Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie naczyń mózgowych myszy

24.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53208

⸱

10 listopada 2015

 ,  ,  , 
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie, Université Paris Diderot

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół pozwalający na oczyszczenie przedziału naczyniowego mózgu myszy. Izolowane naczynia mózgowe obejmują komórki śródbłonka połączone ścisłymi połączeniami i otoczone ciągłą blaszką podstawną, perycyty, komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych, a także okołonaczyniowe błony astroglejowe.

Streszczenie

W mózgu, większość układu naczyniowego składa się z selektywnej bariery, bariery krew-mózg (BBB), która reguluje wymianę cząsteczek i komórek odpornościowych między mózgiem a krwią. Co więcej, ogromne zapotrzebowanie metaboliczne neuronów wymaga regulacji przepływu krwi z chwili na chwilę. Warto zauważyć, że nieprawidłowości tych regulacji są etiologicznymi cechami charakterystycznymi większości patologii mózgu; w tym glejak, udar, obrzęk, padaczka, choroby zwyrodnieniowe (np. choroba Parkinsona, choroba Alzheimera), guzy mózgu, a także stany zapalne, takie jak stwardnienie rozsiane, zapalenie opon mózgowych i dysfunkcje mózgu wywołane posocznicą. W związku z tym zrozumienie zdarzeń sygnalizacyjnych modulujących fizjologię naczyń mózgowych jest poważnym wyzwaniem. Wiele informacji na temat właściwości komórkowych i molekularnych różnych typów komórek tworzących układ naczyniowo-mózgowy można uzyskać dzięki hodowli pierwotnej lub sortowaniu komórek ze świeżo zdysocjowanej tkanki mózgowej. Jednak właściwości takie jak polaryzacja komórek, morfologia i relacje międzykomórkowe nie są w takich preparatach zachowane. Protokół, który tutaj opisujemy, ma na celu oczyszczenie fragmentów naczyń mózgowych przy jednoczesnym zachowaniu integralności strukturalnej. Pokazujemy, że izolowane naczynia składają się z komórek śródbłonka uszczelnionych ścisłymi połączeniami, które są otoczone ciągłą blaszką podstawną. Perycyty, komórki mięśni gładkich, a także błony końcowe astrocytów okołonaczyniowych pozostają połączone z warstwą śródbłonka. Na koniec opisujemy, jak przeprowadzać eksperymenty barwienia immunologicznego na oczyszczonych naczyniach mózgowych.

Wprowadzenie

Prawidłowe funkcjonowanie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) wymaga wysoce regulowanego środowiska zewnątrzkomórkowego, a jego wymagania metaboliczne są ogromne w porównaniu z innymi narządami1. Ośrodkowy układ nerwowy jest również niezwykle wrażliwy na szeroką gamę substancji chemicznych, na ogół nieszkodliwych dla narządów obwodowych, ale dla niego neurotoksycznych. Aby zapewnić prawidłowe funkcjonowanie, większość układu naczyniowego OUN tworzy barierę śródbłonkową; bariera krew-mózg (BBB), która kontroluje przepływ cząsteczek i jonów, a także przechodzenie komórek odpornościowych między krwią a mózgiem, utrzymując w ten sposób prawidłową homeostazę2, ale także ograniczając przedostawanie się leków terapeutycznych, utrudniając w ten sposób leczenie zaburzeń neurologicznych3. Na poziomie komórkowym bariera krew-mózg jest utrzymywana głównie przez rozległe ścisłe połączenia między komórkami śródbłonka, spolaryzowaną ekspresję transporterów wypływu i bardzo niski wskaźnik transcytozy4. Właściwości i funkcje bariery krew-mózg są w większości indukowane przez sąsiednie komórki4. W szczególności perycyty odgrywają ważną rolę w indukowaniu i utrzymywaniu bariery krew-mózg5,6. Będąc komórkami kurczliwymi, perycyty regulują również przepływ krwi7, podobnie jak komórki mięśni gładkich otaczające duże naczynia. Wreszcie, astrocyty, główne komórki glejowe mózgu, wysyłają duże procesy zwane końcami stóp wokół większości naczyń krwionośnych mózgu8 i modulują integralność BBB i spokój immunologiczny9, transfer metabolitów do neuronów10 i indukują ścisłe sprzężenie między aktywnością neuronów a przepływem krwi11,12.

Możliwość badania molekularnych i komórkowych właściwości układu naczyniowo-mózgowego jest kluczowa dla lepszego scharakteryzowania jego wkładu w fizjologię mózgu i fizjopatologię. Aby odpowiedzieć na to pytanie, opracowano strategie izolowania układu naczyniowo-mózgowego mózgu, które pozwalają na przygotowanie nienaruszonych fragmentów naczyń mózgowych. Oczyszczanie naczyń mózgowych zostało początkowo opisane przy użyciu mózgów bydlęcych13 i zostało ulepszone i dostosowane do innych gatunków, w szczególności gryzoni14. W tym ostatnim badaniu wprowadzono stosowanie filtrów o różnej wielkości w celu rozdzielenia naczyń mózgowych na frakcje wzbogacone w naczynia o różnych średnicach. Co ciekawe, w takich preparatach komórki śródbłonka zachowywały swoje właściwościmetaboliczne15, funkcjonalnośćtransportera16 i polaryzację17. W tym miejscu szczegółowo opisujemy ten protokół i dalej wykazujemy, że izolowane naczynia zachowują większość swoich struktur in situ. Komórki śródbłonka pozostają połączone ścisłymi połączeniami i otoczone ciągłą blaszką podstawną. Perycyty i komórki mięśni gładkich pozostają przyczepione do warstwy śródbłonka, a także do okołonaczyniowych błon astrocytów. Jednak astrocyty, komórki mikrogleju, neurony i oligodendrocyty są eliminowane. Na koniec opisujemy procedurę barwienia immunologicznego na izolowanych naczyniach mózgowych.

Do tej pory większość badań molekularnych i komórkowych dotyczących układu naczyniowo-mózgowego była przeprowadzana na oczyszczonych komórkach naczyń mózgowych zdysocjowanych przez sortowanie komórek za pomocą specyficznych dla komórek szczepów myszy reporterowych lub procedur opartych na barwieniu immunologicznym18,19. Chociaż techniki te pozwalają na izolację prawie czystych populacji komórek naczyniowo-mózgowych, izolowane komórki całkowicie tracą swoją morfologię i interakcje in situ, co z kolei znacznie wpływa na ich właściwości molekularne i komórkowe. Opisany tutaj protokół, pozwalający na izolację całych fragmentów naczyń mózgowych bez potrzeby stosowania specyficznych przeciwciał lub transgenicznych barwników myszy, stanowi dobrą alternatywę, ponieważ ogólna struktura izolowanych naczyń mózgowych jest zachowana, co zmniejsza wpływ na ich właściwości molekularne. Wyizolowane naczynia mogą być następnie wykorzystane do badania aktywności genów, syntezy białek i regulacji w BBB, jak opisano niedawno20,21. Wreszcie, w porównaniu z mikrodysekcjąlaserową 22,23, obecny protokół jest niedrogi, łatwy do wykonania i szybko adaptowalny w każdym laboratorium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Rozwiązania i materiały

  1. Przygotować roztwory naczyń izolacyjnych: B1, dodać 1,5 ml HEPES 1M do 150 ml HBSS; B2, dodać 3,6 g dekstranu do 20 ml B1; B3, dodać 1 g BSA do 100 ml B1.
  2. Zmodyfikuj uchwyt filtra, odcinając dolną część górnej części śrubowej.
  3. Przygotować roztwory immunobarwiące: roztwór utrwalający, 4% paraformaldehyd o pH PBS 7,4; Roztwór przepuszczalny/blokujący, rozcieńczyć surowicę kozią do 5% i Triton X100 do 0,25% w PBS pH 7,4,
    Uwaga: Utrwalenie zależy od rodzaju zastosowanych przeciwciał pierwotnych.

2. Sekcja

Uwaga: Sterylne warunki nie są wymagane, chyba że naczynia są używane do celów hodowli komórek.

  1. Przygotować zlewkę o pojemności 150 ml z 20 ml witaminy B1. Przechowywać na lodzie i przykryć parafilmem, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza.
  2. Głęboko znieczul mysz pod kapturem małym ręcznikiem papierowym nasączonym 1 ml czystego izofluranu, który dodaje się do klatki. Znieczulenie weryfikuje się brakiem reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Zabij mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
    UWAGA: Kroki te są wykonywane zgodnie z przepisami krajowymi i instytucjonalnymi.
  3. Opcjonalnie: Wykonać perfuzję dosercową z użyciem 20 ml PBS 1x w celu wyeliminowania zawartości krwi24.
  4. Przekrój skórę skalpelem od szyi do nosa i odciągnij ją. Usuń wszystkie zanieczyszczające włoski za pomocą PBS 1x.
  5. Aby otworzyć czaszkę, najpierw włóż nożyczki z przodu do opuszki węchowej i otwórz nożyczki, aby rozerwać czaszkę na dwie części.
  6. Ostrożnie usuń mózg za pomocą szpatułki do mózgu. Wyciąć splot naczyniówkowy z komór bocznych, ponieważ mogłyby one zanieczyścić preparat naczyń krwionośnych38,
    UWAGA: Opcjonalnie: Końcowe przygotowanie będzie zawierało naczynia miąższowe i oponowe. Jeśli nie jest to pożądane, opony mózgowe można odkleić zgodnie z procedurą opisaną w 38.
  7. Przenieś mózg do zlewki zawierającej roztwór witaminy B1 na lodzie. Jednocześnie można leczyć do 8 mózgów.

3. Homogenizacja tkanki mózgowej

  1. Za pomocą dwóch skalpeli ręcznie i energicznie ubij mózg w roztworze B1, uzyskując następnie małe kawałki o wielkości około 2 mm.
  2. Homogenizuj preparat za pomocą automatycznego homogenizatora Dounce, wykonując 20 uderzeń przy 400 obr./min. Upewnij się, że szklana rurka jest utrzymywana w lodzie i że górna część leżaczka jest w roztworze podczas poruszania się w górę iw dół, aby zapobiec tworzeniu się kieszeni powietrznych. Jeśli przygotowanych jest kilka próbek, umyj leżaczek wodą jonizowaną między każdą homogenizacją.

4. Oczyszczanie naczynia

  1. Przenieść homogenat do plastikowej probówki o pojemności 50 ml i przystąpić do wirowania w temperaturze 2 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na górze osadu naczynia utworzy się duży biały interfejs (głównie mielina) (czerwony, jeśli nie przeprowadzono perfuzji).
  2. Odrzucić supernatant. Osad naczynia i biały interfejs pozostaną ze sobą połączone. Dodać 20 ml lodowatego roztworu witaminy B2 i ręcznie i energicznie wstrząsać probówką przez 1 minutę.
  3. Przystąpić do drugiego wirowania w temperaturze 4 400 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Mielina utworzy teraz gęstą białą warstwę na powierzchni supernatantu.
  4. Ostrożnie oderwij warstwę mieliny od ścianek rurki, przytrzymując rurkę i powoli ją obracając, aby supernatant mógł przejść wzdłuż ścianek. Odrzucić mielinę z supernatantem. Osad zawierający naczynia pozostaje przymocowany na dnie tuby.
  5. Wytrzyj wewnętrzną ściankę probówki chłonnym papierem owiniętym wokół plastikowej pipety o pojemności 5 ml i usuń wszystkie pozostałe płyny, unikając dotykania osadu w naczyniu. Trzymaj probówkę do góry nogami na chłonnym papierze, aby spuścić pozostały płyn.
  6. Zawiesić osad w 1 ml lodowatego roztworu witaminy B3, pipetując w górę i w dół za pomocą końcówek o niskim poziomie wiązania, utrzymując probówkę na lodzie, a następnie dodać kolejne 5 ml roztworu witaminy B3. Upewnij się, że naczynia są jak najbardziej rozproszone i nie tworzą agregatów.

5. Filtracja

  1. Przygotować zlewkę na lodzie z 30 ml lodowatego roztworu witaminy B3. Przykryj parafilmem, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza.
  2. Umieścić filtr o siatce 20 μm na zmodyfikowanym uchwycie filtra na górze kolby Beckera i zrównoważyć, nakładając 10 ml lodowatego roztworu B3
    3. .
  3. Wylej preparat naczyniowy na filtr i przepłucz naczynia 40 ml lodowatego roztworu B3.
  4. Odzyskać filtr za pomocą czystych kleszczyków i natychmiast zanurzyć go w zlewce zawierającej roztwór B3. Odłącz naczynia od filtra, delikatnie nim potrząsając.
  5. Wlać zawartość zlewki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować w temperaturze 2 000 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Uwaga: Alternatywnie, zawiesinę naczyń mózgowych z kroku 4.6 można przefiltrować do filtra o siatce 100 μm. W tym przypadku większe naczynia są preferencyjnie zatrzymywane na filtrze, podczas gdy przepływowy zawiera mikronaczynia (głównie kapilary), które są następnie filtrowane na filtrze o siatce 20 μm, jak powyżej.
  7. Zawiesić osad mikronaczyń w 1 ml lodowatego roztworu B3 i przenieść go pipetując do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 2 000 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

6. Utrwalenie, przepuszczalność i blokowanie

  1. Przenieść naczynia przez pipetowanie do 0,2 ml probówek PCR zawierających PBS przy użyciu końcówki o niskim stopniu wiązania 1,0 ml. Uważaj, aby nie dotykać naczyń, ponieważ mogą one przylegać do zewnętrznej części końcówki. Wykonaj wszystkie poniższe czynności pod mikroskopem dwuokularowym.
  2. W przypadku każdej z poniższych zmian podłoża należy pozostawić probówki na lodzie, aż naczynia osiągną dno, a następnie odpipetować większość płynów za pomocą długich końcówek do pipet z żelem.
  3. Usunąć większość PBS i dodać 200 μl roztworu utrwalającego. Zawiesić naczynia przez delikatne wstrząsy i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Odpipetować roztwór utrwalający i zastąpić go 200 μl 1x PBS (pierwsze płukanie), inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i powtórzyć ten krok 3 razy. Za każdym razem sprawdź, czy naczynia prawidłowo opadły na dno probówek i odpipetuj 1x PBS, upewniając się, że naczynia nie są dotykane.
  5. Po ostatnim płukaniu zastąpić 1x PBS roztworem przepuszczalnym/blokującym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, ponownie zawieszając naczynia, delikatnie potrząsając od czasu do czasu.

7. Barwienie immunologiczne

  1. Zastąpić roztwór do permeabilizacji/blokowania mieszaniną przeciwciał pierwszorzędowych (patrz odniesienia do zastosowanych tutaj przeciwciał i rozcieńczenia w tabeli szablonu materiałów) rozcieńczonych w roztworze do permeabilizacji/blokowania i inkubować w temperaturze 4 °C O/N.
  2. Po 3 przemyciach w PBS w temperaturze pokojowej należy inkubować naczynia z mieszaniną przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Uwaga: zdecydowanie zalecamy wykonanie barwienia jądrowego za pomocą Hoechst (1:2,000) lub DAPI (1:2,000) w celu odróżnienia naczyń od ewentualnych zanieczyszczających włosów lub pyłów pod mikroskopem.
  4. Po 3 płukaniach w PBS ponownie zawiesić naczynia w 50 μl PBS.

8. Montaż i obserwacja

  1. Przygotuj końcówkę z kapilarą ze szkła silikonowanego: odetnij końcówkę pipety P200 za pomocą skalpela i wyreguluj kapilatę wewnątrz. Przybliżona objętość kapilary wynosi 40 μl.
  2. Przenieś naczynia do szkiełka za pomocą kapilary ze szkła silikonowanego i ostrożnie usuń płyn kawałkiem chłonnego papieru.
  3. Nałóż pojedynczą kroplę podłoża montażowego na naczynia i przytrzymaj szkiełko nakrywkowe pod kątem 45º, pozwalając kropli rozprowadzić się wzdłuż krawędzi płytki. Odpuścić szkiełko nakrywkowe i pozwolić pożywce powoli się rozprowadzać. Pozostaw do wyschnięcia O/N w temperaturze RT z ochroną przed światłem. Naczynia można obserwować pod fluorescencyjnym mikroskopem konfokalnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy opisujemy protokół umożliwiający mechaniczną izolację naczyń mózgowych14. Rycina 1 podsumowuje główne etapy tej techniki. Architektura naczyń mózgowych jest złożona i obejmuje kilka typów komórek, t.j. komórki śródbłonka uszczelnione przez połączenia ścisłe i otoczone perycytami, komórkami mięśni gładkich oraz wypustkami stóp astrocytów9. W związku z tym, po izolacji naczyń mózgowych, dążyliśmy do scharakteryzowania struktury oczyszczonych naczyń za pomoc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Bariera krew-mózg reguluje przepływ substancji fizjologicznych do i z OUN oraz chroni go przed potencjalnie szkodliwymi substancjami obecnymi we krwi. Bierze udział w kilku patologiach OUN, w tym chorobach neurodegeneracyjnych2 i guzach mózgu28. Bardzo aktywnym polem badań jest wyjątkowo niska przepuszczalność bariery krew-mózg, utrudnia również przechodzenie środków terapeutycznych ukierunkowanych na komórki nerwowe oraz opracowywanie metod mających na celu odwracalne otwarcie bariery krew-mózg bez...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Labex MemoLife i ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose en plaques)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Młynek do tkanek Rozmiar CThomas scientific3431E25
5415  RWirówka Eppendorf
5810 REppendorf5811000320
Wysokowydajny, modułowy mikroskop stereoskopowyLeicaMZ6
Kompaktowy system zapewnia wysoką jakość Leica LED1000Końcówki LeicaLED1000
o niskim poziomie wiązania (P1000)Sorenson BioScience14200T
Swinnex 47 mm PP 8/PkMilliporeSX0004700
Nylonowa siatka filtracyjna Hydrofilowa 20 &mikro; m 47 mm 100/PkMiliporeNY2004700
z siatki nylonowej Hydrofilowa 100 µ m 47 mm 100/PkMiliporeNY1H04700
Standardowa ścianka rurki borokrzemianoweSutter InstrumentB150-86-7.5
Szkiełka mikroskopoweThermo Scientific1014356290F
Szkiełka nakrywkowe, grubość 1Thermo ScientificP10143263NR1
0,2 ml Probówki cienkościenne z nakrętką kopułowąThermo ScientificAB-0266
  PARAFILM M (rozmiar rolki 4 cale i czasy; 125 stóp)SigmaP7793-1EA
HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowejTechnologia życia14175-129
HEPES (1M)Technologia życia15630056
Dekstran z Leuconostoc spp. Pan ~70,000Sigma31390
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA2153
10x PBSEuromedexET330
16% Formaldehyd (w/v), bez metanolu Thermo Scientific28908
Triton X-100SigmaX100
trichlorowodorek bisBenzimide H 33342 (Hoechst)Sigma14533
Podłoże montażowe Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Izolektyna GS-IB4 Z Griffonia simplicifolia, koniugat Alexa Fluor 488; Rozcieńczenie 1/100Life technologyI21411
Agrin (królik) ; rozcieńczenie 1/400uprzejmie dostarczone przez Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mysz, klon 1A12)Technologia życia33-9100rozcieńczenie 1:500
Aktyna przeciw mięśniom gładkim (mysz, klon 1A4)SigmaA2547  rozcieńczenie 1:500
Anti GFAP (mysz, klon GA5)SigmaG3893  rozcieńczenie 1:500
Anti AQP4 (królik)SigmaA5971  rozcieńczenie 1:500
Anti Cx43 (mysz, klon  2)BD Biosciences610061  rozcieńczenie 1:500
Anti Olig2 (królik)MilliporeAB9610  rozcieńczenie 1:200
Anti NF-M (mysz)dostarczone przez dr Beat M. Riederer, Uniwersytet w Lozannie, Szwajcaria.  rozcieńczenie 1:10
Anti Iba1 (królik)Wako019-19741  rozcieńczenie 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Technologiażyciaprzeciwciał A11029  rozcieńczenie 1:2,000
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) Przeciwciało drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 488Technologia życiaA11034  rozcieńczenie 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Przeciwciało Technologia życiaA21424  rozcieńczenie 1:2,000
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Przeciwciało drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 555Technologia życiaA21429  Rozcieńczenie 1:2,000
Wirówka Uchwyt filtra Tarcza filtracyjna

Bibliografia

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745(1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741(2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9(2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418(2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544(1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie naczy m zgowychwirowanie z nisk pr dko citechnika filtracjibariera krew m zgkom rki r db onkaperycytymi nie g adkiestopki astrocyt weksperymenty z immunostainingiemutrzymanie integralno ci strukturalnejizolacja przedzia u naczyniowego

Powiązane artykuły