Method Article

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/53197

⸱

October 10th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Human Genetics and Cognitive Functions, Institut Pasteur, 2CNRS URA 2182 'Genes, synapses and cognition', Institut Pasteur, 3Human Genetics and Cognitive Functions, Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Plateforme d' Imagerie Dynamique, Imagopole, CiTech, Institut Pasteur, 5Neuroplasticity and Therapeutics, CECS, I-STEM, AFM, Evry

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolce dendrytyczne to małe wypukłości, które odpowiadają postsynaptycznym przedziałom synaps pobudzających w ośrodkowym układzie nerwowym. Są rozmieszczone wzdłuż dendrytów. Ich morfologia jest w dużej mierze zależna od aktywności neuronalnej i są dynamiczne. Kolce dendrytyczne wyrażają receptory glutaminergiczne (receptory AMPA i NMDA) na swojej powierzchni i na poziomach gęstości postsynaptycznych. Każdy kręgosłup pozwala neuronowi niezależnie kontrolować swój stan i lokalną aktywność. Morfologie kręgosłupa zostały szeroko zbadane w glutaminergicznych komórkach piramidowych kory mózgowej, wykorzystując zarówno podejścia in vivo, jak i hodowle neuronów uzyskane z tkanek gryzoni. Stany neuropatologiczne mogą być związane ze zmienioną indukcją i dojrzewaniem kręgosłupa, jak wykazano w neuronach hodowanych przez gryzonie i jednowymiarowej analizie ilościowej 1. W niniejszym badaniu opisano protokół analizy ilościowej 3D morfologii kręgosłupa przy użyciu ludzkich neuronów korowych pochodzących z nerwowych komórek macierzystych (późnych progenitorów korowych). Komórki te początkowo uzyskano z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Protokół ten pozwala na analizę morfologii kręgosłupa w różnych okresach hodowli oraz na możliwe porównanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych uzyskanych od osób kontrolnych z tymi uzyskanymi od pacjentów z chorobami psychicznymi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendrytyczne kolce korowych neuronów piramidowych to małe i cienkie wypukłości, które są rozmieszczone wzdłuż podstawowych i wierzchołkowych dendrytów tych podtypów neuronalnych w mózgu gryzoni, naczelnych i ludzkich. Są one miejscami większości synaps pobudzających i pełnią kluczowe funkcje w procesach uczenia się i poznawczych. Szczegółowe struktury ludzkich kolców dendrytycznych zostały technicznie zbadane za pomocą mikroskopii elektronowej 2. Takie podejście jest jednak czasochłonne i wiąże się z dużym nakładem pracy. Niedawno doniesiono o trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji morfologii kolców dendrytycznych w ludzkiej korze mózgowej przy użyciu specjalneg....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla neuronów

Uwaga: Przeprogramowanie fibroblastów w pluripotencjalnych komórkach macierzystych, przywiązanie do linii grzbietowej kresomózgowia, pochodzenie, amplifikacja i bankowanie późnych progenitorów korowych (LCP) zostały opisane w Boissart et al4. Różnicowanie neuronalne komórek podobnych do LCP przeprowadzono również według Boissarta iwsp.4 z niewielkimi modyfikacjami. Opracowano inne procedury bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, a następnie ich różnicowanie w neurony. Protokół ten został zachowany, ponieważ pozwala na selektyw....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie opisuje ustandaryzowany protokół do kwantyfikacji kręgosłupa hodowanych dendrytów neuronów piramidowych pochodzących z iPSC. Protokół ten pozwala na analizę dojrzewania kręgosłupa na neuronach ludzkich i jego ewentualne porównanie z dojrzewaniem kolców w standardowych kulturach neuronalnych gryzoni, a także w modelach zwierzęcych in vivo.

Rysunek 1A przedstawia schemat różnych etapów kultury, które pozwalają na produkcję korowych neuronów piramidowyc.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantyfikacja cech morfologicznych neuronów piramidowych opierała się na oprogramowaniu. Interfejs Filament Tracer został wykorzystany do segmentacji neuronów i kolców, a moduł XT do ich analizy.

Aby przeanalizować dokładność naszej techniki, najpierw porównaliśmy zmierzone parametry morfologiczne (długość, obszar i całkowita objętość kręgosłupa, jeśli dotyczy) z tymi opublikowanymi przy użyciu dojrzałych neuronów piramidowych szczurów w hodowli 6, 7 i ludzkich tkankach mózgowych

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Instytut Pasteura, fundację Bettencourt-Schueller, Centre National de la Recherche Scientifique, Uniwersytet Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), Fundacja Charytatywna Conny-Maeva, Fundacja Cognacq Jay, Fundacja Orange i Fundacja Fondamental. L.G. jest wspierany przez stypendium licencjackie Ministerstwa Zdrowia. Dziękujemy za pomoc BitPlane, w szczególności Georgia Golfis, na wczesnym etapie tej pracy.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
D-PBS (1x), bez wapnia, magnezu i fenolu CzerwonyGibco/ Life Technologies14190169
Roztwór poli-L-ornityny BioodczynnikSigma AldrichP4957
Mysia lamina laminaDutscher Dominique354232
Suplement N2Gibco/ Life Technologies17502048
Suplement B-27 bez witaminy A (50x)Gibco/ Life Technologies12587010
DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-IGibco/ Life Technologies31331028
Neurobasal Med SFMGibco/ Life Technologies21103049
2-merkaptoetanolGibco/ Life Technologies31350-010
Penicylina-steptomycynaGibco/ Life Technologies15140-122
GFP Przeciwciało poliklonalne w surowicy królikaGibco/ Life TechnologiesA-6455
Serum dla koniGibco/ Life Technologies16050130
Alexa Fluor 488 Koza Anty-Królik Gibco/ Life TechnologiesA11034
Poliklonalne przeciwciało anty-beta-III tubulinyMilliporeAB9354
Szkło osłonowe 13 mmVWR631-0150
Prolong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPIGibco/ Life TechnologiesP36931
Tween(R) 20 Bioextra, lepka cieczSigma Aldrich ChimieP7949
Triton X-100Sigma Aldrich ChimieX100-100ML
Ludzkie fibroblastyRepozytorium biologiczne linii komórkowej CoriellGM 4603 i GM 1869Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyZeiss (Niemcy)LSM 700
Imaris SoftwareBitplane AG, Zurychwersja 6.4.0Niezbędne są moduły Filament Tracer i Imaris XT
Oprogramowanie HuygensOprogramowanie Huygens, SVI, HolandiaWersja ProOpcjonalna (do testowania dekonwolucji)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
  2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dendritic Spine QuantificationHuman Induced Pluripotent Stem CellsConfocal Microscopy Imaging3D Spine AnalysisNeural Stem Cell DifferentiationGFP Lentivirus TransductionAnti GFP Antibody StainingDendritic Spine MorphologyGlutamatergic Neuron CultureSpine Density Measurement

Related Articles