Artykuł metodologiczny

Czułe wykrywanie proteopatycznej aktywności wysiewu za pomocą cytometrii przepływowej FRET

DOI:

10.3791/53205

⸱

8 grudnia 2015

 ,  , 
1Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfer agregatów białkowych, czyli nasion proteopatycznych z komórki do komórki, może leżeć u podstaw postępu patologii w chorobach neurodegeneracyjnych. W tym miejscu opisano nowatorski test cytometrii przepływowej FRET, który umożliwia specyficzne i czułe wykrywanie aktywności wysiewu z próbek rekombinowanych lub biologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coraz więcej dowodów potwierdza transkomórkową propagację toksycznych agregatów białkowych, czyli nasion proteopatycznych, jako mechanizm inicjacji i postępu patologii w kilku chorobach neurodegeneracyjnych, w tym w chorobie Alzheimera i pokrewnych tauopatiach. Potencjalnie krytyczna rola nasion tau w progresji choroby zdecydowanie potwierdza potrzebę stosowania czułego testu, który z łatwością wykrywa aktywność wysiewu w próbkach biologicznych.

Łącząc specyfikę transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET), czułość cytometrii przepływowej i stabilność monoklonalnej linii komórkowej, opracowano ultraczuły test wysiewu, który jest kompatybilny z wykrywaniem nasion z próbek rekombinowanych lub biologicznych, w tym homogenatów mózgu ludzkiego i myszy. Test wykorzystuje monoklonalne komórki HEK 293T, które stabilnie wyrażają podatną na agregację domenę powtórzeń (RD) tau, w której znajduje się związana z chorobą mutacja P301S połączona z CFP lub YFP, które wytwarzają sygnał FRET po agregacji białka. Wychwyt proteopatycznych nasion tau (ale nie innych białek) do komórek biosensora stymuluje agregację RD-CFP i RD-YFP, a cytometria przepływowa z czułością i ilościowo monitoruje ten wywołany agregacją FRET. Test wykrywa stężenia femtomolowe (ekwiwalent monomeru) rekombinowanych nasion tau, ma zakres dynamiczny obejmujący trzy rzędy wielkości i jest zgodny z homogenatami mózgu myszy transgenicznych z tauopatią i osób badanych tauopatią. Po niewielkich modyfikacjach test może również wykrywać aktywność wysiewu innych nasion proteopatycznych, takich jak α-synukleina, a także jest zgodny z pierwotnymi hodowlami neuronów. Łatwość, czułość i szerokie zastosowanie cytometrii przepływowej FRET sprawia, że jest ona przydatna do badania szerokiego zakresu zaburzeń agregacji białek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nagromadzenie wewnątrzkomórkowych amyloidów tau definiuje tauopatie takie jak choroba Alzheimera. We wczesnych stadiach choroby patologia jest na ogół zlokalizowana w dyskretnych obszarach mózgu, ale wraz z postępem choroby patologia niezmiennie rozprzestrzenia się wzdłuż odrębnych sieci neuronowych1-5. Coraz więcej dowodów sugeruje, że transkomórkowa propagacja toksycznych agregatów białkowych leży u podstaw tej patologii (przegląd w 6-10). W tym modelu nasiona proteopatyczne (np. tau) są uwalniane z komórek dawcy i dostają się do sąsiednich komórek, przekształcając natywne białko tau w nieprawidłowo sfałdowaną formę poprzez szablonową zmianę konformacyjną11-15. Opisany tutaj test został opracowany w celu czułego wykrywania takiej aktywności wysiewu. Jest kompatybilny z rekombinowanymi próbkami białkowymi i biologicznymi oraz umożliwia ilościowe określenie niewielkich poziomów proteopatycznej aktywności siewu16.

Komórki 293T HEK, które stabilnie wyrażają domenę powtórzeń tau (RD) zawierającą związaną z chorobą mutację P301S połączoną z CFP lub YFP (dalej nazywaną komórkami tau-RD-CFP/YFP) służą jako stabilny bioczujnik aktywności wysiewu. W przypadku braku nasion proteopatycznych komórki utrzymują tau jako rozpuszczalny monomer i nie mają znaczącego tła FRET. Spontaniczny wychwyt lub transdukcja nasion tau do komórek za pośrednictwem liposomów powoduje jednak agregację RD-CFP i RD-YFP, która wytwarza sygnał FRET, który jest mierzony w pojedynczych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej.

Wiele elementów tego testu zostało zaprojektowanych w celu zwiększenia czułości i zmniejszenia zmienności. Wybrano monoklonalną linię komórkową o stosunku ekspresji 1:1 RD-CFP/YFP, ponieważ zapewnia ona optymalny stosunek sygnału do szumu. Aby zwiększyć wrażliwość, fosfolipidy są używane do wprowadzania nasion bezpośrednio do komórek (chociaż w celu zbadania biologicznych mechanizmów wychwytu można to pominąć). Wreszcie, cytometria przepływowa monitoruje FRET na poziomie populacji i na poziomie pojedynczej komórki, w przeciwieństwie do innych testów agregacji białek. Miara końcowego wyniku, zintegrowana gęstość FRET, jest wysoce ilościowa i uwzględnia zarówno liczbę komórek z agregacją, jak i stopień, w jakim agregacja zaszła w każdej komórce. Wszystkie te zoptymalizowane parametry zwiększają czułość i zapewniają odtwarzalność.

Ten system został ostatnio wykorzystany w kompleksowym badaniu na transgenicznych myszach z tauopatią P301S17, które oceniało czasowy początek i progresję aktywności wysiewu tau w stosunku do innych powszechnie stosowanych markerów patologicznych tau (np. MC1, AT8, PG5 i Tioflawiny). Aktywność wysiewu jest zdecydowanie najwcześniejszym i najmocniejszym ocenianym markerem patologii tau, poprzedzającym wykrycie histologiczne o co najmniej 6 tygodni. Aktywność wysiewu pojawia się po 1,5 miesiąca i wzrasta stopniowo wraz z wiekiem, co sugeruje przyczynową rolę nasion proteopatycznych w wystąpieniu i/lub progresji neurodegeneracji16.

Precyzyjne oznaczanie ilościowe drobnych poziomów materiału siewnego z próbek biologicznych może ułatwić badania, które monitorują wczesny postęp choroby. Skracając czas trwania badań i umożliwiając wykorzystanie młodszych zwierząt, może to zwiększyć wydajność i dokładność badań przedklinicznych na zwierzętach. Na przykład u wcześniej opisanej myszy P301S związki ołowiu mogły być dostarczane już po 4-6 tygodniach (bezpośrednio przed lub na początku aktywności wysiewu) i monitorowane pod kątem skuteczności 2-4 tygodnie później. Test powinien dokładnie określić ilościowo wszelkie zmniejszenia aktywności wysiewu. Cytometria przepływowa FRET ma również zastosowanie w badaniach przesiewowych in vitro. Na przykład odczynniki anty-tau (np. przeciwciała, małe cząsteczki itp.) można szybko przetestować pod kątem ich zdolności do blokowania indukcji wysiewu bezpośrednio w hodowli, przy użyciu rekombinowanych agregatów tau lub lizatów pochodzących z mózgu jako źródła nasion (ryc. 5). Dzięki tej konfiguracji, po przygotowaniu materiału siewnego, eksperyment trwa zaledwie trzy dni, łącznie z analizą danych. Szybkie określenie ilościowe aktywności siewu proteopatycznego może zatem ułatwić wiele badań nad neurodegeneracją.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Protokół ten kładzie nacisk na zastosowanie cytometrii przepływowej FRET do wykrywania aktywności wysiewu z próbek biologicznych myszy. Jest również kompatybilny z rekombinowanymi włókienkami i ludzkimi próbkami biologicznymi. Eutanazja myszy i pobieranie próbek mózgów przeprowadzono zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez IACUC.

1. Ekstrakcja mózgu

  1. Po głębokim znieczuleniu izofluranem (2%) należy przeprowadzić fuzję myszy za pomocą lodowatego PBS zawierającego 0,03% heparyny i wyekstrahować mózg zgodnie ze szczegółami opisanymi w Gage i wsp.Rozdział 18
  2. Umieść wyekstrahowaną tkankę w kriofiolce i błyskawicznie zamroź, umieszczając w ciekłym azocie. Alternatywnie zamroź tkankę na suchym lodzie. Po zamrożeniu przenieść tkankę do temperatury -80 °C i przechowywać przez dłuższy czas, jeśli to konieczne.
    UWAGA: Ten protokół jest kompatybilny z homogenatami całego mózgu lub mikropreparowanymi obszarami mózgu. Zobacz Hagihara i wsp., aby zapoznać się ze szczegółowym protokołem mikropreparacji19.

2. Przygotowanie biologicznego materiału siewnego

  1. Przygotować bufor homogenizacyjny, rozpuszczając inhibitory proteazy (wolne od EDTA) w 1x TBS (1 tabletka na 10 ml). Energicznie wirować i przechowywać na lodzie. Inhibitory proteazy muszą być wolne od EDTA, aby zachować żywotność komórek biosensorów.
  2. Zważ zamrożoną tkankę mózgową w jednorazowej łódce do ważenia i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 5 ml. Dodać lodowaty bufor homogenizacyjny tak, aby końcowy roztwór miał 10% masy/objętości. Tymczasowo przechowywać na lodzie. Masa tkankowa i późniejsza objętość buforu homogenizacyjnego będą się różnić w zależności od wielkości mózgu i/lub użytych regionów. W tym przypadku dorosły półmózg myszy o wadze 0,2 g jest zawieszony w 2 ml w celu uzyskania 10% w/vol roztworu.
  3. Przenieś próbki do chłodni i dostosuj sonograf sondy do odpowiednich ustawień. W przypadku sonizacji sondy za pomocą Omni Ruptor (pokazanego tutaj), ustaw moc na 20%, co odpowiada około 75 W. Użyj trybu pulsacyjnego, aby upewnić się, że próbki nie są nadmiernie przegrzane podczas sonikacji. Ustaw impulser na 30%, co odpowiada około 500 ms.
  4. Oczyść końcówkę sonikatora sondy, spłukując ją wodą, izopropanolem i ponownie wodą, wycierając sondę pomiędzy każdym roztworem. Pamiętaj, aby wypłukać i wytrzeć zarówno boki, jak i spód sondy chusteczkami laboratoryjnymi.
  5. Pracując z jedną próbką na raz, zanurz końcówkę sondy w buforze homogenizacyjnym i uruchom sonikatór. Korzystając z opisanych powyżej ustawień mocy i pulsera, dostarcz łącznie 25 impulsów. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie w zawiesinie. Na tym etapie należy uważać, aby uniknąć spienienia próbki.
    UWAGA: Próbki są podatne na pienienie, jeśli a) całkowita objętość jest mała lub b) homogenat się nagrzeje. Za pomocą tego konkretnego przyrządu nie należy wykonywać sonikacji o objętościach mniejszych niż 250 μl. Aby zapewnić schłodzenie próbek, na tym etapie probówki mogą być przechowywane na lodzie.
  6. Wyczyść sondę, wycierając resztki lizatu, a następnie wprowadź 10 impulsów do zlewki z czystą wodą. Opłucz boki i spód sondy wodą, izopropanolem i ponownie wodą (jak w kroku 2.4), wycierając do sucha między każdym krokiem. Aby uniknąć zanieczyszczenia, dokładnie przepłucz sondę między próbkami.
    UWAGA: W przypadku kruszyw tau nie stwierdziliśmy, aby konieczne było stosowanie bardziej rygorystycznych metod czyszczenia, aby zapobiec zanieczyszczeniu między próbkami. Inne amyloidy mogą jednak wymagać dodatkowej opieki, która została obszernie opisana w literaturze20,21.
  7. Przechowywać homogenaty na lodzie do czasu, aż wszystkie próbki zostaną przetworzone.
  8. Wirować homogenaty w temperaturze 21 300 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Przenieść supernatant do czystej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Wyrzuć granulkę. Podzielić supernatant na porcje i przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania. Należy jednak unikać cykli zamrażania/rozmrażania homogenatów, ponieważ zmniejsza to wydajność wysiewu.

3. Odtwarzanie komórek biosensora

UWAGA: Użyj czterech linii komórkowych do tego testu: HEK 293T (linia komórkowa #1), RD-P301S-CFP (linia komórkowa #2), RD-P301S-YFP (linia komórkowa #3) i RD-P301S-CFP/YFP (linia komórkowa #4). Proszę zapoznać się z tabelą 1 dla wkładu każdej linii komórkowej w teście.

  1. W sterylnym środowisku odessać pożywkę hodowlaną. Przepłucz komórki ciepłym PBS i aspiruj. Trypsynizować komórki (3 ml trypsyny-EDTA (0,05%)) przez 3 minuty, schłodzić ciepłą pożywką hodowlaną (9 ml DMEM, 10% FBS, 1% pen/strep, 1% GlutaMax) i natychmiast przenieść komórki do stożkowej probówki.
  2. Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w ciepłym pożywce hodowlanej.
  3. Za pomocą hemocytometru określ gęstość komórek dla każdej linii komórkowej. Gęstość komórek będzie się różnić w zależności od konfluencji w czasie zbioru i objętości ponownego zawieszenia. Ponownie zawiesić komórki zebrane z 10-centymetrowego naczynia przy 90% zbiegu w pożywce o objętości 10 ml, aby gęstość komórek wynosiła około 1 miliona komórek/ml.
  4. Wykonaj główną mieszankę komórek + pożywki w taki sposób, aby każda studzienka na płytce 96-dołkowej zawierała 35 000 komórek w pożywce 130 μl (np. Aby uzyskać mieszankę wzorcową na 100 dołków, ponownie zawieś 3,5 miliona komórek w pożywce 13 ml). Zmodyfikuj numer komórki, aby dopasować go do indywidualnych projektów eksperymentalnych i osi czasu. W przypadku leczenia komórek ~ 18 godzin po posianiu dodaj 35 000 komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki.
  5. Używając pipety wielokanałowej, powoli odpipetować 130 μl zawiesiny komórek mieszania głównego do każdego dołka na płaskiej dnie, 96-dołkowej płytki poddanej kulturze tkankowej. Podczas powlekania umieść końcówkę pipety na środku dołka, nie dotykając dna płytki.
    UWAGA: Chociaż format posiewu można modyfikować, zaleca się wykonanie n = 4 dołków dla każdej linii komórkowej 1-3 na płytkę. Pozostała część płytki (n = 84) jest zarezerwowana dla linii komórkowej #4 (komórki biosensora).
  6. Pozwól komórkom osiąść, pozostawiając płytkę w spokoju przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności względnej ≥80%.

4. Leczenie komórek

UWAGA: Następnego dnia, gdy komórki biosensora tau są w 60-65% zlewne, przygotuj kompleksy transdukcji nasion w następujący sposób:

  1. W jednej probówce połącz odczynnik do transfekcji, taki jak Lipofectamina, z pożywką o zredukowanej surowicy, taką jak Opti-MEM, aby uzyskać mieszankę wzorcową. Do każdego dołka dodać 1,25 μl odczynnika do transfekcji i 8,75 μl pożywki o zredukowanej surowicy. Delikatnie przesuń rurkę, aby wymieszać, krótko odwiruj i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. W innej probówce połączyć materiał siewny (podwielokrotność lizatu z kroku 2.9) z pożywką o zredukowanej surowicy.
    UWAGA: Objętość materiału siewnego będzie się różnić w zależności od indywidualnego eksperymentu. Wybierając objętość nasion, należy wziąć pod uwagę: obfitość nasion w próbce i potencjalną toksyczność. Surowe homogenaty mogą być toksyczne dla komórek. W związku z tym użyj najniższej możliwej głośności, aby monitorować pożądany efekt. Wcześniej badane objętości lizatu/studzienki wahają się od 1-5 μl, co odpowiada 5-20 μg białka całkowitego. Upewnij się, że całkowita objętość na studzienkę (nasiona + pożywka o obniżonej surowicy) wynosi 10 μl.
  3. Połączyć zawartość z dwóch probówek opisanych w ppkt 4.1 i 4.2, delikatnie strzepnąć do wymieszania, krótko odwirować (1 000 x g, 5 s) i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut i do 2 godzin.
  4. Delikatnie odpipetować 20 μl kompleksu transdukcyjnego na boku poszczególnych studzienek biosensora. Jeśli to możliwe, należy użyć trzech powtórzeń technicznych. Umieść potraktowane komórki z powrotem w inkubatorze na 24-48 godzin. Inkubować w tych samych warunkach, jak opisano w kroku 3.6.
    UWAGA: Odpowiednim warunkiem kontroli ujemnej dla tej konfiguracji są komórki biosensora potraktowane pustymi liposomami (tj. odczynnikiem liposomowym + pożywką o zmniejszonej surowicy), ponieważ zastosowanie fosfolipidów wprowadza niewielkie przesunięcie profilu fluorescencji w stosunku do komórek biosensorów niewystawionych na działanie odczynnika liposomowego.

5. Pobieranie komórek do cytometrii przepływowej FRET

UWAGA: Przed pobraniem komórek - zazwyczaj 24-48 godzin po zabiegu - możliwe jest uzyskanie wstępnego odczytu aktywności wysiewu za pomocą filtra GFP na standardowym odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym. Komórki traktowane bez materiału siewnego (tj. Puste liposomy) będą wykazywać rozproszoną fluorescencję, podczas gdy komórki traktowane materiałem siewnym będą wykazywać intensywne punktowe i siatkowate wtrącenia wewnątrzkomórkowe (ryc. 1A-B).

  1. Za pomocą pipety wielokanałowej odessać pożywkę komórkową (150 μl). Trypsynizować (50 μl) komórki przez 5 minut i schłodzić 150 μl schłodzonej pożywki hodowlanej. Na tym etapie nie należy włączać płukania PBS przed trypsynizacją, ponieważ może to spowodować podnoszenie komórek, a następnie ich utratę. Wyklucz wszelkie zanieczyszczające martwe komórki i zanieczyszczenia podczas cytometrii przepływowej za pomocą strategii bramkowania.
  2. Natychmiast po schłodzeniu przenieść komórki na 96-dołkową okrągłą płytkę denną i odwirować przy 1,000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Odessać i wyrzucić pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
  4. Delikatnie, ale dokładnie, ponownie zawieś osad komórkowy w 50 μl 2% paraformaldehydu i inkubuj przez 10 minut. Alternatywnie, uruchom komórki na żywo, chociaż utrwalenie zapewnia czystsze i bardziej spójne wyniki.
  5. Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i wyrzucić paraformaldehyd, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
  6. Delikatnie, ale dokładnie, ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl schłodzonego buforu cytometrii przepływowej (HBSS, 1% FBS, 1 mM EDTA) i uruchomić płytkę tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć zbrylania się komórek.

6. Cytometria przepływowa FRET

UWAGA: Użyj cytometru przepływowego, takiego jak MACSQuant VYB, który jest wyposażony w linie laserowe kompatybilne z FRET i zestawy filtrów (Tabela 2). Dla każdego kroku w tej sekcji kliknij interesującą Cię studnię, korzystając z szablonu 96 studni oprogramowania, a następnie kliknij "odtwórz", aby rozpocząć pobieranie i przepływ próbki. Twórz wykresy lub tabele statystyczne, klikając ikonę "nowe okno analizy". Parametry osi na poszczególnych wykresach dwuwymiarowych można zmienić, klikając tytuł na osi X lub Y i wybierając odpowiedni filtr. Aby przesunąć populacje komórek lub sygnały fluorescencyjne, zwiększ lub zmniejsz napięcia związane z odpowiednimi filtrami. Za pomocą tego urządzenia można uruchomić <1 000 zdarzeń na sekundę, aby zapewnić dokładne monitorowanie pojedynczej komórki.

  1. Wykonaj wykres dwóch zmiennych Side Scatter Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Area (FSC-A) i przy uruchomionej linii komórkowej #1 dostosuj napięcia SSC i FSC, aż populacja komórek znajdzie się w lewym dolnym kwadrancie. Kliknij narzędzie wielokąta i zdefiniuj populację komórek (Bramka P1). Aby zapoznać się ze wszystkimi parametrami bramkowania, patrz rysunek 2.
  2. Utwórz wykres dwuwymiarowy FSC-H (wysokość) i FSC-A i zastosuj bramkę P1 do tego wykresu, klikając "na żywo" nad wykresem i wybierając P1. Gdy uruchomiona jest linia komórkowa #1, kliknij narzędzie wielokąta i zdefiniuj pojedyncze komórki (bramka P2).
  3. Wykonaj 3 wykresy histogramu, po jednym dla każdego z interesujących filtrów: CFP, YFP i FRET. Zastosuj bramkę P2 do wszystkich tych działek, klikając "na żywo" nad działkami i wybierając P2. Przy uruchomionej linii komórkowej #1 dostosuj napięcia tak, aby mediana populacji komórek w histogramach CFP, YFP i FRET mieściła się w zakresie od 0 do 1. Aby zmierzyć CFP i FRET, należy wzbudzić komórki za pomocą lasera 405 nm i wychwycić fluorescencję za pomocą filtra odpowiednio 450/50 nm i 525/50 nm. Aby zmierzyć YFP, wzbudz komórki laserem o długości 488 nm i wychwyć fluorescencję za pomocą filtra 525/50 nm. Ustawienia lasera i filtra są bardziej szczegółowo opisane w tabeli 2.
  4. Wykonaj kompensację rozlania się CFP na kanały FRET i YFP.
    UWAGA: Kompensacja to proces korekcji rozlewu fluorescencji. Rozlanie się fluorescencji występuje, gdy emisja fluorescencji jednego fluorochromu zostanie wykryta w filtrze przeznaczonym do pomiaru sygnału z innego fluorochromu. Przy odpowiedniej kompensacji fluorescencja rozlewowa CFP może zostać usunięta z kanałów FRET i YFP.
    UWAGA: Kompensacja wymaga obecności zarówno komórek fluorescencyjnych -dodatnich, jak i -ujemnych. Tak więc, aby skompensować na komórkach CFP-dodatnich (linia komórkowa #2), komórki ujemne (linia komórkowa #1) muszą zostać dodane do próbki przed serią.
    1. Skok 30 μl zawiesiny linii komórkowej #1 z pojedynczego dołka do 200 μl zawiesiny linii komórkowej #2 bezpośrednio przed kompensacją.
    2. Kliknij ikonę "Ustawienia instrumentu", a następnie zakładkę "kompensacja" i zaznacz "matryca", aby otworzyć tabelę wynagrodzeń.
    3. Utwórz wykres dwuwymiarowy FRET-A i CFP-A i zastosuj bramkę P2, jak opisano w kroku 6.3. Przy uruchomionych liniach komórkowych 1 + 2 kliknij ikonę "kwadrantu" i narysuj ćwiartki tak, aby populacje fluorescencji -ujemne i -dodatnie były oddzielone dwoma dolnymi kwadrantami (odpowiednio Gates LL3 i LR3).
    4. Utwórz tabelę statystyk, która wyświetla medianę intensywności fluorescencji (MFI) FRET dla bramek LL3 i LR3. Dostosuj parametr FRET w macierzy kompensacji, aż MFI sygnału FRET będzie równoważne między LL3 i LR3. Po tym kroku MFI sygnału FRET jest równe między komórkami niebarwionymi a komórkami CFP-dodatnimi, co sugeruje brak rozlewania się CFP do kanału FRET.
    5. Utwórz wykres dwuwymiarowy YFP-A i CFP-A i zastosuj bramkę P2, zgodnie z opisem w kroku 6.3. Narysuj ćwiartki (LL4 i LR4) podobnie jak w kroku 6.4.3.
    6. Utwórz tabelę statystyczną, która wyświetla MIF YFP dla LL4 i LR4. Dostosuj parametr YFP w macierzy kompensacji, aż MFI sygnału YFP będzie równoważne między LL4 i LR4. Po tym kroku MFI sygnału YFP jest równy między komórkami niebarwionymi a komórkami dodatnimi CFP, co sugeruje brak rozlania się CFP do kanału YFP.
  5. Po ustawieniu bramki i kompensacji zaznacz interesujące Cię studnie i uruchom pozostałą część płytki.
  6. Po uruchomieniu wszystkich próbek wyeksportuj pliki danych, klikając "plik", a następnie "kopiuj". Wybierz zakładkę "pliki danych", zaznacz folder eksperymentu i kliknij "kopiuj".

7. Analiza danych

UWAGA: Zmień parametry osi na poszczególnych wykresach dwuwymiarowych, klikając tytuł na osi X lub Y i wybierając odpowiedni filtr.

  1. Otwórz pliki FCS w programie do analizy cytometrii przepływowej.
  2. Opierając się na właściwościach rozproszenia, użyj bramki wielokątnej, aby zdefiniować populację komórek (SSC vs FSC) i populację singletów (FSC-H vs FSC-A) z komórek potraktowanych pustymi liposomami, podobnie jak opisano w sekcji 6.
  3. Jeśli kompensacja CFP została wykonana podczas konfiguracji, nie należy dalej dostosowywać CFP.
  4. Utwórz wykres dwóch zmiennych FRET i YFP. Korzystając z linii komórkowej #3, zdefiniuj fałszywą bramkę FRET, rysując bramkę wielokątną, która biegnie wzdłuż zbocza populacji komórek FRET-dodatnich. Ta bramka wyklucza pojedyncze dodatnie komórki YFP, które emitują sygnał w filtrze FRET i jest rysowana podobnie jak wcześniej pokazana przez Banninga i wsp.22 Rozdział 22
  5. Zdefiniuj bramkę FRET, wykreślając puste komórki CFP/YFP poddane działaniu liposomów na wykresie dwuwymiarowym FRET vs CFP. Wprowadź wielokątną bramę wzdłuż nachylenia populacji, która rozciąga się w górę i w lewo od populacji. Ta bramka powinna wykluczyć większość komórek (~99%), tak aby tło FRET stanowiło ≥1% komórek. Wszystkie zdarzenia, które przesuwają się do tej bramki, są uważane za FRET-dodatnie.
    UWAGA: Każda pojedyncza bramka opisana powyżej jest nakładana na wszystkie próbki przed skonstruowaniem kolejnych bramek. Po analizie definiowane są cztery indywidualne bramki (Populacja komórek; singlet; fałszywy FRET; FRET).
  6. Rejestruj interesujące parametry analizy, w tym: procentową dodatniość FRET i MFI komórek FRET-dodatnich. Ręcznie oblicz zintegrowaną gęstość FRET, mierząc iloczyn procentu dodatniości i MFI.
    UWAGA: Jeśli jako miara wyniku używana jest zintegrowana gęstość FRET, należy ustawić tło FRET (zgodnie z definicją w kroku 7.5) i MIF na wartość większą lub równą 1, aby uniknąć obliczania iloczynu, który jest mniejszy niż jego dwa indywidualne czynniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria przepływowa FRET umożliwia czułe, ilościowe i szybkie wykrywanie aktywności wysiewu z próbek rekombinowanych lub biologicznych. Konfiguracja testu jest łatwa: stabilne linie komórkowe pochodzące z monoklonalnego wykazu ekspresji tau-RD-CFP / YFP są transdukowane materiałem siewnym, inkubowane przez 24-48 godzin i poddawane analizie cytometrii przepływowej (Figura 1A). W przypadku braku nasion komórki biosensora utrzymują tau w rozpuszczalnej, monomerycznej formie (ryc. 1B). Je...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj system cytometrii przepływowej FRET jest potężnym narzędziem do szybkiej i ilościowej oceny aktywności wysiewu tau. Wymaga jedynie umiarkowanego doświadczenia w hodowli komórkowej i praktycznej wiedzy na temat FRET i cytometrii przepływowej. Inne testy wysiewu, takie jak tioflawina T - która wykazuje zwiększoną fluorescencję po związaniu ze strukturą arkusza beta - są pracochłonne i wymagają czystego, rekombinowanego substratu białkowego. Dodatkowo, testy wysiewu in vitro dla tau są tylko półilości...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten test został licencjonowany przez Janssen Pharmaceuticals.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Konsorcjum Tau (M.I.D); Grant Narodowych Instytutów Zdrowia 1R01NS071835 (M.I.D.), grant Departamentu Obrony PT110816 (dla M.I.D.), 1F32NS087805 (dla J.L.F.) i 1F31NS079039 (dla B.B.H.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TBSSigmaT5912
cOmcomplete Inhibitory proteazy (wolne od EDTA)Roche4693159001
KriofiolkiSarstedt72.694.006
Waga analitycznaŁodzie wagowe Mettler ToledoXSE 105DU
Fisher Scientific13-735-743
15 ml rurka stożkowaUSA Scientific1475-0501
Homogenizator ultradźwiękowy Omni Sonic RuptorOmni International18-000-115
Mikrokońcówka do homogenizatora ultradźwiękowegoOmni InternationalOR-T-156
2-propanolFisher ScientificA451
Nauszniki przeciwhałasowe z redukcją szumówFisher Scientific19-145-412
Chusteczki KimwipesFisher ScientificS47299
Probówki 1,5 mlUSA Scientific1615-5510
Mikrowirówka Eppendorf5424 000.215
DPBSLife Technologies14190-136
DMEMLife Technologies11965-084
Hyklon płodowej surowicy bydlęcejSH30071.03
Penicylina-StreptomycynaLife Technologies15140-122
GlutaMaxLife Technologies35050-061
Trypsin-EDTALife Technologies25300-054
50 ml Probówki stożkowePhenix ResearchSS-PH15
25 ml odczynnikiVWR41428-954
Pikulator wielokanałowyFisher ScientificTI13-690-049
96-dołkowe płaskie płytkidenne Corning3603
Opti-MEMLife Technologies31985-070
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
96 dołkowe okrągłe płytki denneCorning3788
16% paraformaldehydowamikroskopia elektronowa SciencesRT 15710
PBSSigma-AldrichP5493
EDTASigma-AldrichED2SS
HBSSLife Technologies14185-052
Wirówka Sorvall ST 40Thermo Scientific 75004509
BIOLiner Wahadłowy wirnik kubełkowyThermo Scientific75003796
HemacytometrVWR15170-172
MACSQuant VYB Flow CytomterMiltenyi Biotec130-096-116
Chill 96 RackMiltenyi Biotec130-094-459
Oprogramowanie do analizy Flow Jo
20 μ l końcówki do pipetRaininGPS-L10
200 μ l końcówki do pipetRaininGPS-250
Końcówki do pipet 1 mlRaininGPS-1000
200 μ l końcówki do pipetUSA Scientific1111-1800
5 ml pipeta serologicznaPhenix ResearchSPG-606180
10 ml pipeta serologicznaPhenix ResearchSPG-607180
25 ml pipeta serologicznaPhenix ResearchSPG-760180

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
  2. Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
  3. Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
  4. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
  5. Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
  6. Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).
  7. Holmes, B. B., Diamond, M. I. Cellular mechanisms of protein aggregate propagation. Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).
  8. Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
  9. Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
  10. Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
  11. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  12. Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
  13. Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
  14. de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
  15. Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302(2012).
  16. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.
  17. Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
  19. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
  20. Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
  21. McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
  22. Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344(2010).
  23. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochemistry. , (2013).
  24. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

FRET Flow CytometryProteopathic SeedingTau AggregationBiosensor CellsFlow Cytometry AnalysisFluorescence CompensationSeeding Activity DetectionRecombinant Tau SeedsBrain HomogenatesHEK 293T Cells

Powiązane artykuły