (STR-QD). Komórki są najpierw inkubowane z biotynylowanym EGF, a następnie utrwalane. Etap fiksacji określa punkt czasowy, w którym procesy białkowe zostają zatrzymane (w zależności od szybkości utrwalania). STR-QD jest następnie stosowany jako drugi etap protokołu etykietowania. Grupowanie nie ma miejsca, ponieważ dynamiczny ruch błony białek jest utrudniony, gdy białka są już utrwalone. Co więcej, roztwór STR-QD, który jest najdroższym składnikiem eksperymentu, może być stosowany w zoptymalizowanym niskim stężeniu, a ten drugi etap etykietowania nie jest kluczowy czasowo, tj. QD można sprzęgnąć w ciągu kilku minut.

Aby zbadać stechiometrię EGFR rozprowadzanego w całych komórkach, próbki komórkowe zostały przygotowane na mikroprocesorach krzemowych18. Po zastosowaniu dwuetapowego znakowania QD i zarejestrowaniu obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej, komórki przepłukano czystą wodą i zobrazowano w stanie uwodnionym za pomocą ESEM-STEM19. Uzyskane obrazy korelacyjne dostarczają informacji o dystrybucji komórkowej EGFR i stechiometrii w ich naturalnym kontekście uwodnionych komórek. Podobną metodę zastosowano do badania białek HER2 w komórkach raka piersi w niedawnym badaniu7.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników do etykietowania i utrwalania

  1. Przygotować bufor do etykietowania (BSA-GEL-PBS) przy użyciu autoklawowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, pH 7,4 (PBS). Uzupełnij 1% BSA (frakcja albuminy bydlęcej V, bez biotyny) i 0,2% żelatyny (żel, ze skóry ryb zimnowodnych) i dobrze sfermentuj/wstrząśnij.
    Uwaga: Może być przechowywany przez ~5 dni w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować bufor płuczący (BSA-PBS) z autoklawizowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, pH 7,4. Uzupełnij 1% BSA i dobrze wymieszaj/wstrząśnij. Uwaga: Może być przechowywany przez ~5 dni w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotować 50 mM bufor boranowy (BB) z 200 mM roztworu podstawowego kwasu borowego, pH dostosowanego do 8,3 z 200 mM tetraboranu sodu. Uwaga: Może być przechowywany przez ~12 miesięcy w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować 0,1 M bufor kakodylowy (CB) z 0,2 M roztworu podstawowego kakodylanu sodu, pH dostosowanym do 7,4, uzupełniony 0,1 M sacharozy.
    Uwaga: Otwarty roztwór podstawowy można przechowywać przez ~5 dni w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotować 0,1 M glicyny w PBS (GLY–PBS).
    Uwaga: Może być przechowywany przez ~ 2 miesiące w temperaturze 4 °C.
  6. Przygotować 3% paraformaldehydu w CB (3% PFA) ze świeżo przygotowanej lub otwartej fiolki z 16% PFA, roztwór podstawowy, klasa EM.
    Uwaga: Otwarty roztwór podstawowy można przechowywać przez ~5 dni w temperaturze 4 °C.
  7. Przygotować 2% aldehydu glutarowego w CB (2% GA) ze świeżo przygotowanej (lub otwartej fiolki) 25% roztworu podstawowego GA, klasa EM.
    Uwaga: Otwarty roztwór podstawowy można przechowywać przez ~5 dni w temperaturze 4 °C.
  8. Przygotuj roztwór do etykietowania EGF-biotyna o długości fali 300 nM
    1. Rozcieńczyć 6 μM roztworu podstawowego EGF-biotyny w BSA-GEL-PBS, użyć objętości 100-200 μl na mikrochip. Zużyć w ciągu kilku godzin.
  9. Przygotowanie roztworu do etykietowania 10 nM STR-QD
    1. Odwirować roztwór podstawowy streptawidyny-QD przez 4 minuty przy 8 000 x g, pobrać supernatant i rozcieńczyć w BB w stosunku 1:10. Można stosować różne typy karbów, na przykład QD655 lub QD800. Rozcieńczyć do końcowego stężenia w BSA-GEL-PBS, użyć 75-100 μl na mikrochip. Zużyć w ciągu kilku godzin.

2. Przygotowanie mikrochipów z membrany z azotku krzemu

  1. Wyczyść szkiełko mikroskopowe, używane do mikroskopii świetlnej, za pomocą tkanki do pomieszczeń czystych i etanolu klasy HPLC o wysokiej wydajności chromatografii cieczowej (HPLC).
  2. Na stole warsztatowym z laminarnym przepływem powietrza o niskim poziomie zapylenia otwórz szalkę Petriego o średnicy 100 mm i połóż oczyszczone szkło mikroskopu w naczyniu; pozostaw naczynie otwarte.
  3. Za pomocą czystej pęsety, najlepiej pokrytej włóknem węglowym lub inną powłoką, wyjmij 4-10 mikroczipów z cienkimi (50 nm) membranami z azotku krzemu, jeden po drugim, z pudełka do przechowywania i na szklane szkiełko. Chwyć delikatnie mikroczipy po bokach i unikaj dotykania delikatnej górnej strony, składającej się z cienkiej membrany z azotku krzemu. Zachowaj szczególną ostrożność, aby zawsze trzymać membranę stroną do góry i jej nie dotykać.
    Uwaga: Mikroczipy powinny być prostokątne i mieć płaskie krawędzie prostopadłe do powierzchni pokrytej azotkiem krzemu, tak aby można je było łatwo chwycić.
  4. Zamknij pokrywę szalki Petriego i umieść ją pod wyciągiem. Weź nową chusteczkę higieniczną do pomieszczeń czystych i umieść ją obok szalki Petriego. Przygotować dwie czyste szklane zlewki o pojemności 200 ml, napełniając jedną z nich 50-70 ml acetonu, a drugą podobną objętością etanolu, obie klasy HPLC. Przenieś mikroczipy ze szkiełka podstawowego na tkankę w pomieszczeniu czystym.
  5. Z tkanki przenieś mikroczipy jeden po drugim do pierwszej zlewki z acetonem w celu usunięcia ochronnej warstwy rezystancyjnej. Odczekaj 2 minuty, delikatnie przesuwając zlewkę kilka razy, aby upewnić się, że mikroczipy są dobrze wypłukane.
  6. Przenieść mikroczipy bezpośrednio do zlewki z etanolem, nie dopuszczając do ich wyschnięcia. Poczekaj 2 min. Następnie przenieś zlewkę na stół warsztatowy z laminarnym przepływem powietrza. Zaopatrz się w nową chusteczkę higieniczną do pomieszczeń czystych.
  7. Przenieś wiórki na chusteczkę i pozostaw do wyschnięcia na kilka minut. Przenieś mikroczipy na szklane szkiełko na szalce Petriego, zamknij naczynie i przynieś je do myjki plazmowej.
  8. Umieść szkiełko podstawowe z mikroczipami w urządzeniu do czyszczenia plazmowego. Uruchom 5-minutowy program czyszczenia, aby powierzchnia membrany z azotku krzemu stała się hydrofilowa.
    Uwaga: Odpowiednie ustawienia stosowane w naszym odkurzaczu plazmowym to: 70 mTorr, przepływ gazu 11,5 sccm dla O2 i 35,0 sccm dla Ar, 50 W docelowej częstotliwości radiowej (RF), 50 W zakres RF i max.
  9. Włóż szklane szkiełko z mikroczipem z powrotem do szalki Petriego i zamknij jej pokrywę. Zadbaj o to, aby od teraz mikroczipy były sterylne.
  10. Zbadaj obszary okien mikroczipów pod mikroskopem świetlnym pod kątem ewentualnych pęknięć membrany lub pozostałych cząstek brudu.
  11. Przynieś szalkę Petriego do stołu warsztatowego z laminarnym przepływem powietrza.
  12. Umieść następujące elementy na stole warsztatowym laminarnego przepływu powietrza: probówki/butelki zawierające wysterylizowany 0,01% roztwór poli-L-lizyny (PLL, mol. wt 150 000–300 000, sterylnie przefiltrowane i przetestowane na hodowli komórkowych), woda klasy HPLC, Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą, DMEM bez surowicy, nową tkankę do pomieszczenia czystego, sterylną płytkę 24-dołkową (można również użyć płytki 12-dołkowej), sterylna płytka 96-dołkowa, sterylne końcówki do pipet, pipeta i płaska, zaokrąglona końcówka, pęseta.
  13. Weź 24-dołkową płytkę i napełnij jedną studzienkę PLL, a dwie studzienki wodą klasy HPLC, użyj ok. objętość 1 ml na studzienkę. Wziąć 96-dołkową płytkę i napełnić dla każdego mikroczipa dwie studzienki DMEM uzupełnionym surowicą i jedną studzienkę DMEM bez surowicy, użyć ok. objętość 200 μl na studzienkę.
  14. Od teraz do obsługi mikroczipów używaj pęsety ze sterylnymi końcówkami. Osiągnij to, na przykład, poprzez krótkie podpalenie, a następnie schłodzenie końcówek pęsety.
  15. Najpierw przenieś mikroczipy ze szkiełka na chusteczkę do pomieszczenia czystego.
    Z tkanki przenieś do sześciu mikroczipów do studzienki wypełnionej PLL, inkubuj mikroczipy przez 5 minut.
    Uwaga: W przypadku eksperymentu z większą liczbą mikroczipów, napełnij dodatkowe dołki w 24-dołkowej płytce.
  16. Następnie opłucz mikroczipy, umieszczając je, jeden po drugim, w pierwszej studzience wypełnionej wodą, a stamtąd w drugiej studzience wypełnionej wodą. Nie pozostawiaj mikroczipów w wodzie dłużej niż około minuty, aby uniknąć usunięcia PLL.
  17. Na koniec umieść je pojedynczo w dołkach wypełnionych DMEM na 96-dołkowej płytce. Przechowywać 96-dołkową płytkę w inkubatorze CO2 do czasu przygotowania zawiesiny komórek.

3. Przygotowanie komórek na mikroczipach

  1. Wykonać subkulturę komórek COS7 w celu przygotowania zawiesiny komórkowej o stężeniu ok. 5 × 105 komórek/ml. Upewnij się, że komórki są monorozproszone.
  2. Weź 96-dołkową płytkę z mikroczipami i dodaj jedną kroplę zawiesiny komórek do każdego mikroczipa. Odczekaj 5 min.
  3. Zacznij badać obszary okien mikroczipów za pomocą odwróconego mikroskopu, aby wybrać odpowiedni moment na przeniesienie go do nowej studzienki za pomocą DMEM bez surowicy.
    Uwaga: Dobrą gęstość komórek uzyskuje się przy około jednej komórce na obszar 2 500μm2, co odpowiada 24 komórkom COS7 w oknie o wymiarach 150 x 400 μm. Większe zagęszczenie komórek może utrudnić maksymalne spłaszczenie komórek. Należy pamiętać, że po tym, jak komórka osiądzie na membranie SIN, potrzebuje 3-5 minut, aby rozwinąć wystarczającą przyczepność, aby oprzeć się unoszeniu podczas przenoszenia do nowej studzienki.
  4. Przenieś mikroczip do następnej studzienki, gdy wystarczająca ilość komórek przylgnie do okna. Trzymaj mikroczipy zawsze z komórkami skierowanymi do góry i unikaj dotykania tej strony.
  5. Po przeniesieniu należy ponownie sprawdzić każde okienko z mikroczipem. Jeśli zbyt wiele komórek zostało zmytych, a liczba pozostałych komórek jest niewystarczająca, należy ponownie roztoczyć zawiesinę komórek (aby rozbić nowo powstałe grudki komórek) i powtórzyć kroki 3.1-3.5.
  6. Gdy wszystkie przeniesione mikroczipy mają wystarczającą ilość przylegających komórek na swoich obszarach okien, przenieś wióry do ostatniego dołka za pomocą DMEM bez surowicy. Umieść 96-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze CO2 i pozwól komórkom zregenerować się i spłaszczyć przez kilka godzin, najlepiej O/N.

4. Znakowanie EGFR, fiksacja i mikroskopia fluorescencyjna

  1. Do kolejnych kroków użyj płytki 96-dołkowej i 24-dołkowej. Wstępnie napełnij studzienki odpowiednimi roztworami i użyj jednego rzędu lub kolumny na mikrochip. Płytka 24-dołkowa jest używana pod wyciągiem do etapów mocowania z CB, PFA i GA. Zawsze przenoś mikroczipy komórkami skierowanymi do góry i unikaj dotykania tej strony.
  2. Wypłukać mikroczipy, umieszczając je w studzience ze świeżym BSA-GEL-PBS, a następnie umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut.
  3. Inkubować w roztworze biotyny EGF o stężeniu 300 nM przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Ponieważ komórki rozpoczną endocytozę EGFR znakowanych EGF, przejdź tak szybko, jak to możliwe, do kroku 4.4.
  4. Spłucz 3 razy PBS i 1 raz CB (teraz 96-dołkowa płytka jest ponownie w RT).
  5. Inkubować w 3% PFA przez 10 min.
  6. Opłucz frytki 1 raz za pomocą CB i 3 razy za pomocą PBS.
  7. Inkubować w GLY-PBS przez 2 minuty, spłukać 2 razy 1 raz PBS.
  8. Inkubować w 10 nM STR-QD przez 10 minut.
  9. Spłucz 4 razy za pomocą BSA-PBS.
  10. Zanurz mikroczip w naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm wstępnie napełnionym BSA-PBS w RT.
  11. Pozyskiwanie obrazów różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) i obrazów fluorescencyjnych komórek znakowanych QD.
    1. Użyj obiektywu pneumatycznego 40X, aby uzyskać obrazy poglądowe komórek oznaczonych QD655. Użyj obiektywu immersyjnego z olejkiem (na przykład 63X), aby umożliwić najbardziej efektywne zbieranie emitowanego światła fluorescencyjnego; Jest to szczególnie potrzebne podczas obrazowania komórek oznaczonych QD800.
    2. Użyj kostki filtrującej, która wystawia QD na działanie światła wzbudzającego fluorescencji w zakresie od 340 do 380 nm i umożliwia zbieranie emitowanego światła powyżej 420 nm odpowiedniego dla większości QD (w tym przypadku sześcian filtra A).
    3. Zminimalizuj natężenie światła, aby uniknąć zbyt intensywnego światła, które mogłoby uszkodzić próbkę. Ustaw czas ekspozycji na co najmniej 300 ms, aby przechwytywane były sygnały wszystkich QD, zwracając uwagę, że fluorescencja QD ma migotanie.
    4. Dostosuj natężenie światła i wzmocnienie, aby zapewnić jasne obrazy bez widocznych szumów obrazu, jednocześnie minimalizując natężenie światła.
      Uwaga: Alternatywnie można użyć krótszego czasu naświetlania, jeśli serie zdjęć są wykonane z tego samego regionu. Serie te mogą być przetwarzane w celu uzyskania maksymalnego obrazu projekcyjnego, co prowadzi do uśredniania, a tym samym redukcji szumów wynikowego obrazu.
  12. Umieść zobrazowany mikroczip z powrotem (komórki skierowane do góry) w studzience 96-dołkowej płytki wypełnionej BSA-PBS.
  13. Opłucz mikroczipy 1 razy w CB.
  14. Inkubować w 2% GA przez 10 minut.
  15. Spłukać 1 raz w CB i 3 razy BSA-PBS.
  16. Przechowuj mikroczipy do czasu zobrazowania ESEM w wstępnie napełnionych dołkach BSA-PBS na nowej 96-dołkowej płytce. Na każdy mikroczip należy napełnić rząd czterech studzienek wodą klasy HPLC.
    Uwaga: Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni, jednak najlepsze wyniki osiąga się, gdy cała seria obrazowania jest wykonywana w ciągu dwóch dni. Odstępy kolejki będą powoli odłączać się od próbki, dlatego nie zaleca się czekania dłużej niż 10 dni przed wykonaniem obrazowania ESEM.
    Uwaga: Obrazy fluorescencyjne są przechowywane do przyszłej analizy. Pozycje komórek na obrazach można łatwo skorelować z obrazami z mikroskopii elektronowej poprzez lokalizację narożników okna SiN i pomiar pozycji względem rogów.
    Uwaga: Zaleca się drukowanie wysokiej jakości obrazów fluorescencyjnych i używanie ich do celów orientacyjnych podczas rejestrowania obrazów ESEM.

5. Mokry ESEM-STEM całych komórek

  1. Przygotowanie ESEM do mokrego STEM
    1. Zamontuj gazowy detektor elektronów wtórnych (GSED) i stopień Peltiera, zawierający detektor STEM (umieszczony pod próbką).
    2. Uruchom przepływ wody chłodzącej przez stolik i ustaw temperaturę na 3 °C.
    3. Ustaw współrzędne x-y stolika na zero i dostosuj odległość roboczą do około 6 mm.
  2. Podczas obrazowania ESEM należy przechowywać 96-dołkową płytkę z mikroczipami w chłodnym miejscu, na przykład na zamrożonych elementach chłodzących, w styropianowym pudełku.
  3. W celu załadowania próbki do wstępnie schłodzonego stolika ESEM-STEM, należy wyjąć 96-dołkową płytkę z pojemnika chłodzącego i umieścić ją w pobliżu otwartego stolika ESEM. Połóż obok niego nową chusteczkę do pomieszczeń czystych.
  4. Szybko wypłucz mikroczip (komórkami skierowanymi do góry), zanurzając go cztery razy, za każdym razem na około sekundę, w studzience wypełnionej wodą klasy HPLC.
  5. Zetrzyj na krótko tylną stronę mikroczipa na chusteczce w pomieszczeniu czystym i umieść mikroczip w wstępnie schłodzonym scenie. Upewnij się, że komórki pozostają mokre, można to rozpoznać po powierzchni odblaskowej (suszenie powoduje matową powierzchnię).
  6. Zwilżyć powierzchnię próbki 3 μl schłodzonej wody klasy HPLC (uważać, aby nie dotknąć powierzchni końcówką pipety) i utrwalić próbkę na stoliku.
  7. Umieścić trzy dodatkowe 3 μl kropelek wody na stoliku w pobliżu próbki.
  8. Zamknąć komorę na próbkę
  9. Oczyść komorę próbki, zmieniając ciśnienie pięć razy w zakresie od 800 do 1,500 Pa. Zakończ cykl z ciśnieniem 800 Pa.
  10. Włączyć wiązkę elektronów (30 kV) i zbadać próbkę w najmniejszym powiększeniu za pomocą obu detektorów, tj. GSED i detektora STEM, aby wyszukać lokalizację okienka mikroprocesora.
    Uwaga: Jeśli warstwa wody jest zbyt gruba, okno może nie być widoczne. W takim przypadku zacznij obniżać ciśnienie do 760 Pa i odczekaj kilka minut. Okno staje się najpierw widoczne z GSED.
  11. Umieść okienko membrany SiN na środku obrazu, przesuwając stolik na próbkę i zmniejsz ciśnienie do 750-720 Pa.
    Uwaga: Gdy warstwa wody jest wystarczająco cienka, okno staje się również widoczne za pomocą detektora STEM.
  12. Od teraz używaj segmentu ciemnego pola detektora STEM do rejestrowania obrazów. Najpierw uzyskaj jeden lub dwa obrazy przedstawiające wszystkie komórki w całym obszarze okna.
  13. Porównaj te obrazy ESEM z obrazami z mikroskopii świetlnej, zlokalizuj rogi okna SiN.
  14. Skoreluj układy współrzędnych obu modalności mikroskopii, porównując powiększenie, obrót i możliwe odbicie lustrzane. Zlokalizuj te same komórki na obu obrazach.
  15. Wybierz bardzo małe cząsteczki brudu lub obszar komórki z małymi funkcjami, aby dostosować ustawienia obrazowania, takie jak wysokość eucentryczności, precyzyjna ostrość i korekcja stygmatyzmu soczewki. Pracuj w powiększeniu co najmniej 50 000X, użyj prądu sondy elektronowej około 0,6 nA, czasu przebywania piksela 30 μs i rozmiaru obrazu 1024 x 884 pikseli.
    Uwaga: Można również użyć innych ustawień, o ile unika się zwiększania dawki elektronów.
    Uwaga: Nawet podczas bardzo czystej pracy, powierzchnie wiórów w praktyce zawsze będą zawierać cząstki brudu, ponieważ protokół nie jest wykonywany w środowisku pomieszczenia czystego.
  16. Aby zarejestrować obrazy STEM z komórek oznaczonych QD, zapoznaj się z obrazami fluorescencyjnymi i wybierz komórkę, która Cię interesuje.
    Uwaga: Najlepiej zacząć od komórki wykazującej silne sygnały QD.
  17. Nagraj obraz przeglądowy STEM tej komórki.
  18. Przejdź do obszaru peryferyjnego, w którym widoczna jest granica komórki, i powiększ obraz, aby osiągnąć powiększenie 50 000X.
  19. Nagrywaj obrazy przedstawiające poszczególne głębokości kolejki, używaj czasów przebywania pikseli 20-30 μs. Aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, należy sfotografować każdy obszar tylko raz w dużym powiększeniu.
    Uwaga: Zazwyczaj na tym etapie zarówno skupienie, jak i korekcja stygmatyzmu wymagają drobnej korekty.
  20. Po zarejestrowaniu wystarczającej liczby obrazów w dużym powiększeniu, pomniejsz i uzyskaj kolejny obraz przeglądowy STEM, przedstawiający właśnie zarejestrowane obszary w dużym powiększeniu jako ciemne prostokąty.
    Uwaga: Te obrazy poglądowe posłużą później do skorelowania obrazów ESEM i fluorescencyjnych oraz do określenia dokładnej lokalizacji obrazów o dużym powiększeniu w kontekście komórkowym.
  21. Przejdź do następnej interesującej Cię komórki, zacznij od obrazu przeglądowego, nagraj serię obrazów w dużym powiększeniu, a zakończ obrazem przeglądowym.
  22. Pod koniec sesji obrazowania ESEM zwiększ ciśnienie do 850-900 Pa przed rozpoczęciem wentylacji komory.
    Uwaga: Ten wzrost ciśnienia zwiększa szansę na odzyskanie mikroczipa przy nadal zwilżonej powierzchni; Jednak nie zawsze da się to osiągnąć. Próbka, która nigdy nie została wysuszona, może zostać odtworzona w BSA-PBS i, w razie potrzeby, ponownie zbadana w ESEM w późniejszym czasie.

Wyniki

Rysunek 1 oraz 2 przedstawiają reprezentatywne obrazy związanych z błoną komórkową receptorów EGFR znakowanych QD655, wizualizowane w nienaruszonych, w pełni uwodnionych komórkach COS-7. Obraz DIC na Rysunku 1 a daje wyobrażenie o topografii błony komórkowej komórek, a odpowiadający mu obraz fluorescencji na Rysunku 1b przedstawia rozkład EGFR po 3 min inkubacji z EGF-Biotyną. Rysunek 1A oraz B zostały odpowiednio złożone z dwóch obrazów zarejestrowanych za pomocą obiektywu powietrznego 40X. Aktywowany EGF receptor EGFR jest rozłożony na całej powierzchni komórki. W większości komórek można zaobserwować lekkie nasilenie fluorescencji (Rysunek 1B) na krawędziach komórek, co wskazuje na lokalnie zwiększone występowanie EGFR20. Eksperymenty kontrolne przeprowadzone zgodnie z podobnym protokołem potwierdziły specyficzność znakowania EGFR (dane nie pokazano). Kontrole te obejmowały: 1) znakowanie kontrolne bez uprzedniej inkubacji komórek z EGF-biotyną, t.j. inkubację wyłącznie z STR-QDs, oraz 2) inkubację z niebiotynilowanym EGF i STR-QDs.

Trzy komórki zaznaczone prostokątami zostały poddane dalszej analizie za pomocą ESEM-STEM. Obrazy ESEM-STEM przedstawione na Rysunku 1C-E ukazują przegląd tych komórek przy niskim powiększeniu. Obrazy transmisyjne te odzwierciedlają całe komórki w stanie uwodnionym, z cienką warstwą wody znajdującą się nad komórką umieszczoną na krzemowym mikrochipie z oknem obserwacyjnym z azotku krzemu (SiN). Komora próżniowa w mikroskopie zawierała parę wodną, a równowaga między temperaturą a ciśnieniem próbki została dostosowana tak, aby utrzymać cienką warstwę cieczy nad komórkami. Poszczególne komórki można łatwo rozpoznać ze względu na ich kształt i położenie na oknie membrany SiN. Obrazy ESEM-STEM przy niskim powiększeniu ujawniają drobne struktury, takie jak filopodia, rozciągające się od krawędzi komórki w stronę sąsiednich komórek, oraz niektóre struktury w cieńszych obszarach komórki. Grube centralne obszary komórkowe, w tym jądro, wydają się białe, ponieważ transmisja przez próbkę nie jest możliwa dla elektronów o zastosowanej energii (30 keV).

Obrazy ESEM-STEM o wysokiej rozdzielczości zarejestrowano w cieńszych, obwodowych obszarach. Rozdzielczość przestrzenna ESEM-STEM dla nanocząsteczek w cienkich obszarach komórek w cienkiej warstwie cieczy została określona w poprzednim badaniu6 na 3 nm. Cztery obrazy o wysokiej rozdzielczości pokazane na Rysunku 2A-D zarejestrowano w miejscach zaznaczonych małymi prostokątami na Rysunku 1C-E. Zastosowane powiększenie było wystarczające, aby rozróżnić pojedyncze kropki kwantowe (QD), które występują jako jasne, pociskowate pręty, z których każdy jest związany z pojedynczym EGFR. QD655 ma typowe wymiary 6 x 14 nm2.

Rysunek 2A (odpowiadający obszarowi prostokątnemu zaznaczonemu na komórce na Rysunku 1C) przedstawia znaczniki QD na fałdzie błony przecinającym obraz po przekątnej. Ta struktura błony charakteryzuje się wyższą gęstością EGFR niż otaczające regiony błony. W kilku miejscach dwa znaczniki znajdowały się w bliskiej odległości. Dwa przykłady z odległościami 20 i 24 nm zostały wskazane grotami strzałek. Pary znaczników tych interpretuje się jako należące do dimerów EGFR. Rysunek 2B przedstawia przykład z krawędzi komórki (Rysunek 1D, prostokąt po lewej stronie), gdzie również widoczne są monomery i dimery EGFR. Rysunek 2C (Rysunek 1C, prostokąt po prawej stronie) został zarejestrowany w regionie o słabszym sygnale fluorescencji, t.j. niższej gęstości EGFR. Niemniej jednak, EGFR znaleziono tutaj również w formie dimerów. Dodatkowo obecne były dwa klastry składające się z 10 lub 11 cząsteczek EGFR (patrz elipsy). Rysunek 2D pokazuje kolejny przykład fałdu błony (Rysunek 1E) z mniejszymi klastrami obejmującymi 5-6 cząsteczek EGFR, poza kilkoma monomerami i dimerami.

Jako przykład rodzaju informacji, jakie można uzyskać z tych danych, dla wszystkich pozycji znaczników przedstawionych na Rysunku 2 wyznaczono funkcję korelacji par21 g(x). Należy zauważyć, że analiza ta nie jest częścią niniejszego protokołu, a procedura została opisana w innym opracowaniu6,7. g(x) jest miarą prawdopodobieństwa znalezienia cząsteczki w określonej odległości radialnej x od cząsteczki referencyjnej. Wartość g(x) = 1 reprezentuje rozkład losowy, a większa wartość świadczy o tworzeniu się klastrów. Pozycje łącznie 210 znaczników zostały automatycznie wykryte na czterech obrazach z Rysunku 2A-D, a g(x) obliczono przy rozmiarze kosza (bin size) 5 nm i filtrze wygładzającym o szerokości pasma 10 nm. Krzywa g(x) (Rysunek 3) wykazuje preferowaną odległość środka do środka QD wynoszącą 25 nm. EGFR nie są zatem zorientowane losowo, lecz znaczna ich część znajduje się w tej preferowanej odległości. Na podstawie przybliżonego modelu molekularnego6 (wstawka na Rysunku 3) szacujemy, że odległość środka do środka między QD a kieszenią wiążącą EGF wynosi ~14 nm, a odległość środka do środka między dwoma QD przyłączonymi do dimeru EGFR wynosi ~27 nm (wartość ta prawdopodobnie różni się o kilka nanometrów ze względu na elastyczność łącznika). Preferowana odległość znaczników jest zatem zgodna z oczekiwaną odległością znaczników dla dimeru EGFR w granicach precyzji metody. Krzywa g(x) przyjmuje wartości większe od jedności dla odległości do 300 nm, co wskazuje na obecność klastrów, zgodnie z danymi. Analiza ta pokazuje, że stechiometria EGFR może być badana za pomocą naszej metody.

Rysunek 4 przedstawia wynik podobny do Rysunku 2, z tą różnicą, że znakowanie przeprowadzono przy użyciu EGF-QD800, a do wykonania obrazu fluorescencyjnego użyto obiektywu imersyjnego 63X. Dane te potwierdzają, że typowe wyniki są uzyskiwane również wtedy, gdy znakowanie EGFR odbywa się za pomocą QD emitujących w bliskiej czerwieni. Rysunek 4A przedstawia obraz fluorescencyjny reprezentatywnej komórki, Rysunek 4B pokazuje tę samą komórkę w trybie przeglądowym ESEM-STEM, a Rysunek 4C jest obrazem przy powiększeniu 150,000 x, zarejestrowanym na górnej krawędzi błony komórkowej (patrz prostokąt na Rysunku 4B). Podobnie jak na Rysunku 2A i D, obrazy ukazują oznakowane QD receptory EGFR na fałdzie błony oraz prezentują receptory w formie monomerów, dimerów i klastrów. Należy zauważyć, że elektronowo gęsty rdzeń QD wydaje się nieco mniejszy i bardziej okrągły niż rdzenie QD emitujących przy 655 nm, co jest zgodne z ich mniejszym rozmiarem rdzenia22 wynoszącym ~5 nm.

Obrazowanie komórek, mikroskopia fluorescencyjna, lokalizacja subkomórkowa, czerwone barwienie, analiza przy dużym powiększeniu.
Rycina 1. Korelacyjna mikroskopia DIC, fluorescencyjna oraz ESEM-STEM EGFR znakowanego EGF-QD655 w w pełni nawodnionych komórkach COS-7. (A) Obraz DIC komórek hodowanych na obszarze okna membrany SiN, dający wyobrażenie topograficzne błony plazmatycznej. (B) Obraz fluorescencyjny pokazujący komórki na centralnie położonym oknie membrany SiN (zaznaczonym przerywanym prostokątem). (C-E) Trzy obrazy ESEM-STEM przy małym powiększeniu komórek zaznaczonych prostokątami na zdjęciach A i B. Te obrazy przeglądowe komórek służą do określenia dokładnej lokalizacji następnie rejestrowanych obrazów o wysokiej rozdzielczości. Lokalizacje czterech obrazów o wysokiej rozdzielczości (pokazane na Rycinie 2A-D) są zaznaczone białymi prostokątami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza nanocząsteczek; obrazy z mikroskopu elektronowego; skala 500 nm; badanie naukowe.
Rycina 2. Wysokorozdzielcze obrazy ESEM-STEM przedstawiające związane z błoną receptory EGFR. (A) Mikrograf przy powiększeniu 75 000X obszaru zaznaczonego na Rycini 1B. Widocznych jest wiele monomerów. Kilka dimerów wskazano grotami strzałek. (B) oraz (C) obrazy uzyskane przy powiększeniu 50 000X odpowiednio lewego i prawego obszaru błony zaznaczonego na Rycini 1C. Obrysowano klastry EGFR. (D) obraz zarejestrowany przy powiększeniu 50 000X w miejscu zaznaczonym na Rycini 1D. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres równowagi statycznej z odległością molekularną; schemat; analiza spektroskopowa nanostruktur.
Rycina 3. Funkcja korelacji par g(x) jako funkcja odległości radialnej x wyznaczona dla odległości międzycząsteczkowych wszystkich 210 znaczników wykrytych na Ryc. 2A-D. Pik przy 25 nm wskazuje, że odległość między środkami QD występuje z znacznie większym prawdopodobieństwem niż w przypadku rozkładu losowego, gdzie g(x) = 1 oznacza prawdopodobieństwo losowe. Linia przerywana stanowi pomoc wizualną reprezentującą g(x) dla rozkładu losowego. Wstawka przedstawia przybliżony model molekularny dimeru EGFR z przyłączonym EGF oraz kropkami kwantowymi (QD) pokrytymi streptawidyną, przyłączonymi za pomocą biotyny. Modele streptawidyny, EGF i EGFR uzyskano z modeli CPK struktur 1stp (streptawidyna), 1EGF (EGF), 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO i 2GS6 (EGFR) z bazy danych RCSB Protein Protein Databank, utworzone za pomocą programu Jmol wersja 12.2.15. Model biotyny jest zgodny z rysunkiem w RCSB Ligand Explorer wersja 1.0. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej struktur komórkowych; c) analiza wzoru dyfrakcji elektronów.
Rycina 4. Przykładowa komórka COS-7 znakowana EGF-QD800 i obrazowana za pomocą korelacyjnej fluorescencji oraz ESEM-STEM. (A) Obraz fluorescencyjny, (B) obraz ESEM-STEM w niskim powiększeniu (przeglądowy). (C) Obraz o wysokiej rozdzielczości zarejestrowany w miejscu zaznaczonym prostokątem na obrazie B przy powiększeniu 150 000X. Wykryto monomerowe, dimerowe oraz zgrupowane EGFR, podobnie jak w przypadku znakowania EGF-QD655. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Badanie rozmieszczenia przestrzennego i stechiometrii białek błonowych, takich jak EGFR, w całych komórkach dostarcza ważnych informacji kontekstowych na temat jego funkcji i możliwych zmian11-14. Trudno jest badać rozkład monomerów, dimerów i klastrów bezpośrednio na poziomie subkomórkowym przy użyciu powszechnie stosowanych metod biochemicznych, w przypadku których traci się informacje o lokalizacji białka w komórce lub różnicach między komórkami15. Opisane tu metody znakowania i mikroskopii pozwalają na wizualizację kompleksów białkowych w skali długości kilku nanometrów, dzięki czemu jego stechiometria może być badana w kontekście pojedynczych, nienaruszonych komórek4-7. Nie jest to możliwe w przypadku mikroskopii świetlnej (super rozdzielczość)23 , ponieważ jej rozdzielczość jest niewystarczająca do rozróżnienia cząsteczek zaangażowanych w kompleks białkowy. Rezonansowy transfer energii Förstera (FRET) jest techniką uśredniania zespołowego24 i niekoniecznie wykrywa dimery i klastry wyższego rzędu w wyniku krótkiego zasięgu transferu energii25. Testy ligacji zbliżeniowej26 w rzeczywistości nie mierzą odległości, a zatem nie są w stanie odróżnić regionu komórkowego o dużej gęstości białka, co nieuchronnie prowadzi do pewnej liczby wykrytych przypadkowych bliskości, od regionu komórkowego o podobnej gęstości białka, ale zawierającego kompleksy białkowe wykazujące wyraźne odległości między znacznikami. Wymaganą wysoką rozdzielczość do wizualizacji składników kompleksów białkowych uzyskuje się za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Jednak konwencjonalny TEM całych komórek jest ograniczony przez wymóg cienkich próbek/skrawków przecinających błonę plazmatyczną27 lub rozdzierania lub odrywania błony plazmatycznej28,29 , co skutkuje losowo uformowanymi małymi kawałkami błony. Błona plazmatyczna nie jest zatem obrazowana jako całość, co prowadzi do braku potencjalnie kluczowych informacji o kontekście komórkowym.

Inne wyzwania eksperymentalne związane z badaniem stechiometrii białek w komórkach wynikają z zastosowanego znakowania białek. Powszechnie stosowane znakowanie immunologiczne wiąże się z trudnością polegającą na tym, że stechiometria jeden do jednego między receptorem a znacznikiem może być osiągnięta tylko za pomocą sondy monowalentnej; Nie dzieje się tak, gdy wymagane są przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe. Aby uzyskać informacje na temat stechiometrii białek, wymagane jest, aby sonda wiązała się jednoznacznie z jednym epitopem na receptorze i miała jedno miejsce wiązania dla sondy fluorescencyjnej lub nanocząstki o wysokiej liczbie atomowej po drugiej stronie. Po drugie, precyzja osiągalna przy znakowaniu przeciwciał jest ograniczona ze względu na ich duży rozmiarod 30 do 30 nm, tak że rozróżnienie między sąsiednimi pojedynczymi białkami, homodimerami lub większymi klastrami nie jest wykonalne, przynajmniej nie w przypadku receptorów z rodziny EGFR. W literaturze znane są znacznie mniejsze specyficzne etykiety, które można zastosować nawet do znakowania wewnątrzkomórkowego31 , ale nie są one powszechnie stosowane. Długość całej etykiety (EGF-biotyna-streptawidyna-QD) ma podobny wymiar jak EGFR i jest wystarczająco mała, aby można było wykryć dimer. Co więcej, opisana dwuetapowa procedura znakowania pozwala uniknąć grupowania receptorów indukowanego znakowaniem.

Nasza metoda nie jest bardzo trudna, niewiele więcej niż mikroskopia fluorescencyjna znakowanych białek. Eksperyment należy jednak przeprowadzić z dużą ostrożnością, ponieważ liczba kroków się sumuje, a błąd w jednym z kroków może doprowadzić do całkowitego niepowodzenia eksperymentu. Obsługa mikroczipów nie jest bardziej żmudna niż obsługa siatek TEM, ale zaleca się pewne trenowanie pustych chipów. ESEM-STEM całych uwodnionych komórek jest prawdopodobnie najtrudniejszym aspektem i wymaga co najmniej wykwalifikowanego operatora i kilku dni praktyki, aby osiągnąć rozdzielczość około 3 nm, która jest potrzebna do wizualizacji QD. Uszkodzenie radiacyjne badanej próbki stanowi ryzyko. Należy uważnie obserwować ciśnienie i temperaturę, aby utrzymać warstwę wody. Co więcej, grubość warstwy wody może się różnić w zależności od komórki. Zaleca się monitorowanie obecności warstwy wody za pomocą detektora elektronów gazowych umieszczonego nad próbką, jak opisano w innym miejscu6. Obszary komórkowe powinny być obrazowane tylko raz lub dwa razy, aby uniknąć uszkodzeń.

Kluczowym ograniczeniem metody jest brak informacji o ultrastrukturze w wysokiej rozdzielczości. Inne techniki, na przykład kriogeniczny TEM, są potrzebne do badania struktury białka i ultrastruktury komórkowej15. Po drugie, badanie dynamicznego oddziaływania wielokrotności białek w żywej komórce w mikroskopie poklatkowym nie jest możliwe ze względu na uszkodzenia popromienne i wymaga najnowocześniejszej mikroskopii świetlnej23. Obecnie nasza metoda nie jest w stanie określić bezwzględnego poziomu dimerów, ponieważ skuteczność etykietowania jest nieznana, ale spodziewamy się dodać takie dane w przyszłości. Niemniej jednak można stwierdzić, czy dimery są obecne, czy nie. Z literatury wiadomo, że nawet skuteczność znakowania na poziomie około 15% wystarcza do wykrycia dimerów o wystarczającej istotności statystycznej32.

Łatwo możliwe jest badanie innych receptorów związanych z błoną za pomocą ich liganda, za pomocą biotynylowanych fragmentów Fab specyficznych przeciwciał lub za pośrednictwem innych małych łączników7 przy użyciu opisanego dwuetapowego protokołu znakowania. Ponieważ wykazaliśmy już, że można użyć dwóch różnych kolorów (rozmiarów) karbów, a znakowanie nanocząstek złota było stosowane we wcześniejszych pracach6, wydaje się wykonalne znakowanie wielu gatunków białek w tym samym eksperymencie. Kluczowym wyzwaniem dla badań stechiometrii wielu gatunków białek jest zapewnienie podobnej skuteczności znakowania dla obu gatunków lub przynajmniej normalizacja uzyskanej względnej stechiometrii na odpowiednich skuteczności znakowania. Jednak wydaje się, że dwie różne głębokości czasu zastosowane w tym badaniu nie różnią się zbytnio pod względem skuteczności etykietowania (patrz rysunki 2 i 4). Opisana metoda obejmująca dwuetapowe znakowanie za pomocą QD oraz korelacyjną mikroskopię fluorescencyjną i ESEM-STEM stanowi realną metodę badania złożonych interakcji białek błonowych w nienaruszonych błonach plazmatycznych całych komórek.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy E. Arztowi za wsparcie za pośrednictwem INM, M. Kochowi za pomoc w ESEM i DENS Solutions za dostarczenie mikroczipów. Badania częściowo wspierane przez Konkurs Leibniza 2013.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyLeicaAF6000 + DMI6000B
ESEMFEI FirmaQuanta 400 FEG
DMEM (1x) + GlutaMax + glukoza + pirogronianGibco31966-021
DPBS (1x) - Chlorek wapnia - Chlorek magnezuGibco14190-144
Surowica bydlęca płodu, Performance Plus (FBS)Gibco16000-036
CellstripperMediatech, Inc.25-056 Cl
Woda, chromasolv Plus do HPLCSigma-Aldrich34877-2.5L
PBS Roti-Stock 10x PBSCarl Roth1058.1
Etanol, Rotisolv HPLC klasaCarl RothP076.2
Frakcja albuminy V, bez biotyny (BSA)Carl RothO163.2
Żelatyna, ze skóry ryb zimnowodnychSigma-AldrichG7041-500G
GlicynaCarl RothT873.1
Sondy molekularnenaskórkowego czynnika wzrostuE3477Koniugat biotyny-XX (biotyna EGF)
Dekahydrat teraboranu soduSigma-AldrichS9640-500G
Kwas borowySigma-AldrichB6768-500G
Qdot 655 sprzężony streptawidynySondy molekularne
Sondy molekularnesprzężone streptawidyny Qdot 800Q10173MP
mikroprocesory krzemowe z membranami z azotku krzemu o grubości 50 nm i wymiarach 50 &mikro; m x 0,40 mmDENS SolutionsWykonane
Q10121MP na zamówienie

Bibliografia

  1. Dukes, M. J., Peckys, D. B., de Jonge, N. Correlative fluorescence microscopy and scanning transmission electron microscopy of quantum-dot-labeled proteins in whole cells in liquid. ACS Nano. 4, 4110-4116 (2010).
  2. Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. J. Struct. Biol. 169, 438-449 (2010).
  3. Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microsc. Microanal. 20, 469-483 (2014).
  4. Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
  5. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 189-198 (2014).
  6. Peckys, D. B., Baudoin, J. P., Eder, M., Werner, U., de Jonge, N. Epidermal growth factor receptor subunit locations determined in hydrated cells with environmental scanning electron microscopy. Sci. Rep. 3, 2621-2626 (2013).
  7. Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence- and liquid electron microscopy. Science Advances. under revision, (2015).
  8. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Meth. 2, 743-749 (2005).
  9. Herbst, R. S. Review of epidermal growth factor receptor biology. Int. J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59, S21-S26 (2004).
  10. Normanno, N., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366, 2-16 (2006).
  11. Hofman, E. G., et al. EGF induces coalescence of different lipid rafts. J. Cell Sci. 121, 2519-2528 (2008).
  12. Irwin, M. E., Mueller, K. L., Bohin, N., Ge, Y., Boerner, J. L. Lipid raft localization of EGFR alters the response of cancer cells to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib. J. Cell Physiol. 226, 2316-2328 (2011).
  13. Lillemeier, B. F., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 18992-18997 (2006).
  14. Mayawala, K., Vlachos, D. G., Edwards, J. S. Heterogeneities in EGF receptor density at the cell surface can lead to concave up scatchard plot of EGF binding. FEBS Lett. 579, 3043-3047 (2005).
  15. Valley, C. C., Lidke, K. A., Lidke, D. S. The spatiotemporal organization of ErbB receptors: insights from microscopy. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6, (2014).
  16. Peckys, D. B., Bandmann, V., de Jonge, N. Correlative fluorescence- and scanning transmission electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid. Meth. Cell Biol. 124, 305-322 (2014).
  17. Peckys, D. B., Dukes, M. J., de Jonge, N. Correlative fluorescence and electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid. Methods Mol. Biol. 1117, 527-540 (2014).
  18. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
  19. Bogner, A., Thollet, G., Basset, D., Jouneau, P. H., Gauthier, C. Wet STEM: A new development in environmental SEM for imaging nano-objects included in a liquid phase. Ultramicroscopy. 104, 290-301 (2005).
  20. Chung, I., Akita, R., Vandlen, R., Toomre, D., Schlessinger, J., Mellman, I. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464, 783-787 (2010).
  21. Stoyan, D., Stoyan, H. Estimating pair correlation functions of planar cluster processes. Biom. J. 38, 259-271 (1996).
  22. Gao, J., et al. In vivo tumor-targeted fluorescence imaging using near-infrared non-cadmium quantum dots. Bioconjug. Chem. 21, 604-609 (2010).
  23. Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat. Meth. 6, 21-23 (2009).
  24. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem. Sci. 32, 407-414 (2007).
  25. Warren, C. M., Landgraf, R. Signaling through ERBB receptors: Multiple layers of diversity and control. Cell. Signal. 18, 923-933 (2006).
  26. Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Mol. Cell. Proteomics. 12, 1563-1571 (2013).
  27. Hoenger, A., McIntosh, J. R. Probing the macromolecular organization of cells by electron tomography. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 89-96 (2009).
  28. Zhang, J., Leiderman, K., Pfeiffer, J. R., Wilson, B. S., Oliver, J. M., Steinberg, S. L. Characterizing the topography of membrane receptors and signaling molecules from spatial patterns obtained using nanometer-scale electron-dense probes and electron microscopy. Micron. 37, 14-34 (2006).
  29. Pinto da Silva, P., Kan, F. W. Label-fracture: a method for high resolution labeling of cell surfaces. J. Cell Biol. 99, 1156-1161 (1984).
  30. Bergersen, L. H., Storm-Mathisen, J., Gundersen, V. Immunogold quantification of amino acids and proteins in complex subcellular compartments. Nat. Protoc. 3, 144-152 (2008).
  31. Orlov, I., et al. Live cell immunogold labelling of RNA polymerase. II. Sci. Rep. 5, 8324(2015).
  32. Fiala, G. J., Kaschek, D., Blumenthal, B., Reth, M., Timmer, J., Schamel, W. W. Pre-clustering of the B cell antigen receptor demonstrated by mathematically extended electron microscopy. Front. Immunol. 4, 427(2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mikroskopia fluorescencyjnarodowiskowa skaningowa mikroskopia elektronowaskaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowaznakowanie kropkami kwantowymistechiometria EGFRkom rki COS7rozk ad receptor w b onowychobrazowanie pojedynczych cz steczek

Powiązane artykuły