Monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP

Podsumowanie

Homeostaza wapniowa retikulum endoplazmatycznego jest zaburzona w różnych patologiach. Reporter wydzielanego białka monitorującego wapń ER (SERCaMP) może być używany do wykrywania zakłóceń w magazynie wapnia ER. Protokół ten opisuje zastosowanie Gaussia lucyferazy SERCaMP do badania homeostazy wapnia ER in vitro i in vivo.

Streszczenie

Retikulum endoplazmatyczne (ER) zawiera najwyższy poziom wewnątrzkomórkowego wapnia, o stężeniach około 5 000 razy większych niż poziomy cytoplazmatyczne. Ścisła kontrola nad wapniem ER jest niezbędna do fałdowania, modyfikacji i transportu białek. Zaburzenia wapnia w ER mogą powodować aktywację niesfałdowanej odpowiedzi białkowej, trójstronnego mechanizmu odpowiedzi na stres ER i przyczyniać się do patogenezy w różnych chorobach. Możliwość monitorowania zmian stężenia wapnia w ER podczas wystąpienia i progresji choroby jest zasadniczo ważna, ale w praktyce stanowi wyzwanie. Obecnie dostępne metody monitorowania wapnia ER, takie jak barwniki i białka fluorescencyjne zależne od wapnia, dostarczyły informacji na temat dynamiki wapnia w komórkach, jednak narzędzia te nie są dobrze przystosowane do badań in vivo. Nasze laboratorium wykazało, że modyfikacja końca karboksylowego lucyferazy Gaussia nadaje wydzielanie reportera w odpowiedzi na wyczerpanie wapnia ER. Metody stosowania opartego na lucyferazy, wydzielanego białka monitorującego wapń ER (SERCaMP) do zastosowań in vitro i in vivo opisano w niniejszym dokumencie. Ten film przedstawia iniekcje do wątroby, farmakologiczne manipulacje GLuc-SERCaMP, pobieranie i przetwarzanie krwi oraz parametry testowe do długotrwałego monitorowania wapnia ER.

Wprowadzenie

Retikulum endoplazmatyczne (ER) funkcjonuje w wielu możliwościach komórkowych, w tym w fałdowaniu białek, wydzielaniu białek, homeostazie lipidów i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej¹. Kluczowe dla normalnej funkcji ER jest utrzymanie stężenia wapnia w świetle na poziomie ~ 5,000 razy większym niż w cytoplazmie^2-4. Ten energochłonny proces jest regulowany przez ATPazę wapniową sarko/retikulum endoplazmatycznego (SERCA), pompę, która przenosi jony wapnia do ER. Wypływ wapnia z ER odbywa się głównie za pośrednictwem receptorów ryanodyny (RyR) i trifosforanu inozytolu (IP3R). Ponieważ wiele procesów ER jest zależnych od wapnia, zakłócenie magazynowania może prowadzić do stresu ER i ostatecznej śmierci komórki.

ER zaobserwowano dysregulację wapnia w chorobach takich jak kardiomiopatia, cukrzyca, choroba Alzheimera i Parkinsona5^. Ze względu na postępujący charakter tych chorób trudno było określić związek przyczynowo-skutkowy między patogenezą a zmianami w magazynie wapnia ER. Szereg technologii pozwoliło na znaczne postępy w zrozumieniu dynamiki wapnia ER, w tym barwników i genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI). Barwniki wapniowe o niskim powinowactwie, które zwiększają fluorescencję po związaniu z Ca²⁺, można załadować do komórek w celu zbadania przedziałów subkomórkowych o wysokim stężeniu wapnia⁶. GECI, takie jak D1ER i CatchER, pozwalają na monitorowanie wahań wapnia z bardziej precyzyjną kontrolą lokalizacji subkomórkowej^7-9. Ostatnio opisano inną klasę GECI zwaną wskaźnikami białkowymi uwięzionymi w organellach pomiarowych wapnia (CEPIA)¹⁰. Trzecim podejściem łączącym genetykę i chemię małych cząsteczek jest ładowanie barwnikiem esterazy celowanej (TED), które wykorzystuje genetycznie kodowaną karboksyloesterazy (ukierunkowaną na ER) z barwnikiem wapniowym na bazie estrów¹¹.

Chociaż wyżej wymienione podejścia mają swoje mocne i słabe strony, mogą dostarczyć cennych informacji na temat dynamiki wapnia w ER dzięki ostrym pomiarom fluorescencji. Nie są one jednak optymalne dla badań podłużnych, które często są wymagane do zbadania progresji choroby. Mając na celu opracowanie metody monitorowania dynamiki wapnia w dłuższych okresach czasu, zidentyfikowaliśmy i opracowaliśmy modyfikację białka w celu stworzenia wydzielanych białek monitorowania wapnia ER (SERCaMPs)¹².

SERCaMP omija kilka ograniczeń związanych z innymi metodologiami, zapewniając minimalnie inwazyjne podejście do wielokrotnego przeszukiwania magazynu wapnia ER. Wcześniej wykazaliśmy, że peptyd karboksylowo-końcowy ASARTDL (alanina-seryna-alanina-arginina-treonina-kwas asparaginowy-leucyna) jest wystarczający do promowania retencji ER; jednak w warunkach, które powodują zmniejszenie stężenia wapnia ER, sekwencja peptydowa nie jest już w stanie utrzymać lokalizacji ER i białko jest wydzielane¹³. Podstawą technologii SERCaMP jest dołączenie ASARTDL do końca karboksylowego wydzielanego białka (np. Gaussia luciferase lub GLuc) w taki sposób, że wydzielanie jest wyzwalane przez wyczerpanie wapnia ER, tworząc w ten sposób solidny reporter dysregulacji wapnia ER¹². Ekspresja GLuc-SERCaMP za pomocą metod transgenicznych umożliwia analizę płynów biologicznych, w tym pożywki do hodowli komórkowych i osocza, pod kątem zmian w aktywności GLuc jako wskaźnika homeostazy wapnia ER. Metoda ta ma zastosowanie w badaniach podłużnych postępujących zmian w magazynie wapnia ER zarówno in vitro, jak i in vivo. Poniższy protokół został napisany jako ogólny zarys korzystania z SERCaMP opartego na GLuc do badania homeostazy wapnia ER, ale protokół może służyć jako przewodnik dla alternatywnych reporterowych SERCaMP.

Protokół

1. Test in vitro: Wykrywanie uwalniania SERCaMP ze stabilnej linii komórkowej SH-SY5Y

1. Płytka SH-SY5Y-GLuc-ASARTDL (SERCaMP) na płytkach poddanych działaniu hodowli tkankowej w ilości 150 000 komórek na^cm2 powierzchni. Na przykład w przypadku płytek 96-dołkowych należy wysiać 50 000 komórek na dołek (ryc. 1A). Hoduj komórki SH-SY5Y w DMEM (wysoki poziom glukozy, GlutaMAX, pirogronian) + 10% surowicy wzrostu bydła + 1x penicylina/streptomycyna.
   1. Komórki pasażowe do 15 razy (ryc. 1B). Wyższa liczba pasaży nie została przetestowana.
   2. Umieścić komórki z powrotem w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5,5% CO₂ i inkubować przez noc.
2. Przed poddaniem działaniu substancji eksperymentalnej należy pobrać próbkę wyjściową dla każdej studzienki, przenosząc 5 μl supernatantu do hodowli na nieprzezroczystą płytkę 96-dołkową o nieprzezroczystych ściankach. Przed zebraniem delikatnie postukaj w płytkę ze wszystkich stron i obracaj, aby uniknąć efektów gradientu. Uszczelnić nieprzezroczystą płytkę samoprzylepnym arkuszem uszczelniającym i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia testu enzymatycznego.
   Uwaga: Wydzielany GLuc-SERCaMP jest bardzo stabilny w pożywce do hodowli komórkowych. Wcześniej informowaliśmy, że około 5-10% aktywności GLuc zostało utracone po 72-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 °C (inkubowanej na komórkach SH-SY5Y)¹².
3. Traktuj komórki zgodnie z potrzebami, aby zbadać niedobór wapnia w ER (np. manipulacje środowiskowe, farmakologiczne, genetyczne). Należy unikać długotrwałego wystawiania na działanie środowiska otoczenia (poza kontrolowanym inkubatorem), ponieważ przy atmosferycznym CO₂ nastąpią szybkie zmiany pH. Dodać HEPES do pożywki hodowlanej w temperaturze 20 mM, aby ustabilizować pH¹⁴, jeśli wymagane są długotrwałe manipulacje. Unikaj ekspozycji na światło podczas stosowania HEPES w pożywce^{hodowlanej 15}.
   1. Kontrola pozytywna: Traktuj komórki 100 nM thapsigarginą (Tg) lub 50 μM kwasem cyklopiazonowym (CPA) przez 4-6 godzin do eksperymentów na komórkach SH-SY5Y. Maksymalna odpowiedź w innych liniach komórkowych może wymagać dłuższych inkubacji lub różnych stężeń związków.
   2. Kontrola ujemna: Zebrać pożywkę hodowlaną z rodzicielskich komórek SH-SY5Y. Z naszego doświadczenia wynika, że luminescencja tła dla tego testu wynosi mniej niż 0,05% podstawowego wydzielania ze stabilnych komórek SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP.
4. Zbierz i przechowuj 5 μl próbek kondycjonowanych pożywek w żądanych punktach czasowych, jak opisano w kroku 1.2.
5. Ocenić aktywność enzymatyczną w pożywce, jak opisano w sekcji 5.
6. Zbadaj wewnątrzkomórkowy GLuc za pomocą testu immunoblot lub luminescencji.
   1. W przypadku immunoblot: liza komórek w zmodyfikowanym buforze RIPA zawierającym 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,25% deoksycholanu sodu, 1 mM EDTA, 1% NP40 i inhibitory proteazy. Oddzielić na żelu poliakrylamidowym SDS i przenieść na membranę PVDF 0,20 μm. Inkubować błonę z przeciwciałem GLuc (rozcieńczenie 1:2 000) przez noc w temperaturze 4 °C. Przeprowadzić wtórną inkubację przeciwciał i płukanie membrany zgodnie ze zdefiniowanym przez użytkownika protokołem dla wybranego odczynnika do wykrywania.
   2. W przypadku testu luminescencji (rysunek 2): wykonaj następujące czynności na lodzie:
      1. Usunąć całe podłoże z dołków płytki do hodowli tkankowej i spłukać 200 μl zimnego PBS.
      2. Do każdej studzienki dodać 75 μl buforu do lizy zawierającego 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40 i inhibitory proteazy.
      3. Obracać płytkę na wytrząsarce orbitalnej (120 obr./min) w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
      4. Delikatnie pipetować lizat w górę i w dół za pomocą pipetara wielokanałowego, unikając pęcherzyków powietrza. Przenieść 5 μl lizatu na nieprzezroczystą płytkę i ocenić luminescencję, jak opisano w sekcji 5.

2. Test in vitro: Transfekcja przejściowa unieśmiertelnionych komórek za pomocą SERCaMP

Uwaga: Zaobserwowaliśmy, że procedury transfekcji przejściowej mogą wywołać stres komórkowy i stępić późniejszą odpowiedź GLuc-SERCaMP. Następujące podejście zostało opracowane w celu zminimalizowania efektów transfekcji w komórkach SH-SY5Y. Może być konieczna optymalizacja tej procedury (w tym wybór odczynnika do transfekcji) dla alternatywnych linii komórkowych. Jeśli to możliwe, zaleca się stosowanie stabilnych linii komórkowych lub metod transdukcji wirusa opisanych odpowiednio w sekcjach 1 i 3.

1. Płytka ogniw SH-SY5Y w naczyniu 100 mm o wymiarach 4 x 10⁶ komórek. To naczynie będzie wystarczające do ponownego zasiania około 300 dołków (format płytki 96-dołkowej) po procedurze transfekcji.
2. Transfekcja komórek odczynnikiem Xfect przy użyciu 20 μg plazmidowego DNA (kodującego GLuc-SERCaMP) i 6 μl odczynnika Xfect. Odpowiednio skaluj DNA i odczynnik Xfect dla większych lub mniejszych naczyń hodowlanych.
3. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na 48 godzin.
4. Trypsynizuj komórki i ponownie wysiewaj je do 96 dołków po 60 000 komórek na dołek. Postępuj zgodnie z kolejnymi krokami opisanymi w sekcji 1.

3. Test in vitro: Ekspresja GLuc-SERCaMP za pośrednictwem wektora wirusowego

Uwaga: Wcześniej zgłoszono pakowanie wektorów wirusowych (AAV) związanych z adenowirusem (AAV)¹⁶ i oczyszczanie¹² oraz produkcję lentiwirusa¹³.

1. Miano GLuc-SERCaMP AAV przy użyciu następujących starterów i sond: starter do przodu, 5′-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3′; starter odwrotny, 5′-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3′; sonda (znakowana 5′-6-FAM/3′-BHQ-1), 5′-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3' do ilościowego PCR.
   1. Przygotować krzywą wzorcową, linearyzując plazmid zawierający GLuc i oczyszczając DNA za pomocą kolumny wirowej (np. Machery-Nagel NucleoSpin Gel i oczyszczanie PCR). Określ ilościowo DNA, rozdzielając je na żelu agarozowym wzdłuż drabiny masowej. Przygotować rozcieńczenia DNA w stosunku 1:10 od 100 pg/ml do 10 fg/ml w PBS. Obliczyć kopie/ml plazmidowego DNA GLuc przy każdym ze stężeń na podstawie masy cząsteczkowej plazmidu.
   2. Rozcieńczyć zapasy AAV w PBS (odpowiednie rozcieńczenie będzie zależne od parametrów preparatu wirusowego i określone empirycznie).
   3. Uruchom reakcję PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym w następujących warunkach: 95 °C × 5 min, 94 °C × 20 s i 60 °C × 1 min przez 41 cykli. Oblicz kopie/ml przy użyciu krzywej wzorcowej.
2. Miano lentiwirusa z zestawem szybkiego miana p24 Lenti-X. Rozmrozić podwielokrotności lentiwirusa na lodzie i rozcieńczyć białko kontrolne p24 w pożywce SH-SY5Y.
   1. Rozcieńczyć lentiwirusa tak, aby spadł na krzywą standardową (np. 1:20 000 lub 1:100 000). Wymagany współczynnik rozcieńczenia będzie się różnił w zależności od parametrów preparatu lentiwirusowego i musi być określony empirycznie. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dla wszystkich kolejnych kroków.
3. Płytki komórkowe do 96-dołkowych płytek. W przypadku ogniw SH-SY5Y można postępować zgodnie z procedurami galwanowania opisanymi w sekcji 1. W przypadku pierwotnych neuronów korowych szczurów komórki należy wyizolować i wysiać na odpowiednio pokrytych płytkach, jak opisano wcześniej¹⁶. Utrzymuj pierwotne neurony korowe szczura w pożywce neuropodstawowej uzupełnionej 1x B27 i 500 μM L-glutaminy. Wykonuj wymianę połowy medium co drugi dzień.
4. Transdukuj komórki za pomocą wirusa. Celem transdukcji wirusa jest osiągnięcie niskiego poziomu ekspresji, ponieważ lucyferazy Gaussia zapewnia silny sygnał.
   1. Transdukcja AAV Komórki SH-SY5Y: Transdukcja następnego dnia po posiewaniu. Rozcieńczyć AAV do 6,0 x 10⁷ vg/μl w buforze rozcieńczającym AAV (PBS + 0,5 mM MgCl₂). Dodać 5 μl rozcieńczonego AAV (3,0 x 10⁸ vg; MOI około 6,000) na studzienkę z 96-dołkową płytką (ryc. 3A). Użyj 10% wybielacza, aby dezaktywować odpady wektorów wirusowych.
   2. Transdukcja AAV pierwotnych neuronów korowych szczura: Transdukcja 6-8 dni po posiewie. Rozcieńczyć AAV do 4,0 x 10⁶ vg/μl w buforze rozcieńczającym AAV. Dodać 5 μl rozcieńczonego AAV (2,0 x 10⁷ vg; MOI około 350) na studzienkę płytki 96-dołkowej (ryc. 3B). Optymalny MOI należy określić empirycznie dla innych typów komórek. Użyj 10% wybielacza, aby dezaktywować odpady wektorów wirusowych.
   3. Transdukcja lentiwirusowa komórek SH-SY5Y: Transdukcja następnego dnia po posiewie. Rozcieńczyć lentiwirusa do 20 pg/μl p24 (stężenie określone za pomocą zestawu do miareczkowania) w zrównoważonym roztworze soli Hanka. Dodać 5 μl rozcieńczonego wirusa na studzienkę (100 pg p24, co odpowiada 1 250 000 cząstek lentiwirusowych lub ~ 1 250 IFU) z 96-dołkowej płytki zawierającej 100 μl objętości. Skaluj odpowiednio w przypadku większych formatów. Użyj 10% wybielacza, aby dezaktywować odpady wirusowe.
5. Zbierz próbkę pożywki przed leczeniem i rozpocznij eksperymentalne leczenie 48 godzin (SH-SY5Y) lub 5-7 dni (pierwotne neurony korowe szczura) po transdukcji.

4. Test In Vivo SERCaMP

Uwaga: Zanim przeprowadzisz jakiekolwiek procedury na zwierzętach, upewnij się, że uzyskałeś odpowiednią zgodę od swojej instytucji. Wszystkie operacje przetrwania muszą być wykonywane w sterylnych warunkach w odpowiednim znieczuleniu. Wszystkie opisane poniżej procedury zostały zatwierdzone i są zgodne z wytycznymi NIH ACUC.

1. Autoklaw narzędzi chirurgicznych przed rozpoczęciem operacji (121 °C, 30 min sterylizacji, 20 min czas schnięcia). Wyczyść wszystkie narzędzia w ultrasonografie natychmiast po wszystkich procedurach i przed autoklawowaniem. Utrzymuj sterylne warunki podczas operacji przeżycia. W przypadku operacji wymagających wielu zwierząt należy przetrzeć narzędzia chirurgiczne 70% alkoholem, ultradźwiękami i sterylizować kulkami między szczurami. Zapoznaj się z listą materiałów, aby uzyskać niezbędne instrumenty.
2. Przygotuj szczura do operacji. Tutaj używamy samca Sprague-Dawley (180-200 g).
   1. Znieczulenie szczurów za pomocą gazu izofluranu przez 3 minuty (4-5% izofluranu podawanego w dawce 1000 cm³/min), a następnie wstrzyknięcia dootrzewnowe ksylazyny (8 mg/kg) i ketaminy (80 mg/kg). Zastosuj maść okulistyczną, aby chronić rogówki przed wysuszeniem. Rozpocznij operację, gdy szczur jest głęboko znieczulony, o czym świadczy brak odruchu wycofania po uszczypnięciu ogona lub stopy.
   2. Ogol obszar brzucha nieco poniżej żeber (dolna część klatki piersiowej) do środkowej części brzucha. Wyszoruj obszar chirurgiczny trzy razy, naprzemiennie 70% alkoholem i peelingiem Betadine. Umieść szczura w pozycji leżącej na sterylnym obszarze operacyjnym ze sterylnymi obłożami chirurgicznymi.
3. Rozcieńczyć AAV-GLuc-SERCaMP do 7,6 x 10⁹ vg/ml (stężenie końcowe). Dobrze wymieszaj, odwracając rurkę.
   Uwaga: Zakres stężenia wirusa może się różnić (ryc. 4).
   1. Odpipetować 105 μl rozcieńczonego AAV do sterylnego naczynia. Użyj igły o rozmiarze 30, aby zebrać wirusa do strzykawki.
4. Wykonaj operację w celu odsłonięcia wątroby i wstrzyknięcia AAV-GLuc-SERCaMP.
   1. Przed wykonaniem nacięcia w jamie brzusznej nałóż 0,25% bupiwakainy na miejsce nacięcia. Za pomocą skalpela wykonaj poziome nacięcie poniżej klatki piersiowej (około 2-3 cm). sekcja w celu oddzielenia tkanki łącznej od tkanki podskórnej.
   2. Przeciąć mięsień brzucha, odsłaniając prawy przyśrodkowy płat wątroby.
      Uwaga: dodatkowe płaty mogą być wstrzykiwane w zależności od aplikacji końcowej.
   3. Umieść zwierzę pod mikroskopem chirurgicznym i dostosuj, aby prawy przyśrodkowy płat wątroby znalazł się w polu widzenia. Wstrzyknąć wirusa do miąższu płata przyśrodkowego; 3 oddzielne miejsca, około 33 μl na ośrodek.
      Uwaga: Pozostawić igłę w tkance na 5-10 sekund po wstrzyknięciu, aby zapewnić dostarczenie całej objętości wstrzyknięcia.
   4. Zszyj osobno mięśnie brzucha i skórę i dodaj Neosporin za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. Umieść szczura w komorze rekonwalescencji, aż odzyskasz przytomność i szczur będzie w stanie utrzymać pionową pozycję. Nie pozostawiaj szczura (szczurów) bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżący mostek. Domować pojedynczo do momentu zagojenia się nacięcia i usunięcia szwów (7-14 dni).
      Uwaga: Zgodnie z wytycznymi pooperacyjnymi NIH należy prowadzić dokumentację chirurgiczną. Opisz kartę klatki z procedurą, datą, identyfikatorem eksperymentu, masą ciała i dniem operacji. Ból/niepokój, produkcja kału, aktywność oraz spożycie pokarmu i wody muszą być monitorowane i rejestrowane 3 dni po operacji. Analgezja pooperacyjna jest zapewniona przez dodanie paracetamolu do wody pitnej (450 mg/100 cm3), chociaż zazwyczaj nie obserwujemy oznak bólu lub niepokoju po operacji.
5. Rozpocznij pobieranie krwi z ogona 4-7 dni po wstrzyknięciu. Przygotuj probówki do pobierania krwi, etykietując je i wstępnie ważąc. Dodać 50 μl heparyny (1 000 j./ml) do każdej probówki.
6. Umieść szczura w komorze anestezjologicznej izofluranu na 3 minuty (4-5% izofluranu podawanego w tempie 1000 cm³/min). Wyjmij szczura z komory i umieść w stożku nosowym (2-3% izofluranu dostarczonego w tempie 500 cm3/min). Pobieranie krwi można rozpocząć, gdy szczur jest głęboko znieczulony, o czym świadczy brak odruchu odstawienia po uszczypnięciu ogona.
   1. Za pomocą sterylnych nożyczek odetnij końcówkę ogona (1-2 mm) i zbierz krew kroplami do wstępnie napełnionej probówki z heparyną. Pobieraj krew do momentu, gdy objętość krwi osiągnie stosunek krwi do heparyny większy niż 2:1 (>100 μl krwi/50 μl heparyny). Objętość pobieranej krwi można dostosować w oparciu o projekt eksperymentalny. Użyj mokrego bawełnianego aplikatora, aby nałożyć ściągający proszek na ogon, aby zatrzymać krwawienie.
   2. Probówki z krwią należy przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku pobierania kolejnych próbek. Wytrzyj nożyczki podkładką etanolową i sterylizuj koraliki między kolekcjami.
   3. Zważyć probówki do pobierania i dostosować z heparyną, aby uzyskać stosunek 2:1 (krew:heparyna). Ten krok znormalizuje ilość heparyny w każdej próbce (Tabela 1).
   4. Probówki wirować przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant (osocze) do świeżej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu oznaczenia lucyferazy (sekcja 5).
      Uwaga: Przechowywanie próbek w temperaturze 4 °C do 72 godzin przed testem enzymatycznym ma minimalny wpływ na luminescencję (rysunek 5A). Do 3 cykli zamrażania i rozmrażania próbek plazmy nie ma wpływu na luminescencję (ryc. 5B).
7. Podawanie tapsygarginy (kontrola pozytywna):
   1. Przygotować thapsigarginę, rozcieńczając ją w etanolu do końcowego stężenia 2,5 mg/ml. Wstrzyknąć thapsigarginę w dawce 1 mg/kg i.p. do podbrzusza.
      Uwaga: Thapsigargin zwiększa krzepliwość płytek krwi wywołaną trombiną¹⁷ i może utrudniać pobieranie krwi z ogona.
8. Test lucyferazy Gaussa:
   1. Rozmrozić próbki osocza na lodzie.
      Uwaga: W przypadku badań podłużnych należy rozmrozić i przeprowadzić test luminescencji dla wszystkich próbek w punkcie czasowym tego samego dnia (przy użyciu pojedynczego przygotowania substratu).
   2. Przenieść 10 μl osocza na nieprzezroczystą płytkę o ściankach i zmierzyć aktywność enzymatyczną zgodnie z opisem w punkcie 5. Przeprowadzić 3-4 powtórzenia techniczne każdej próbki osocza.
9. Eutanazja
   Uwaga: Zaletą technologii SERCaMP jest możliwość wzdłużnego monitorowania wapnia ER. W zależności od parametrów doświadczalnych i analiz punktów końcowych, zwierzęta mają być poddawane eutanazji za pomocą środków odpowiednich dla analiz punktów końcowych i zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi ACUC.

5. Test luminescencji

1. Przygotować roztwory podstawowe dla celendanyterazyny (CTZ), rozcieńczając związek w zakwaszonym metanolu (30 μl 10 N HCl na 3 ml metanolu) do 20 mM. Przygotować porcje jednorazowego użytku i przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Przygotować podłoże robocze w dniu testu.
   1. W przypadku testów in vitro rozcieńczyć koelenterazynę do 8 μM w PBS, np. dodać 10 μl 20 mM materiału podstawowego CTZ do 25 ml PBS (ryc. 6A, B).
   2. W przypadku testów in vivo rozcieńczyć koelenetrazynę do 100 μM w PBS, 500 mM kwasu askorbinowego, 5 mM NaCl.
3. Inkubować przygotowany CTZ przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej przed rozpoczęciem oznaczania.
   Uwaga: Ten etap jest często uwzględniany w testach lucyferazy Gaussa, ponieważ istnieją doniesienia o szybkim rozpadzie substratu w ciągu pierwszych 30 minut po przygotowaniu. Nie zaobserwowaliśmy tego efektu w naszym systemie (Rysunek 6C); Jednak często uwzględniamy etap inkubacji, ponieważ nie znaleźliśmy żadnego negatywnego wpływu na test.
4. Użyj czytnika płytek, który jest w stanie monitorować bioluminescencję i jest wyposażony w wtryskiwacz substratu. Zagruntować linie substratem.
   Uwaga: Początkowe podłoże przechodzące przez linie może być podatne na degradację. Aby uniknąć sztucznie zaniżonych odczytów dla wczesnych próbek, przed pomiarem próbek eksperymentalnych wstrzyknij 20-30 pustych studzienek (ładując pustą płytkę na czytnik).
5. Wstrzyknąć 100 μl substratu do studzienki, wstrząsnąć medium przez 5 sekund i zmierzyć emisję światła. W przypadku czytnika płytek Biotek Synergy II należy zintegrować emisję światła w ciągu 0,5 sekundy (próbki in vitro) i 5 sekund (próbki in vivo) na etapie odczytu. Zoptymalizuj parametry czytnika płytek, aby uzyskać idealną wydajność testu.
   Uwaga: Gaussia lucyferazy wykazuje kinetykę błysku z szybkim zanikiem sygnału (w porównaniu z kinetyką świecenia obserwowaną u innych lucyferazy). Na kinetykę błysku GLuc wpływa surowica w pożywce do hodowli komórkowych (ryc. 7A), co podkreśla znaczenie kontrolowania składu pożywki w próbkach. Ze względu na szybki zanik luminescencji po dodaniu substratu (kinetyka błysku), czas między etapami wstrzykiwania i odczytu musi być jednakowy dla wszystkich próbek. Czytnik płytek powinien być ustawiony na wstrzykiwanie substratu do studzienki, odczekać określony czas (np. stosujemy 5-sekundowy krok wstrząsu) i dobrze to odczytać. Dodanie substratu do całej płytki przed odczytem stanowi poważne wyzwanie, chyba że substrat można dodać do wszystkich studzienek jednocześnie. Jeśli wtryskiwacz nie jest dostępny, problem można częściowo obejść, inkubując płytkę przez 10 minut między dodaniem substratu a pomiarem (unikając w ten sposób stromej części krzywej zaniku) (rysunek 7B).
6. Powtórz wstrzyknięcie, odczekaj czas i odczytaj kroki dla każdego dołka na płytce.

Wyniki

Metoda GLuc-SERCaMP umożliwia ocenę homeostazy wapnia w retikulum endoplazmatycznym (ER) poprzez pobieranie płynów pozakomórkowych. W celu usprawnienia interpretacji wyników w projekcie doświadczalnym można uwzględnić kilka kontroli. Po pierwsze, do oceny wpływu zabiegów eksperymentalnych na szlak wydzielniczy (ogólnokomórkową sekrecję) oraz ekspresję transgenu można zastosować reporter konstytutywnie wydzielany (np. GLuc bez C-końcowego fragmentu ASARTDL lub „GLuc-No Tag”). Przykładowo, wzrost pozakomórkowych p...

Dyskusja

Protokół ten podkreśla przydatność in vitro i in vivo GLuc-SERCaMP do monitorowania wyczerpania wapnia ER. Chociaż modyfikacja białka w celu wygenerowania SERCaMP wydaje się uogólniać na inne białka reporterowe¹², wybraliśmy lucyferazę Gaussia ze względu na jej solidną (200-1000 razy większą) bioluminescencję w porównaniu z innymi lucyferazy¹⁸. Wykazujemy wykrywalne uwalnianie GLuc-SERCaMP indukowane przez thapsigarginę w 100-krotnym zakresie dawek wirusa GLuc-SERCaMP dost...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki 1,5 ml	Fisher	02-682-550
10% roztwór NP-40	Pierce	28324	do wewnątrzkomórkowych testów GLuc
Strzykawki Luer-lok 1 ml	Fisher	14-823-30
200 mikrolitrowe końcówki filtrujące	Nici	Rainin RT-L200F
3-0	Igły Fisher	NC9598192
30 G	Fisher Scientific	14-821-13A
Samoprzylepne arkusze uszczelniające do mikropłytek	Thermo	AB-0558
Podkładki nasączone alkoholem	Fisher	22-246-073
Anestezjologiczny system automatycznego przepływu	EZ Anestezjolizacja	EZ-AF9000
Komora rekonwalescencji dla zwierząt	Lyon Vet	ICU-912-004
B27 suplement	Life Technologies	17504-044
Roztwór betadyny	Fisher	NC9386574
Bleach	Clorox	n/a
Serum na wzrost bydła	Thermo	SH30541.03
Coelenterazine, Native	Regis Technologies	1-361204-200
Aplikatory z bawełnianą końcówką	Puritan	806-WC
Igły do cięcia 3/8 szwów kołowych	WPI	501803
Cyfrowy ultradźwiękowy środek czyszczący	Fisher Scientific	FS60D
DMEM o wysokiej zawartości glukozy, GlutaMAX, pirogronian	Life Technologies	10569-010
Drabinka masy DNA	Life Technologies	10496-016
Lucyferazy Gaussia (białko rekombinowane)	Nanolight	321-100
Przeciwciało lucyferazy Gaussia (dla WB, ICC lub IHC)	New England Biolabs	E8023S	1:2,000 (WB)
Germinator 500	CellPoint Scientific	DS-401
Płytki testowe Gluc (96 dołków, nieprzezroczyste)	Fisher	07-200-589
Zrównoważony roztwór soli Hanka	Life Technologies	14175-095
Heparyna	Allmedtech	63323-276-02
Izofluran	Butler Schein	29404
Ketamina	Henry Schein	995-2949
Kwik Stop Ściągacz w proszku	Butler Schein	5867
L-glutamina	Sigma	G8540
Metanol	Fisher	a452-4
Microfuge 22R Wirówka	Bekman Colter	368831
Neosporin	Fisher	19-898-143
Neurobaseal medium	Life Technologies	21103049
Nikon Stereoscope	Nikon	SMZ745T
Nucleospin Gel and PCR Cleanup	Pipet Machery-Nagel	740609
P200	Zestaw	L-200XLS+
p24 Lenti-X	Clontech	632200
Uszczelka foliowa PCR	Fisher	AB0558
Penicylina/streptomycyna	Life Technologies	15140-122
Koktajl inhibitorów proteazy	Sigma	P8340
ReFresh Kanister z filtrem węglowym	EZ Anestezjolizacja	EZ-258
Ostrza skalpela, #10	Narzędzia Fine Science Inc	10010-00
Szczury SD 150-200 g	Charles River	Szczury	szczury zamówione w ilości 150-200 g.  Zabieg chirurgiczny 5 dni po przyjeździe
Kolczyki dla małych zwierząt National	Band and Tag co	1005-1
Sterylne serwety chirurgiczne	Braintree Scientific	SP-MPS
Synergy 2 czytnik płytek	BioTek	n/a
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Thapsigargin	Sigma	T9033	szkodliwy dla zdrowie ludzkie
Virapower lentiviral packaging mix	Life Technologies	K4975-00
Odczynnik Xfect Transfection	Clontech	631318
Xylazine	Valley Vet	468RX