Pokazujemy wpływ sieciowania twardówki z ryboflawiną i UVA na osiowo wydłużone oko królika. Wydłużenie osiowe wywołano u 13-dniowych królików nowozelandzkich (samca i samicy) poprzez zszycie ich prawych powiek (tarsorrhaphy).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Sieciowanie twardówki za pomocą ryboflawiny i promieniowania ultrafioletowego-A w celu zapobiegania krótkowzroczności osiowej w modelu królika
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Osoby z krótkowzrocznością, szczególnie te z ciężką krótkowzrocznością, są narażone na wyższe niż normalnie ryzyko zaćmy, jaskry, odwarstwienia siatkówki i nieprawidłowości naczyniówkowo-siatkówkowych. Ponadto patologiczna krótkowzroczność jest częstą nieodwracalną przyczyną upośledzenia wzroku i ślepoty1-3. Nasze badanie pokazuje wpływ sieciowania twardówki za pomocą ryboflawiny i promieniowania ultrafioletowego-A na rozwój krótkowzroczności osiowej w modelu króliczym. Długość osiową gałki ocznej zmierzono za pomocą ultrasonografii A-scan u białych królików nowozelandzkich w wieku 13 dni (samca i samicy). Następnie oko poddano peritomii spojówek 360° z sieciowaniem twardówki, a następnie tarsorrhaphy. Wydłużenie osiowe wywołano u 13-dniowych królików nowozelandzkich poprzez zszycie ich prawych powiek (tarsorrhaphy). Oczy podzielono na ćwiartki, a każda ćwiartka miała dwie strefy napromieniowania twardówki, każda o powierzchni 0,2 cm² i promieniu 4 mm. Sieciowanie przeprowadzono poprzez upuszczenie 0,1% ryboflawiny-5-fosforanu wolnego od dekstranu na strefy napromieniania 20 sekund przed napromieniowaniem ultrafioletowym-A i co 20 sekund w czasie napromieniania 200 sekund. Promieniowanie UVA (370 nm) zastosowano prostopadle do twardówki o wartości 57 mW/cm² (całkowita dawka światła UVA, 57 J/cm²). Tarsorrhaphie usunięto w 55 dniu, a następnie powtórzono pomiary długości osiowej. Badanie to pokazuje, że sieciowanie twardówki ryboflawiną i promieniowaniem ultrafioletowym-A skutecznie zapobiega wydłużeniu osiowemu wywołanemu okluzją w modelu królika.
Wprowadzenie
Krótkowzroczność jest najczęstszym z zaburzeń refrakcji. Częstość występowania krótkowzroczności w USA i Europie wynosi około 30%, a w krajach azjatyckich dotyka do 60% populacji ogólnej1,2. Progresja krótkowzroczności występuje do 50% krótkowzroczności, zwykle z szybkością około -0,5 dioptrii w odstępie dwuletnim3. Koszty zdrowotne związane z krótkowzrocznością są znaczne, w tym wydatki na okulary, soczewki kontaktowe i chirurgię refrakcyjną oraz koszty związane ze zwiększonym ryzykiem zdrowotnym jaskry, zaćmy, odwarstwienia siatkówki i upośledzenia wzroku4-6.
W badaniach na zwierzętach krótkowzroczność, zmniejszenie wzroku jest indukowane przez zszyciepowiek 7-10, umieszczenie okludera w niewielkiej odległości od oka i tatuaż rogówki11. Jednak, aby sztuczna krótkowzroczność mogła wystąpić w tych badaniach, proces okluzji musi być przeprowadzony na bardzo młodych zwierzętach, ponieważ żadne eksperymenty z deprywacją wzroku przeprowadzone na dorosłych osobnikach nie wykazały sukcesu.
Jedną z ważnych cech ciężkiej krótkowzroczności jest patologiczna zmiana twardówki z postępującym ścieńczeniem twardówki, prawdopodobnie z powodu zaburzonego mechanizmu sprzężenia zwrotnego emmetropizacji po deprywacji wzroku12 lub z powodu jakiegoś zaburzenia metabolicznego twardówki, takiego jak w zespole Ehlersa-Danlosa13. Ostatecznie oba mechanizmy prowadzą do rozciągnięcia i ścieńczenia twardówki, siatkówki i naczyniówki z powodu nieprawidłowości strukturalnych twardówki krótkowzrocznej, takich jak zmniejszona średnica włókna kolagenowego14,15 i zaburzenia fibrylogenezy16.
Kilka badań wykazało, że upośledzone sieciowanie kolagenu jest ważnym czynnikiem w procesie osłabiania krótkowzrocznej twardówki17-18. Wollensak i wsp. 19-21 indukował sieciowanie kolagenu poprzez zastosowanie fotouczulacza ryboflawiny i promieniowania ultrafioletowego A (UVA) (370 nm) i odnotował znaczący, 157% wzrost sztywności twardówki świń i ludzi in vitro19 oraz 465% wzrost sztywności twardówki królika in vivo (moduł Younga)20. Sieciowanie miało również długoterminowy wpływ na twardówkę królika in vivo: sztywność wzrosła o 320,4% po 3 dniach, 277,6% po 4 miesiącach i 502% po 8 miesiącach (moduł Younga)22.
Terapeutyczne próby zatrzymania postępu krótkowzroczności zostały opublikowane23-26, ale sukces tych metod jest kontrowersyjny. Do tej pory nie znaleziono skutecznych środków zapobiegania postępującej krótkowzroczności.
Etiologia krótkowzroczności jest nadal kontrowersyjna, a jej leczenie stanowi wyzwanie. Na podstawie tych ustaleń wysunięto hipotezę, że sieciowanie twardówki może służyć jako środek do leczenia progresji krótkowzroczności opartej na twardówce. Celem pracy jest zbadanie wpływu sieciowania kolagenu twardówki na rozwój krótkowzroczności osiowej wywołanej okluzją osi widzenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zwierzęta były traktowane zgodnie z rezolucją ARVO w sprawie wykorzystywania zwierząt w badaniach. Protokół badania został zatwierdzony przez instytucjonalny Komitet ds. Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (nr zatwierdzenia 022-4598-2; 021211).
1. Przygotowanie do operacji #1
- Zważ i znieczul 13-dniowego białego królika nowozelandzkiego za pomocą domięśniowego wstrzyknięcia chlorowodorku ketaminy 100 mg/ml (100 mg/kg) i chlorowodorku ksylazyny 25 mg/ml (12,5 mg/kg). Dawki te są stosowane ze względu na długość zabiegu chirurgicznego. Zapewnij odpowiedni poziom znieczulenia poprzez brak odruchu bólowego.
- Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika nałóż niewielką ilość maści okulistycznej na nieoperowane oko, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Podczas operacji nałóż 0,9% kropli soli fizjologicznej na operowaną rogówkę oka, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
- Wykonaj trzy pomiary długości osiowej w każdym oku po znieczuleniu miejscowym (chlorowodorek oksybuprokainy 0,4%) za pomocą ultrasonograficznego skanera A, a następnie uśrednij pomiary. Przyłóż sondę prostopadle do centralnej rogówki.
2. Chirurgia #1 - Etap przed sieciowaniem
- Używając chirurgicznych kleszczyków okulistycznych i nożyczek pod okulistycznym mikroskopem operacyjnym, wykonaj 360° peritomię spojówek za pomocą chirurgicznych kleszczy okulistycznych i nożyczek.
- Za pomocą kleszczy kątowych lub haczyka do mięśni zidentyfikuj cztery mięśnie proste zewnątrzgałkowe i odizoluj je za pomocą plecionych jedwabnych szwów nieigłowych 2-0.
UWAGA: Jedwabne szwy pomogą w przesuwaniu kuli ziemskiej w pożądanym kierunku. Gałka oczna jest podzielona na ćwiartki między czterema mięśniami prostymi (cztery ćwiartki).- Zaznacz markerem skóry dwie strefy w każdym kwadrancie, jedną na twardówce równikowej i jedną na tylnej twardówce. Są to strefy napromieniowania.
- Przygotować strzykawkę o pojemności od 3 ml do 5 ml zawierającą 0,1% ryboflawino-5-fosforanu wolnego od dekstranu. Podłączyć strzykawkę do kaniuli łzowej 26 G lub hydrodelineatora stożkowego 25 G.
- Przygotuj urządzenie do naświetlania, które zawiera źródło światła UV A (370 nm) podłączone do skośnego, wykonanego na zamówienie światłowodu. Po pomiarze mocy energetycznej i kalibracji (patrz UWAGA poniżej), ustaw urządzenie na 57 mW/cm².
UWAGA: Kalibracja została przeprowadzona komercyjnie przez producenta. Metoda ta zapewnia całkowitą dawkę światła UVA wynoszącą 57 J/cm². (57 mW/cm2 na 0,2cm2 to 11,4 mW/0,2cm2 przy użyciu 11,4 mW/0,2 cm2 przez 200 sekund to skumulowane obciążenie 2,2 J na 0,2cm2 plamki)
3. Chirurgia #1 – Sieciowanie
- Poruszaj gałką oczną, pociągając jedwabne szwy w kierunku przeciwnym do wybranego kwadrantu, który ma być leczony (np. Podciągnij się i nosowy podczas leczenia dolnego kwadrantu skroniowego). Wykonaj ruch gałki ocznej za pomocą plecionego jedwabnego szwu bezigłowego 2-0, który izoluje każdy mięsień prosty .
- Roztwór fotouczulacza zawierający 0,1% ryboflawiny-5-fosforanu niezawierający dekstranu nanieść na strefę napromieniania na 20 sekund przed rozpoczęciem napromieniania.
- Naświetlić strefę napromieniania za pomocą specjalnie wykonanego światłowodu przez okres naświetlania wynoszący 200 sekund. Zmierz powierzchnię każdej strefy jako 0,2 cm² o promieniu 4 mm.
- Roztwór fotouczulacza zawierający 0,1% niezawierający dekstranu ryboflawiny-5-fosforanu nanosić na strefę napromieniania co 20 sekund podczas 200-sekundowego okresu napromieniania.
UWAGA: Napromienianie i upuszczenie ryboflawiny należy przeprowadzić jednocześnie przez dwóch chirurgów. - Powtórz kroki 3.1-3.4 dla każdego z czterech kwadrantów gałki ocznej.
4. Operacja # 1 - Krok po linkowaniu
- Ogol sierść wokół oka. Przytnij brzegi powieki za pomocą chirurgicznych nożyczek okulistycznych, a następnie delikatnie zszyj górne i dolne powieki za pomocą 4-0 plecionego jedwabiu w kolorze kości słoniowej - 3/8 koła odwrotne cięcie - 13 mm długości igły C-3 (tarsorrhaphy). Pod koniec zabiegu nałóż niewielką ilość maści okulistycznej na brzeg powieki (chloramfenikol 5%).
5. Chirurgia #1 - Opieka pooperacyjna
- Podczas rekonwalescencji zwierzęta należy trzymać pod lampą grzewczą. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.
- Umieść zwierzę w czystej klatce z nową ściółką, aż w pełni wyzdrowieje. Po wyzdrowieniu zwierzę zostanie zwrócone do pomieszczenia dla zwierząt. Zwróć zwierzę matce tylko wtedy, gdy nie śpi.
- W ciągu pierwszych 48 godzin należy zbadać zwierzęta pod kątem ogólnego stanu i objawów choroby lub infekcji. Podać analgezję zgodnie z punktem 1. W razie potrzeby podać środek przeciwbólowy, jeśli zaobserwuje się zmianę w zachowaniu królika. (Metamizol krople 50 mg/kg mc. co 6 godzin).
6. Chirurgia #2
- Pięćdziesiąt pięć dni po zabiegu #1 zważ i znieczul królika za pomocą domięśniowego wstrzyknięcia chlorowodorku ketaminy 100 mg/ml (100 mg/kg) i chlorowodorku ksylazyny 25 mg/ml (12,5 mg/kg).
- Za pomocą chirurgicznych nożyczek okulistycznych pod okulistycznym mikroskopem operacyjnym usuń stęp. Wykonaj trzy pomiary długości osiowej na każdym oku po znieczuleniu miejscowym (chlorowodorek oksybuprokainy 0,4%) za pomocą ultrasonograficznego skanera A, a następnie uśrednij pomiary. Przyłóż sondę prostopadle do centralnej rogówki.
- Poddać króliki eutanazji dootrzewnowym fenobarbitalem sodu (200 mg/1,5 kg masy ciała).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunki 1 i 2 przedstawiają graficznie pomiary długości osiowej w dwóch grupach. Króliki z grupy 1 zostały poddane sieciowaniu twardówki i tarsorafii prawego oka, podczas gdy lewe oko nie było operowane (Rysunek 1). Króliki z grupy 2 zostały poddane jedynie peritomii i tarsorafii prawego oka, podczas gdy lewe oko nie było operowane (Rysunek 2).
W grupie 1, podda...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiamy pierwsze badanie in vivo dotyczące zapobiegania krótkowzroczności osiowej w modelu królika z wykorzystaniem technologii sieciowania ryboflawiną i promieniowaniem UVA. Chociaż w tego typu badaniach można wykorzystać różne zwierzęta laboratoryjne, wybraliśmy króliki głównie ze względu na wielkość oczu i konieczność wykonania sieciowania na powierzchni twardówki.
Stwierdziliśmy, że odsłonięcie twardówki królika oraz zszycie powiek górnych i dolnych jest trudnymi procedurami...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni Pani Dalii Sela i Panu Emi Sharon za ich profesjonalną i doskonałą pracę techniczną w laboratorium.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2-0 Jedwabne szwy plecione bezigłowe | ETHICON | W193 | |
| 4-0 pleciony jedwab kolor kości słoniowej | ETHICON | W816 | |
| 0,1% ryboflawino-5-fosforan bez dekstranu 1 mg:1 ml | Koncepcja dla Pharmacy Ltd | D2-5025 | |
| Źródło światła UV A (370 nm) | O/E LAND Inc | NCSU033B | |
| Skośny światłowód wykonany na zamówienie | Prizmatix Ltd | ||
| Kaniula łzowa 26 G | Beaver-visitec International Sp. z o.o. | ||
| Hydrodelineator stożkowy 25 G [Blumenthal] | Beaver-visitec International Sp. z o.o. | ||
| 13-dniowe króliki | Harlan | 1NZWR40 | |
| Biometr ultradźwiękowy | Allergan-Humphrey | 820-519 | |
| Marker skóry | Devon | 4237101664X |
Bibliografia
- McBrien, N. A., Gentle, A. Role of the sclera in the development and pathological complications of myopia. Prog. Retin. Eye Res. 22, 307-338 (2003).
- Saw, S. M., Gazzard, G., Au Eong, K. -G., Tan, D. T. H. Myopia: attempts to arrest progression. Br. J. Ophthalmol. 86, 1306-1311 (2002).
- Bullimore, M. A., Jones, L. A., Moeschberger, M. L., Zadnik, K., Payor, R. E. A retrospective study of myopia progression in adult contact lens wearers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 2110-2113 (2002).
- Rose, K., Smith, W. E., Morgan, I., Mitchell, P. The increasing prevalence of myopia: implications for Australia. Clin. Exp. Ophthalmol. 29, 116-120 (2001).
- Saw, S. M., Gazzard, G., Shih-Yen, E. C., Chua, W. H. Myopia and associated pathological complications. Ophthal. Physiol. Opt. 25, 381-391 (2005).
- Tano, Y. Pathologic myopia - where are we now. Am. J. Ophthalmol. 134, 645-660 (2002).
- Greene, P. R., Guyton, D. L. Time course of rhesus lid-suture myopia. Exp. Eye Res. 42, 529-534 (1986).
- McBrien, N. A., Norton, T. T. The development of experimental myopia and ocular component dimensions in monocularly lid-sutured tree shrews (Tupaia belangeri). Vision Res. 32, 843-852 (1992).
- McKanna, J. A., Casagrande, V. A. Reduced lens development in lid-suture myopia. Exp. Eye Res. 26, 715-723 (1978).
- Shapiro, A. Experimental visual deprivation and myopia. Doc. Ophthalmol. Proc. Ser. 28, 193-195 (1981).
- Wiesel, T. N., Raviola, E. Increase in axial length of the macaque monkey eye after corneal opacification. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 18, 1232-1236 (1979).
- Weiss, A. H. Unilateral high myopia: optical components, associated factors and visual outcomes. Br J Ophthalmol. 87, 1025-1031 (2003).
- Mechanic, G. Crosslinking of collagen in a heritable disorder of connective tissue: Ehlers-Danlos syndrome. Biochem. Biophys. Res. Com. 47, 267-272 (1972).
- Curtin, B. J., Iwamoto, T., Renaldo, D. P. Normal and staphylomatous sclera of high myopia. An electron microscopic study. Arch. Ophthalmol. 97, 912-915 (1979).
- Liu, K. R., Chen, M. S., Ko, L. S. Electron microscopic studies of the scleral collagen fibre in excessively high myopia. J. Formosan Med. Assoc. 85, 1032-1038 (1986).
- Funata, M., Tokoro, T. Scleral change in experimentally myopic monkeys. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 228, 174-179 (1990).
- McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen cross-linking increases form deprivation myopia in tree shrew. Exp. Eye Res. 59, 475-486 (1994).
- Iomdina, E. N., Daragan, V. A., Ilyina, E. E. Certain biomechanical properties and cross linking of the scleral shell of the eye in progressive myopia. Proceedings of XIVth Congress on Biomechanics. Paris: International Society of Biomechanics. , 616-617 (1993).
- Wollensak, G., Spörl, E., Seiler, T. Riboflavin / ultraviolet-A-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus. Am. J. Ophthalmol. 135, 620-627 (2003).
- Wollensak, G., Spörl, E. Collagencrosslinking of human and porcine sclera. J. Cataract Refract. Surg. 30, 689-695 (2004).
- Wollensak, G., Iomdina, E., Dittert, D. -D., Salamatina, O., Stoltenburg, G. Cross-linking of scleral collagen in the rabbit using riboflavin and UVA. Acta Ophthalmol. Scand. 83, 477-482 (2005).
- Wollensak, G., Iomdina, E. Long-term biomechanical properties of rabbit sclera after collagen crosslinking using riboflavin and ultraviolet (UVA). Acta Ophthalmol. 87, 193-198 (2009).
- Wildsoet, C. F., Norton, T. T. Toward controlling myopia progression. Optom. Vis. Sci. 76, 341-342 (1999).
- Avetisov, E. S., Tarutta, E. P., Iomdina, E. N., Vinetskaya, M. I., Andreyeva, M. I. Nonsurgical and surgical methods of sclera reinforcement in progressive myopia. Acta Ophthalmol. Scand. 75, 618-623 (1997).
- Thompson, F. B. A simplified sclera reinforcement technique. Am. J. Ophthalmol. 86, 782-790 (1978).
- Whitmore, W. G., Curtin, B. J. Scleral reinforcement: two case reports. Ophthalmic Surg. 18, 503-505 (1987).
- Dotan, A., Kremer, I., Livnat, T., Zigler, A., Weinberger, D., Bourla, D. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-A radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
