Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kolce dendrytyczne to małe wypukłości, które odpowiadają postsynaptycznym przedziałom synaps pobudzających w ośrodkowym układzie nerwowym. Są rozmieszczone wzdłuż dendrytów. Ich morfologia jest w dużej mierze zależna od aktywności neuronalnej i są dynamiczne. Kolce dendrytyczne wyrażają receptory glutaminergiczne (receptory AMPA i NMDA) na swojej powierzchni i na poziomach gęstości postsynaptycznych. Każdy kręgosłup pozwala neuronowi niezależnie kontrolować swój stan i lokalną aktywność. Morfologie kręgosłupa zostały szeroko zbadane w glutaminergicznych komórkach piramidowych kory mózgowej, wykorzystując zarówno podejścia in vivo, jak i hodowle neuronów uzyskane z tkanek gryzoni. Stany neuropatologiczne mogą być związane ze zmienioną indukcją i dojrzewaniem kręgosłupa, jak wykazano w neuronach hodowanych przez gryzonie i jednowymiarowej analizie ilościowej 1. W niniejszym badaniu opisano protokół analizy ilościowej 3D morfologii kręgosłupa przy użyciu ludzkich neuronów korowych pochodzących z nerwowych komórek macierzystych (późnych progenitorów korowych). Komórki te początkowo uzyskano z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Protokół ten pozwala na analizę morfologii kręgosłupa w różnych okresach hodowli oraz na możliwe porównanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych uzyskanych od osób kontrolnych z tymi uzyskanymi od pacjentów z chorobami psychicznymi.
Wprowadzenie
Dendrytyczne kolce korowych neuronów piramidowych to małe i cienkie wypukłości, które są rozmieszczone wzdłuż podstawowych i wierzchołkowych dendrytów tych podtypów neuronalnych w mózgu gryzoni, naczelnych i ludzkich. Są one miejscami większości synaps pobudzających i pełnią kluczowe funkcje w procesach uczenia się i poznawczych. Szczegółowe struktury ludzkich kolców dendrytycznych zostały technicznie zbadane za pomocą mikroskopii elektronowej 2. Takie podejście jest jednak czasochłonne i wiąże się z dużym nakładem pracy. Niedawno doniesiono o trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji morfologii kolców dendrytycznych w ludzkiej korze mózgowej przy użyciu specjalnego oprogramowania połączonego z dużą ręczną analizą kręgosłupa3.
Technologia zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) w połączeniu z immunofluorescencją stanowi dokładne narzędzie do identyfikacji kręgosłupa i pomiaru jego kształtu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Takie podejście można łatwo zastosować do hodowanych neuronów. Nie przedstawiono jednak danych dotyczących analizy dojrzewania i morfologii kręgosłupa na ludzkich neuronach pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC).
Celem tego badania było opisanie protokołu, który umożliwia obrazowanie kolców dendrytycznych z hodowanych ludzkich neuronów in vitro. W niniejszym protokole wykorzystano znakowanie GFP, mikroskopię konfokalną i analizę 3D za pomocą modułu Filament Tracer oprogramowania Imaris. Pokrótce opisano tu również etapy hodowli, które są niezbędne do uzyskania korowych neuronów glutaminergicznych warstw od II do IV z nerwowych komórek macierzystych (NSC). Cały protokół produkcji NSC u ludzi został już opublikowany w innym miejscu 4.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla neuronów
Uwaga: Przeprogramowanie fibroblastów w pluripotencjalnych komórkach macierzystych, przywiązanie do linii grzbietowej kresomózgowia, pochodzenie, amplifikacja i bankowanie późnych progenitorów korowych (LCP) zostały opisane w Boissart et al4. Różnicowanie neuronalne komórek podobnych do LCP przeprowadzono również według Boissarta iwsp.4 z niewielkimi modyfikacjami. Opracowano inne procedury bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, a następnie ich różnicowanie w neurony. Protokół ten został zachowany, ponieważ pozwala na selektywną produkcję piramidowych neuronów glutaminergicznych.
- Potraktuj 6-dołkowe płytki hodowlane szklanymi szkiełkami nakrywkowymi poliornityną (rozcieńczoną do 1/6 w DPBS, stężenie podstawowe 0,01%) O/N, a następnie trzykrotnie przepłucz w DPBS. Następnie dodać lamininę (stężenie podstawowe 1 mg/ml, rozcieńczoną 500 razy w DPBS) przez co najmniej 10 godzin pod okapem przepływowym.
- Płytkę i wysłać NSC o niskiej gęstości (50 000 komórek/cm2) na 6-dołkowych płytkach hodowlanych ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi w 3 ml pożywki składającej się z DMEM/F12 (500 ml), 2 fiolek (po 5 ml każda) suplementu N2, 2 fiolek (po 10 ml każda) suplementu B27, 10 ml Pen-Streptomycyny (penicylina = 10 000 jednostek/ml i streptomycyna = 10 000 jednostek/ml), 1 ml 2-merkaptoetanolu (roztwór podstawowy: 50 mM) i lamininy (1/500), bez czynników wzrostu. KROK KRYTYCZNY: Wykonaj ten krok ostrożnie, dodając komórki powolnymi ruchami obrotowymi, aby zmniejszyć grupowanie komórek.
- Usuń pożywkę hodowlaną. Dodać świeżą pożywkę N2B27 zawierającą 2 μg/ml świeżego roztworu lamininy, aby utrzymać neuron przyczepiony do szklanych szkiełek nakrywkowych i uniknąć zbrylania. Zmieniaj podłoże co 3 dni. Zachowaj część pozostałej pożywki (200 μl) przed dodaniem świeżej pożywki, aby zapobiec wysuszeniu komórki. Alternatywnie postępuj szybko i zmień całkowitą objętość (3 ml).
2. Transdukcja lentiwirusowa
Uwaga: Wektory lentiwirusowe GFP zostały uprzejmie dostarczone przez Dr. Uwe Maskos Laboratory w Instytucie Pasteura (Paryż) i przygotowane zgodnie z opublikowanym protokołem 5. Ekspresja GFP jest napędzana przez promotor mysiej kinazy fosfoglicerynianowej (PGK). W tym badaniu miano wirusa wynosiło 400 ng/μl (roztwór podstawowy w PBS 1x).
- Przeprowadzić transdukcję ludzkich neuronów pochodzących z iPSC na dowolnym etapie dojrzewania przez cząstki wirusa, dodając 1 μl roztworu podstawowego zawierającego 40 ng wektora lentiwirusowego GFP na basenik hodowlany (płytki 6-dołkowe) i inkubować przez 48 godzin w świeżej pożywce hodowlanej. Uwaga: W przypadku tego protokołu czas trwania inkubacji pozwala na dobre oznakowanie struktur kręgosłupa.
3. Immunofluorescencja
Uwaga: W celu poprawy znakowania całej morfologii kręgosłupa, przeprowadzono znakowanie immunofluorescencyjne przy użyciu przeciwciała anty-GFP w warunkach przepuszczalnych.
- Usunąć pożywkę hodowlaną i utrwalić transdukowane komórki na szkiełkach nakrywkowych w 4% paraformaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 3 razy w 1x PBS (10 minut każdy).
- Zanurz szkiełka nakrywkowe w PBS uzupełnionym 0,05% Tritonem (100x) i 10% końskim surowicą przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie umyj 3 razy w 1x PBS.
- Dodać 100 μl 1x PBS uzupełnionego 4% surowicą końską i pierwszorzędowym przeciwciałem (1/1,000) podniesionym przeciwko GFP i rozcieńczonym przez współczynnik 1,000 na każdym szkiełku nakrywkowym. Inkubować w ciemnym pudełku O/N w temperaturze 4°C, a następnie przemyć 3 razy 1x PBS.
- Rozcieńczyć przeciwciało sprzężone z Alexa Fluor 488 (1/200) w PBS uzupełnionym 0,5% Tween 20 i inkubować przez 1 godzinę w RT. Następnie umyć 3 razy w 1x PBS i zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach z podłożem montażowym do mikroskopii fluorescencyjnej.
4. Obrazowanie dendrytycznego kręgosłupa
- Wykonaj obrazowanie konfokalne za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego laserowego.
- Wybierz zdrowe neurony o morfologii piramidalnej i pełnej arboryzacji dendrytycznej i określ ilościowo co najmniej 10 neuronów na stan z oddzielnych eksperymentów. Określić ilościowo 60 - 100 μm na dendryt.
- Uzyskuj obrazy za pomocą obiektywu 40X oil NA = 1,3 i linii laserowej 488 nm do wzbudzenia GFP, z typową mocą szczytową na poziomie próbki około 20 μW. Ustaw rozmiar piksela około 80 nm, aby prawidłowo próbkować kolce dendrytyczne.
Uwaga: Dalsza analiza wymaga obrazu, w którym szum nie zagraża prawidłowej segmentacji dendrytów i kolców. Dzięki wspomnianym powyżej ustawieniom próbkowania przestrzennego i mocy zaobserwowaliśmy, że czas przebywania pikseli wynoszący 3,15 μs jest wystarczający do zebrania wystarczającej liczby fotonów do zbudowania takiego obrazu. W przypadku przyciemnionych próbek jakość obrazu można poprawić, uzyskując średnio od 2 do 4 skanów. Może być konieczne nabycie kilku płytek XY, aby pokryć obszar zainteresowania, które następnie muszą zostać zszyte przed obróbką. - Aby pobrać próbkę całej objętości neuronu, należy uzyskać stos Z o odstępach Z od 150 nm do 300 nm, co daje od 20 do 30 warstw Z.
Uwaga: Poprzeczna rozdzielczość przestrzenna uzyskana przy tych ustawieniach wynosi 234 nm, a rozdzielczość osiowa 591 nm. Wybrane tutaj próbkowanie jest odpowiednie, ale ponieważ rozdzielczość osiowa jest większa niż najmniejszy rozmiar kolców, które mają być zobrazowane, analiza faworyzuje kolce, które rozciągają się bocznie od dendrytów.
5. 3D Kwantyfikacja kolców dendrytycznych
Uwaga: Poniższe sekcje szczegółowo opisują użycie oprogramowania Imaris do analizy. Istnieją alternatywne implementacje, w tym NeuronStudio15 lub Metamorph8, które mogą zapewnić podobne wyniki.
Użyj następujących ustawień:
- Jako etap przetwarzania wstępnego należy użyć filtrowania Gaussa przez możliwości przetwarzania obrazu oferowane przez oprogramowanie. Filtrowanie gaussowskie można wykonać za pomocą filtra Gaussa Przetwarzanie obrazu > Wygładzanie > Filtr gaussowski. Ustaw szerokość filtra tak, aby była równa rozmiarowi piksela w XY.
- Wykonaj półautomatyczne śledzenie dendrytów za pomocą modułu Filament Tracer oprogramowania.
- Najpierw oszacuj średnicę dendrytu za pomocą narzędzia do pomiaru odległości w zakładce Slice w oprogramowaniu.
- W zakładce Surpass kliknij narzędzie Filamenty. Aby zapewnić lepszą niezawodność, protokół ten opiera się na półautomatycznym śledzeniu; Kliknij Pomiń automatyczne tworzenie. W interfejsie modułu wyświetlana jest teraz zakładka Rysuj. Tutaj wybierz AutoPath jako metodę, Dendrite jako typ i wprowadź szacowaną średnicę dendrytu.
- Użyj trybu Wybierz wskaźnika, zamieniając kursor w pole. Kliknij prawym przyciskiem myszy na punkcie początkowym dendrytu. Uwaga: oprogramowanie wykonuje wstępne obliczenia.
- Przesuń wskaźnik wzdłuż dendrytu. Od punktu początkowego (reprezentowanego przez niebieską kulę) pokazana jest żółta linia reprezentująca najbardziej prawdopodobną ścieżkę dendrytów. Kliknij lewym przyciskiem myszy na punkcie końcowym dendrytu.
- Wykonaj automatyczną segmentację kręgosłupów. Uwaga: Grzbiety na śledzonym dendrycie są automatycznie znajdowane przez interfejs modułu.
- W interfejsie modułu kliknij zakładkę Tworzenie. Z listy rozwijanej Odbuduj ponownie wybierz opcję Odbuduj średnicę dendrytu i zaznacz pole Zachowaj dane. Następnie kliknij przycisk Odbuduj.
- Ustaw Próg tak, aby objętość podzielona na segmenty odpowiadała rzeczywistej objętości dendrytu. Jako algorytm wybierz Najkrótszą odległość od mapy odległości.Kliknij przycisk Dalej.
- Określ najmniejszą średnicę główki grzbietu i maksymalną długość, ponownie za pomocą narzędzia do pomiaru odległości w zakładce Slice w oprogramowaniu, a następnie wróć do zakładki Surpass i wprowadź parametry. Dla tego protokołu dobrym punktem wyjścia są wartości około 200 - 300 nm dla minimalnej średnicy i 4 μm dla maksymalnej długości. Nie zaznaczaj pola Zezwalaj na kolce gałęzi. Kliknij przycisk Dalej.
- Dostosuj próg punktów początkowych tak, aby niebieskie punkty reprezentujące grzbiety lokalizowały się w rzeczywistych głowach grzbietów. Kliknij przycisk Dalej. Uwaga: Podstawowe obliczenia są teraz wykonywane i mogą być długie.
- Klasyfikuj grzbiety, przechodząc do zakładki Narzędzia w interfejsie modułu. Kliknij Klasyfikuj kolce. W wyświetlonym monicie interfejsie użytkownika upewnij się, że istnieją cztery klasy, zdefiniowane przez ich morfologię w następujący sposób: Krótki: długość <1 μm; Grzyb: Długość (grzbiet) >3 i Maksymalna szerokość (głowa) >średnia szerokość (szyja) x 2; Długa cienka: Średnia szerokość (głowa) ≥ Średnia szerokość (szyja); Podobne do filopodiów: długość ≤ 4 μm (bez głowy).
Uwaga: Interfejs modułu generuje cztery nowe obiekty Filament zawierające wyniki klasyfikacji. - Eksport danych statystycznych: na dowolnym z tych czterech interfejsów obiektu przejdź do zakładki Statystyki.
Kliknij przycisk Eksportuj wszystkie statystyki do pliku.
Uwaga: Inne wartości statystyczne można wyeksportować dla dendrytów (np. długość, powierzchnia, średnia średnica, głębokość gałęzi, kąt rozgałęzienia, objętość itp.) oraz dla kolców (np. prostoliniowość, obszar przyczepu, długość i objętość różnych części kręgosłupa, średnica grzbietu, gęstość itp.)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejsze badanie opisuje zestandaryzowany protokół ilościowego określania liczby kolców dendrytycznych w hodowlach dendrytów neuronów piramidalnych pochodzących z iPSC. Protokół ten umożliwia analizę dojrzewania kolców w neuronach ludzkich oraz jego ewentualne porównanie z dojrzewaniem kolców w standardowych hodowlach neuronów gryzoni, a także w modelach zwierzęcych in vivo.
Rysunek 1A przedstawia schemat poszczególnych etapów hodowli umożliwiających otrzymanie korow...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kwantyfikacja cech morfologicznych neuronów piramidowych opierała się na oprogramowaniu. Interfejs Filament Tracer został wykorzystany do segmentacji neuronów i kolców, a moduł XT do ich analizy.
Aby przeanalizować dokładność naszej techniki, najpierw porównaliśmy zmierzone parametry morfologiczne (długość, obszar i całkowita objętość kręgosłupa, jeśli dotyczy) z tymi opublikowanymi przy użyciu dojrzałych neuronów piramidowych szczurów w hodowli 6, 7 i ludzkich tkankach mózgowych
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Instytut Pasteura, fundację Bettencourt-Schueller, Centre National de la Recherche Scientifique, Uniwersytet Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), Fundacja Charytatywna Conny-Maeva, Fundacja Cognacq Jay, Fundacja Orange i Fundacja Fondamental. L.G. jest wspierany przez stypendium licencjackie Ministerstwa Zdrowia. Dziękujemy za pomoc BitPlane, w szczególności Georgia Golfis, na wczesnym etapie tej pracy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| D-PBS (1x), bez wapnia, magnezu i fenolu Czerwony | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Roztwór poli-L-ornityny Bioodczynnik | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mysia lamina lamina | Dutscher Dominique | 354232 | |
| Suplement N2 | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| Suplement B-27 bez witaminy A (50x) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-merkaptoetanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Penicylina-steptomycyna | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Przeciwciało poliklonalne w surowicy królika | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Serum dla koni | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Koza Anty-Królik | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Poliklonalne przeciwciało anty-beta-III tubuliny | Millipore | AB9354 | |
| Szkło osłonowe 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, lepka ciecz | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Ludzkie fibroblasty | Repozytorium biologiczne linii komórkowej Coriell | GM 4603 i GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy | Zeiss (Niemcy) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurych | wersja 6.4.0 | Niezbędne są moduły Filament Tracer i Imaris XT |
| Oprogramowanie Huygens | Oprogramowanie Huygens, SVI, Holandia | Wersja Pro | Opcjonalna (do testowania dekonwolucji) |
Bibliografia
- Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
- Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
- Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
- Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
- Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
- Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794(2011).
- Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
- Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
- Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997(2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
