Celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić automatyczną ekstrakcję DNA z referencyjnych linii komórkowych z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie (FFPE) oraz cyfrową analizę PCR kropelkowego (ddPCR) w celu wykrycia rzadkich mutacji w warunkach klinicznych. Wykrywanie mutacji w próbkach FFPE pokazuje kliniczną przydatność ddPCR w próbkach FFPE.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
ddPCR to bardzo czuła metoda PCR, która wykorzystuje system emulsji wodno-olejowej. Za pomocą generatora kropelek wyekstrahowana próbka kwasu nukleinowego jest dzielona na ~ 20 000 nanorozmiarowych kropelek wody w oleju, a amplifikacja PCR następuje w pojedynczych kropelkach. Podejście ddPCR polega na identyfikacji mutacji sekwencji, zmianach liczby kopii i wybranych rearanżacjach strukturalnych obejmujących docelowe geny. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie ddPCR jako potężnej techniki precyzyjnego ilościowego oznaczania rzadkich mutacji BRAF V600E w standardowych liniach komórkowych FFPE, co jest pomocne w identyfikacji osób z rakiem. Podsumowując, technika ddPCR oferuje potencjał do precyzyjnego profilowania specyficznych rzadkich mutacji w różnych genach w różnych typach próbek FFPE.
Wprowadzenie
Nagromadzenie mutacji genetycznych w kluczowych genach regulatorowych zmienia normalne programowanie komórek, takie jak proliferacja, różnicowanie i przeżywanie komórek, prowadząc do raka1. Szlak kinazy RAS-RAF-MAP pośredniczy w odpowiedziach komórkowych na sygnały wzrostu. Onkogenne mutacje BRAF mogą wynikać z mutacji sterujących w genie BRAF, które mogą powodować nadaktywność onkoproteiny BRAF2. Mutacje w genie BRAF powodują również nadaktywną sygnalizację za pośrednictwem MEK i ERK3, co z kolei prowadzi do nadmiernego wzrostu i proliferacji komórek niezależnie od regulacji za pośrednictwem czynnika wzrostu4-6.
Dostępnych jest kilka narzędzi do profilowania mutacji DNA, takich jak ilościowe mutacje BRAF V600E w czasie rzeczywistym w standardowych liniach komórkowych opartych na formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) za pomocą ddPCR. ddPCR to metoda bezwzględnej kwantyfikacji oparta na PCR, oferująca wyższą dokładność w porównaniu do konwencjonalnego ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)7,8. ddPCR zapewnia również wyższą zdolność rozdzielczą i dokładność wykrywania rzadkich mutacji w matrycach DNA, umożliwiając bardziej pouczające badania i diagnozowanie nowotworów9. Dodatkowe zalety ddPCR w porównaniu z konwencjonalnym qPCR obejmują jego zwiększoną czułość i dokładność podczas badania niskiej liczby kopii matryc10-12. W niniejszym artykule przedstawiono protokół automatycznej ekstrakcji DNA ze standardowych linii komórkowych odniesienia FFPE, a następnie określania obecności lub braku mutacji BRAF V600E za pomocą ddPCR. Opisano również wykorzystanie oprogramowania do analizy danych oraz graficzne przedstawienie wyników. Cała procedura jest stosunkowo prosta i całkowicie zależy od liczby próbek do profilowania oraz liczby dostępnych konwencjonalnych maszyn do PCR i ddPCR.
Poniższy protokół opisuje standardowe procedury dla standardowych linii komórkowych BRAF V600E-dodatnich FFPE (HD598, HD593, HD617, HD273 i typu dzikiego (WT)) są wykonywane w pełni zautomatyzowanym urządzeniu przy użyciu protokołu Tissue Preparation System (TPS). Następnie wyizolowane próbki DNA są analizowane pod kątem obecności mutacji BRAF V600E za pomocą systemu ddPCR. Celowana analiza mutacji jest wykonywana po profilowaniu wszystkich próbek i załadowaniu danych do oprogramowania do analizy danych. W zależności od liczby badanych próbek/grup, analiza danych może trwać od jednej do kilku godzin. Eksperymentalny komponent metodologii wymaga dokładności w obsłudze DNA i
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Ekstrakcja DNA z referencyjnych linii komórkowych FFPE
Uwaga: Dla tej procedury, ekstrakcja DNA została przeprowadzona z referencyjnych standardowych linii komórkowych FFPE (HD598, HD593, HD617, HD273 i typu dzikiego (WT)) przy użyciu zestawu do izolacji FFPE Tissue DNA, jak opisano w poniższym protokole. Zautomatyzowana ekstrakcja DNA została osiągnięta dzięki postępowaniu zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi całkowitej izolacji DNA.
- Używając mikrotomu i oryginalnego bloku FFPE, ręcznie przygotuj świeże skrawki przed ekstrakcją i analizą DNA, zgodnie z ustalonymi procedurami. Należy upewnić się, że próbka wejściowa dla analizowanego odcinka lub odcinków tkanki nie przekracza łącznej całkowitej grubości 10 μm oraz aby powierzchnia nie przekraczała 600mm2 dla pojedynczego przekroju.
1.2 Protokół TPS
Uwaga: Objętości podane w Tabeli 1 odpowiadają minimalnemu wymaganemu do przetworzenia 48 próbek, a przedstawiona procedura jest zgodna z wytycznymi TPS. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy umieścić próbki FFPE w e-tubie przez odwirowanie przy 600 x g, aby uniknąć utraty próbek podczas automatycznego programu.
- Włącz automatyczny instrument do izolacji DNA i komputer. Otwórz oprogramowanie sterujące uruchamianiem i włóż tacę z automatycznym ładowaniem do obszaru załadunku pokładu TPS.
- Dozować odczynniki do odpowiednich koryt, jak pokazano na rysunku 1.
- Umieść 4 próbki (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% i 1%) w stojakach na próbki.
- Umieść pojemniki na końcówki w korytach w kolumnach 2 i 3 i sprawdź, czy w końcówkach nie ma więcej niż jednego filtra na końcówkę, co spowoduje przerwanie biegu.
- Zapewnić prawidłowe wymieszanie buforu do lizy i buforu do płukania, odwracając je 3–5 razy i załadować do odpowiednich koryt w kolumnie 4 ( Rysunek 1).
- Po kilkukrotnym odwróceniu lub łagodnym wirowaniu załaduj bufor elucyjny, kulki magnetyczne i bufor FFPE do małych rynien w kolumnie 5, pozostawiając 1 szczelinę pustą w miejscu wskazanym (Rysunek 1, Tabela 1).
- Załadować płytkę o głębokości 2 ml (DWP) na nośnik płytki (Rysunek 1).
- Przed rozpoczęciem przebiegu wykonaj następujące końcowe kroki:
- Odkręć wszystkie probówki i koryta z odczynnikami. Upewnij się, że w butelce na odpady płynne dostępna jest wystarczająca pojemność. Upewnij się, że butelka na odpady stałe jest pusta i wyłożona torbą na zagrożenie biologiczne. Upewnij się, że płyta wyrzutnika końcówki jest wyśrodkowana w zespole odpływowym.
- Zamknij przednią pokrywę.
- Uruchom oprogramowanie. Otwórz plik NA_Prep_Main_MLSTARlet.med.
- Kliknij "Start". Stan urządzenia zmieni się z bezczynnego na uruchomiony.
- Wprowadź liczbę próbek dla tego przebiegu. Wybierz żądaną metodę dla tego przebiegu (DNA = 0). Wprowadź pozycję pierwszej końcówki o dużej głośności, wybierając "1", jeśli wszystkie tace są pełne. Wprowadź pozycję pierwszej końcówki o standardowej objętości, wybierając "1", jeśli wszystkie tace są pełne.
Uwaga: Urządzenie będzie wtedy działać przez zautomatyzowane kroki bez interwencji użytkownika. Szczegółowy przepływ pracy przedstawiono na rysunku 2. Po zakończeniu eksperymentu odpady odczynników i końcówki są wstrzykiwane do zespołu odpadów. - Ilościowe określenie oczyszczonego genomowego DNA przy użyciu metody fluorometrycznej.
Uwaga: Próbki DNA, które zawierają minimalne stężenie 3,3 ng/μl, poddaje się analizie ddPCR (sekcja 2).
2. Profilowanie mutacji DNA: Protokół ddPCR
Uwaga: Protokół profilowania mutacji DNA składa się z 3 głównych kroków:1) Wytwarzanie kropel, 2) konwencjonalna amplifikacja PCR, 3) odczyt kropelek i 4) profilowanie mutacji DNA.
2.1. Generowanie kropel
Uwaga: ddPCR supermix jest zalecany do ddPCR, ponieważ ta mieszanka zawiera odczynniki niezbędne do generowania kropel.
- Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy przestrzegać standardowych środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek, używanie czystego kaptura do PCR, czystych pipet i probówek o niskiej zawartości białka.
- Upewnij się, że minimalne stężenie próbki ludzkiego genomowego DNA wynosi 3,3 ng/μl. Uwaga: Stężenie próbki oczyszczonego DNA będzie się różnić w zależności od analizy wykrywania % częstotliwości mutacji.
- Zebrać mieszaniny reakcyjne na 96-dołkowych płytkach PCR. Rozmrozić i zrównoważyć składniki reakcji z RT. Przygotować reakcje PCR, łącząc 2X ddPCR supermix (10 μl) i 20 starterów (do przodu i do tyłu, 900 nM) i sondę (250 nM) z każdą oczyszczoną próbką DNA (66 ng/2 μl) uzupełnić do 20 μl wodą destylowaną (zgodnie z protokołem generatora kropel)
- Dokładnie wymieszaj mieszankę, aby zapewnić jednorodność i krótko odwiruj, aby zebrać zawartość na dnie probówki przed dozowaniem. Załaduj 20 μl na wkład w celu utworzenia kropel.
- Działanie generatora kropel, zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta
- Włóż wkład do uchwytu z wycięciem we wkładzie umieszczonym w lewym górnym rogu uchwytu. Dodać 20 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej próbki do środka i 70 μl oleju generatorowego do studzienek dennych.
- Przymocuj uszczelkę w poprzek górnej części wkładu. Upewnij się, że uszczelka jest bezpiecznie zaczepiona na obu końcach uchwytu; W przeciwnym razie nie zostanie osiągnięte ciśnienie wystarczające do wytworzenia kropel.
- Otwórz generator kropel, naciskając zielony przycisk na górze przyrządu i włóż wkład. Gdy uchwyt znajduje się we właściwej pozycji, zarówno kontrolka zasilania (po lewej, po prawej), jak i uchwytu (po środku) świecą na zielono.
- Ponownie naciśnij górny przycisk na instrumencie, aby zamknąć drzwi i zainicjować wytwarzanie kropel. Uwaga: Po naciśnięciu przycisku kolektor ustawia się nad studzienkami wylotowymi, zasysając olej i próbki przez kanały mikroprzepływowe, w których powstają kropelki. Kropelki wpływają do studni kropelkowej, gdzie się gromadzą. Kontrolka kropli (po prawej) na zielono po 10 sekundach, wskazując, że trwa wytwarzanie kropli.
- Po zakończeniu generowania kropel wszystkie 3 kontrolki zmienią kolor na ciągły zielony; otwórz drzwi, naciskając przycisk i wyjmij uchwyt z urządzenia. Wyjmij jednorazową uszczelkę z uchwytu i wyrzuć ją. Uwaga: Górne studzienki wkładu zawierają kropelki, a środkowa i dolna studzienka są prawie puste, z niewielką ilością resztek oleju.
2.2. Przygotowanie do PCR
- Dla każdej próbki odpipetować 40 μl zawartości kropel z górnej studzienki wkładów do pojedynczego dołka zalecanej 96-dołkowej płytki PCR, jak wskazano w protokole przyrządów producenta. Uwaga: Użycie pipety wielokanałowej jest idealne do przenoszenia emulsji kropelkowych. Zaleca się powolne i delikatne zasysanie kropel, aby zminimalizować ścinanie kropel podczas przenoszenia.
- Natychmiast po przeniesieniu kropel należy uszczelnić płytkę do PCR folią, aby uniknąć parowania. Używaj przebijalnych uszczelek z płytek foliowych, które są kompatybilne ze zgrzewarką do płytek PCR i igłami w czytniku kropelkowym. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi zgrzewarki do płytek PCR.
- Ustaw temperaturę zgrzewarki do płyt na 180 °C, a czas na 5 sekund.
- Dotknij strzałki, aby otworzyć drzwiczki tacy. Umieść blok nośny na tacy stroną z 96 dołkami skierowaną do góry. Umieść 96-dołkową płytkę na bloku nośnym i upewnij się, że wszystkie dołki płytkowe są wyrównane z blokiem nośnym.
- Przykryj płytkę 96-dołkową 1 arkuszem przebijalnej uszczelki foliowej. Po zamocowaniu płytki 96-dołkowej na bloku nośnym i przykryciu przebijalną uszczelką foliową, dotknij przycisku uszczelki. Taca zamknie się i rozpocznie się zgrzewanie.
- Po zakończeniu zgrzewania drzwi otwierają się automatycznie; wyjmij płytkę z bloku grzewczego w celu cyklicznych cykli termicznych, a następnie wyjmij blok grzewczy.
- Upewnij się, że wszystkie dołki w płycie są uszczelnione, sprawdzając, czy wgłębienia w folii są łatwo widoczne nad każdym dołkiem. Po uszczelnieniu płytka jest gotowa do cykli termicznych.
- Po usunięciu kropelek naciśnij zatrzaski na uchwycie wkładu, aby go otworzyć. Wyjmij pusty wkład i wyrzuć go.
- Przeprowadzić konwencjonalną amplifikację PCR, postępując zgodnie z parametrami wyszczególnionymi w Tabeli 2.
2.3 Odczyt kropel (zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta)
Uwaga: Po amplifikacji PCR docelowego kwasu nukleinowego w kropelkach, czytnik kropelek analizuje każdą kroplę indywidualnie za pomocą dwukolorowego systemu detekcji13. Zazwyczaj ustawiamy się na wykrywanie fluoroforów reporterowych FAM i VIC.
- Kliknij "System spłukiwania", aby zalać czytnik kropel i przygotować go do analizy ddPCR.
- Załaduj płytkę do czytnika kropel i kliknij "start". Czytnik kropel zasysa każdą próbkę, izoluje kropelki i przesyła je strumieniowo w jednym pliku przez detektor 2-kolorowy. Detektor odczytuje kropelki w celu zliczenia próbek dodatnich i ujemnych.
- Po zakończeniu odczytu kropel otwórz drzwi i wyjmij uchwyt płytki z urządzenia. Wyjąć 96-dołkową płytkę do PCR z uchwytu i wyrzucić ją.
- W celu prawidłowej konserwacji wymień olej w czytniku kropel i w razie potrzeby opróżnij pojemnik na odpady. Dodaj 50 ml 10% wybielacza do butelki na odpady, aby zapobiec rozwojowi drobnoustrojów.
2.4 Profilowanie mutacji DNA (zgodnie z zalecanym przez producenta protokołem)
Uwaga: Kropelki PCR-dodatnie i PCR-ujemne są liczone w celu zapewnienia bezwzględnej kwantyfikacji docelowych mutacji DNA BRAF V600E w formie cyfrowej, przy użyciu oprogramowania do analizy danych.
- Kliknij przycisk Konfiguracja, aby wprowadzić informacje o próbkach, testach i eksperymentach.
- W oknie Ustawienia załaduj tabliczkę (nazwa_pliku.qlp), a następnie kliknij przycisk Analizuj, aby otworzyć i przeanalizować dane. Interfejs analizy danych jest podzielony na trzy okna: Tabela wyników, Selektor studni i Przetworzone dane/Wyświetlacz graficzny.
- W oknie Dane przetworzone dane dotyczące stężeń dla każdego celu pojawiają się w studzienkach na mapie płytowej i są zestawione w tabeli wyników. Kliknij przycisk Koncentracja, aby wyświetlić dane na wykresach stężeń.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W naszej analizie ddPCR zbadaliśmy linie komórkowe standardów referencyjnych FFPE z mutacją BRAF V600E. Czytnik kropelek jest podłączony do laptopa z zainstalowanym oprogramowaniem do analizy danych. Każda pojedyncza kropelka jest definiowana na podstawie amplitudy fluorescencji jako dodatnia lub ujemna. Oprogramowanie dostarczone przez producenta pozwala również na wprowadzenie zdefiniowanego przez użytkownika punktu odcięcia w celu określenia progu między kropelkami dodatnimi a ujemnymi. Liczbę kropelek dodatn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu podkreślamy możliwość zastosowania ddPCR i izolacji DNA z referencyjnych próbek wzorcowej linii komórkowej FFPE do oceny specyficznej mutacji genowej. W tym badaniu zastosowano metodę automatycznej izolacji DNA TPS, którą można łatwo dostosować, zautomatyzować i może pomieścić do 48 różnych próbek jednocześnie, co pozwala na eksperymenty na większą skalę i mniejszą zmienność. Jednym z ograniczeń izolacji DNA w niniejszej pracy jest to, że każda próbka FFPE jest unikalna i będzie się różnić pod względem zani...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim i Young Deug Kim są pracownikami ABION CRO.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Program Badawczo-Rozwojowy dla Society of the National Research Foundation (NRF), finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (Grant nr 2013M3C8A1075908).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Instrument Hamilton MICROLAB STARlet IVD | Siemens | 10701001 | Automatyczny instrument do izolacji DNA |
| Generator kropel QX200 | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Czytnik kropel | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Konwencjonalna maszyna do PCR z regulacją | 621BR17718 | ||
| Zgrzewarka do płytek PCR PX1 | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| Oprogramowanie QuantaSoft | Bio-Rad | ||
| VERSANT Odczynniki do preparatyki tkanek Pudełko 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Odczynniki do przygotowania tkanek Pudełko 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE Końcówki | Siemens | ||
| ddPCR analiza | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | o stężeniu 2X |
| Bio-Rad | BR186-4008 | ||
| Generator kropelek | oleju Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Uszczelka | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Czytnik kropelek | oleju Bio-Rad | Zobacz materiał BR-186-3004 |
Bibliografia
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943(2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
