Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Streszczenie

Dysfunkcyjne mitochondria mięśni szkieletowych odgrywają rolę w zaburzeniach metabolizmu obserwowanych wraz ze starzeniem się, otyłością i cukrzycą typu II. Mitochondrialne testy respirometryczne z izolowanych preparatów mitochondrialnych pozwalają na ocenę funkcji mitochondriów, a także określenie mechanizmu(ów) działania leków i białek modulujących metabolizm. Obecne procedury izolacji często wymagają dużych ilości tkanki, aby uzyskać wysokiej jakości mitochondria niezbędne do testów respirometrycznych. Przedstawione tu metody opisują, w jaki sposób wysokiej jakości oczyszczone mitochondria (~ 450 μg) można wyizolować z minimalnych ilości (~75-100 mg) mięśni szkieletowych myszy w celu zastosowania w wysokoprzepustowych pomiarach oddechowych. Ustaliliśmy, że nasza metoda izolacji daje 92,5± 2,0% nienaruszonych mitochondriów, mierząc aktywność syntazy cytrynianu spektrofotometrycznie. Ponadto analiza Western blot w izolowanych mitochondriach spowodowała słabą ekspresję białka cytozolowego GAPDH i silną ekspresję białka mitochondrialnego COXIV. Brak wyraźnego pasma GAPDH w izolowanych mitochondriach wskazuje na niewielkie zanieczyszczenie ze źródeł innych niż mitochondrialne podczas procedury izolacji. Co najważniejsze, pomiar wskaźnika zużycia_O2 za pomocą technologii opartej na mikropłytkach i określenie współczynnika kontroli oddechowej (RCR) dla sprzężonych testów respirometrycznych wykazuje wysoce sprzężone (RCR; >6 dla wszystkich testów) i funkcjonalne mitochondria. Podsumowując, dodanie oddzielnego etapu mielenia i znaczne zmniejszenie prędkości homogenizacji napędzanej silnikiem w poprzednio opisanej metodzie pozwoliło na wyizolowanie wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy, co skutkuje wysoce sprzężonymi mitochondriami, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Wprowadzenie

Podstawową funkcją mitochondriów jest wytwarzanie ATP z fosforylacji oksydacyjnej. Jednak mitochondria mają wiele innych ważnych funkcji komórkowych, w tym między innymi: produkcję i detoksykację reaktywnych form tlenu, regulację cytoplazmatycznego i mitochondrialnego wapnia, transport organelli, homeostazę jonową i udział w apoptozie^1,2. Dlatego nie jest zaskakujące, że dysfunkcyjne mitochondria odgrywają rolę w wielu patologiach chorobowych, takich jak starzenie się, choroby neurodegeneracyjne, choroby układu krążenia, nowotwory, otyłość i cukrzyca^3,4. Co ważne, mitochondria mięśni szkieletowych są zaangażowane w wiele z tych patologii^3-5.

Testy oddychania mitochondrialnego z wykorzystaniem izolowanych mitochondriów pozwalają na ocenę łańcucha transportu elektronów i funkcji fosforylacji oksydacyjnej oraz określenie mechanizmu (mechanizmów) działania leków i białek modulujących metabolizm. Procedury izolacji mitochondriów istnieją dla wielu typów tkanek i komórek dla różnych gatunków^6,7. Jednak procedury te często wymagają dużych ilości tkanek/komórek w celu uzyskania wysokiej jakości mitochondriów niezbędnych do klasycznych testów respirometrycznych.

Testy respirometyczne oparte na mikropłytkach pozwalają na pomiary o wysokiej przepustowości przy użyciu minimalnych ilości izolowanych mitochondriów, często zaledwie kilka μg na studzienkę⁸. W związku z tym przedstawiamy modyfikację wcześniej opublikowanych metod⁷, aby umożliwić wyizolowanie wysokiej jakości mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu zastosowania w testach respirometycznych opartych na mikropłytkach. Ponadto przedstawiono metody ustalania jakości preparatu do izolacji mitochondriów i integralności błon mitochondrialnych. Biorąc pod uwagę, że mitochondria mięśni szkieletowych są zaangażowane w wiele stanów patologicznych, pomiar zużycia_O2 w badaniach napędzanych mechanistycznie staje się coraz bardziej powszechny w badaniach biomedycznych^9,10.

Protokół

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Instytucie Politechnicznym Wirginii i Uniwersytecie Stanowym.

1. Ustawienie (Czas: ~45 min)

1. Rozmrozić zamrożone zapasy 0,25% trypsyny, buforu izolacyjnego dla mitochondriów (IBM) 1 i IBM2 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Opłucz szklane naczynia i narzędzia sekcyjne w 70% etanolu, a następnie w wodzie o wysokiej czystości.
3. Przygotuj 0,05% roztwór trypsyny z 0,25% zapasu trypsyny, rozcieńczając 1 część trypsyny w 4 częściach IBM1.
4. Wymieszaj koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy z buforem do lizy komórek (stosunek 1:100) w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml z zakrętką.
5. Podwielokrotność 5 ml (5 ml/mysz) 0,05% trypsyny do plastikowej probówki o pojemności 15 ml.
6. Ustaw homogenizator tkankowy napędzany silnikiem na 80 obr./min.

2. Izolacja mitochondriów mięśni szkieletowych (Czas: ~90 min)

1. Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
2. Usuń czerwony mięsień z mięśnia czworogłowego uda i mięśnia brzuchatego łydki, który obejmuje płaszczkowaty (łącznie ~ 75-100 mg), jak opisano w następujących krokach:
   1. Obierz skórę w kierunku myszy.
   2. Usuń poduszeczkę tłuszczową nad punktem początkowym mięśnia czworogłowego. Przetnij ścięgno mięśnia czworogłowego, które jest przyczepione do rzepki, nożyczkami z cienką końcówką.
      Uwaga: Mięsień czworogłowy uda można rozpoznać po jego anatomicznym położeniu w przedniej części bliższej części kości udowej.
   3. Powoli odetnij rozcięgno między kością a mięśniem czworogłowym, unikając tętnicy udowej, aby uwolnić mięsień czworogłowy od kości. Przetnij ścięgno nożyczkami z cienką końcówką w punkcie początkowym na kości udowej, aby uwolnić mięsień czworogłowy uda i umieść mięsień czworogłowy w schłodzonym PBS.
   4. Usuń widoczną tkankę tłuszczową nad mięśniem czworogłowym za pomocą nożyczek. Odwróć mięsień czworogłowy uda tak, aby część mięśnia, która leżała nad kością udową, była skierowana do góry. Otwórz mięsień czworogłowy uda za pomocą kleszczy ruchem wachlującym. Usunąć dwie widoczne czerwone części mięśni z każdego płata za pomocą nożyczek z cienką końcówką i umieścić w zlewce zawierającej 5 ml schłodzonego IBM1.
      Uwaga: Mięsień czworogłowy uda pojawia się jako dwa płaty z paskiem czerwonego mięśnia znajdującym się w pobliżu bocznej krawędzi każdego płata.
   5. Przetnij skórę leżącą na ścięgnie Achillesa nożyczkami z cienką końcówką i obierz skórę w kierunku myszy. Przetnij odsłonięte ścięgno Achillesa i złudź mięsień w kierunku ciała myszy.
   6. Przetnij ścięgno na bocznych i przyśrodkowych kłykciach kości udowej nożyczkami z cienką końcówką, aby uwolnić brzuchaty łydki i umieść mięsień brzuchaty łydki przyczepiony do ścięgien w schłodzonym PBS.
   7. Odwróć mięsień brzuchaty łydki i oderwij mięsień płaszczkowaty i umieść w zlewce zawierającej 5 ml schłodzonego IBM1. Wachluj otwórz brzuchaty łydki. Usunąć trzy widoczne czerwone części mięśni (dwa boczne i jeden przyśrodkowy powierzchowny czerwony pasek) nożyczkami z cienką końcówką i przenieść je do zlewki zawierającej 5 ml schłodzonego IBM1.
3. Usuń kolejne ~ 75-100 mg czerwonego mięśnia z drugiej nogi myszy (jak opisano w kroku 2.2) i umieść w 1,5 ml probówce mikrowirówkowej z koktajlem inhibitorów proteazy i fosfatazy oraz buforem do lizy komórek (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% dodecylosiarczan sodu, 0,5% deoksycholan sodu, 1% polioksyetylenofenyloeter polioksyetylenowy (9), rozgałęziony. Drugą próbkę należy natychmiast błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie w celu późniejszego wykorzystania w Western blot (patrz krok 6.1).
4. Umieść wstępnie schłodzoną, płaską plastikową powierzchnię na lodzie w dużym wiadrze. Wylej kroplę IBM1 na plastikową powierzchnię i za pomocą pęsety umieść cały podzielony czerwony mięsień (kroki 2.2.4 i 2.2.7) w kropli IBM1. Miel tkankę mięśniową przez 2 minuty za pomocą 3 ostrzy maszynki do golenia, zmieniając maszynki do golenia co 40 sekund.
5. Przenieść zmieloną tkankę do nowej zlewki z 5 ml świeżego IBM1, przytrzymując plastikową powierzchnię nad zlewką i zeskrobując mięsień do zlewki za pomocą żyletki. Pobrać ten roztwór i odcedzić go przez sitko o wielkości 100 μm umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
6. Osusz tkankę delikatną wycieraczką zadaniową, a następnie przenieś ją do 5 ml 0,05% roztworu trypsyny. Użyj pęsety, aby usunąć chusteczkę z wycieraczki roboczej.
7. Inkubuj tkankę mięśniową na lodzie przez 30 minut w 0,05% roztworze trypsyny.
8. Obracać stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą mieszaninę trypsyny i mięśni w temperaturze 200 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
9. Wlać supernatant trypsyny do pojemnika na odpady i ponownie zawiesić osad z 3 ml lodowatego IBM1. Przenieść tkankę do szklanej probówki homogenizatora o pojemności 45 ml. Przepłukać stożkową probówkę o pojemności 15 ml innym pojemnikiem IBM1 o pojemności 1,5 ml, aby zebrać pozostałą próbkę i dodać ją do szklanej probówki homogenizatora.
10. Umieść szklaną rurkę homogenizatora w zlewce lub plastikowym pojemniku wypełnionym do połowy lodem, tak aby szklany homogenizator poruszał się minimalnie w zlewce.
11. Homogenizować mieszaninę tkanka/IMB1 za pomocą tłuczka PTFE przymocowanego do homogenizatora tkankowego napędzanego silnikiem z 10 przejściami przy 80 obr./min. Przytrzymaj dolną część każdego przejścia przez ~2 sekundy.
12. Przenieść homogenat tkankowy do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przepłukać szklaną probówkę homogenizatora 6,5 ml IBM1. Wlać IBM1 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej homogenat tkankowy.
13. Obracać stożkową probówkę o pojemności 15 ml o masie 700 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Delikatnie wlać supernatant do szklanej probówki wirówkowej o wysokiej mocy i wyrzucić osad.
14. Wirować supernatant z powyższego stopnia w temperaturze 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
15. Usunąć supernatant IBM1 i ponownie zawiesić osad, powoli dodając 500 μl IBM2. Odetnij koniec końcówki pipety i delikatnie homogenizuj granulkę w IBM2, mieszając i mieszając. Dodać kolejne 4,5 ml IBM2 do mieszaniny po całkowitym zawieszeniu osadu.
    Uwaga: Unikaj nadmiernego rozcierania podczas łamania większych kawałków granulek, ponieważ może to uszkodzić błony mitochondrialne.
16. Wirować homogenat IBM2/tkankowy w temperaturze 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Ten krok można powtórzyć w czystej probówce wirówkowej o wysokiej wytrzymałości w celu dokładniejszego oznaczania ilościowego białka w izolowanych mitochondriach w kroku 4, ponieważ resztkowe BSA mogą przyczyniać się do całkowitej zawartości białka.
17. Usunąć supernatant i delikatnie, ale całkowicie ponownie zawiesić osad, dodając dwie porcje IBM2 o 25 μl z końcówką pipety z odciętym końcem. Delikatnie wymieszać i wymieszać osad po każdym dodaniu 25 μl IBM2. Umieść ten mitochondrialny bulion na lodzie.

3. Homogenizacja całego lizatu tkankowego (Czas: ~45 min; można to zrobić w kroku 7)

1. Usuń mięsień z tego, który został umieszczony w ciekłym azocie z kroku 2.3 i inkubuj w temperaturze pokojowej aż do całkowitego rozmrożenia.
2. Miel tkankę przez ~30 sekund na lodzie nożyczkami z cienką końcówką.
3. Dodaj dwie miarki 100 μl kulek tlenku cyrkonu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z nakrętką z kroku 3.2, która zawiera zmieloną tkankę. Homogenizuj tkankę w homogenizatorze tkanek w młynie perełkowym, wykonując dwa do trzech 5-minutowych cykli przy ustawieniu prędkości 4-6 (ustawienie średnie).
4. Wirować mieszaninę z kroku 3.3 w temperaturze 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wyrzucić osad i umieścić supernatant na lodzie.

4. Oznaczanie białka (Czas: ~30 min)

1. Określić stężenie białka w lizacie całej tkanki (krok 3.4) i zapasie mitochondrialnym (krok 2.17) za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA zgodnie ze specyfikacjami producenta.

5. Integralność błony mitochondriów; Aktywność syntazy cytrynianu (CS) (czas: ~15 min)

1. Wykonaj dwa oddzielne rozcieńczenia mitochondriów w stosunku 1: 20 w wodzie o wysokiej czystości. Dodaj 0,1% Triton 100-X do jednej próbki i poddaj ją sonizacji na niskim poziomie (765 watów, amplituda 2). Pozostawić drugie rozcieńczenie na lodzie. Po sonikacji umieścić próbkę z powrotem w lodzie.
2. Przeprowadzić test syntazy cytrynianu zarówno z niesonikowanymi, jak i sonikowanymi rozcieńczeniami mitochondrialnymi, używając testu spektrofotometrycznego, jak opisano wcześniej^11,12.
3. Określ procent nienaruszonych błon mitochondriów, korzystając z następujących równań:
   (Niesonikowana aktywność CS ÷ Sonikowana aktywność CS)* 100

100- N (procent osiągnięty z góry)

6. Jakość izolacji mitochondriów; Western Blotting (czas: zgodnie z protokołem laboratoryjnym)

1. Wykonaj Western blot na lizacie całej tkanki i izolowanych mitochondriach, jak opisano wcześniej¹².
   Uwaga: Należy użyć przeciwciał pierwszorzędowych dla GAPDH (rozcieńczenie 1: 1,000 w 5% BSA/TBS-T) i COXIV (rozcieńczenie 1:1,000 w 5% mleku beztłuszczowym/TBS-T), a następnie odpowiednio przeciwciał drugorzędowych przeciwko kozom i królikom (1:10,000).

7. Test respirometryczny (Czas: ~90 min)

1. Wykonaj pożądane testy respirometryczne przy użyciu technologii pomiaru zużycia_O2 na bazie mikropłytek, jak opisano wcześniej (patrz artykuł towarzyszący i Rogers i wsp. ⁸).
2. Określ współczynnik kontroli oddechowej (RCR), dzieląc stan 3 przez stan 4o (RCR) lub dzieląc stan 3u przez stan 4o. Przy określaniu RCR należy użyć środkowego (średniego) punktu lub najwyższych (stan 3) i najniższych (stan 4o) ze śladów punkt-punkt.

Wyniki

Aktywność syntazy cytrynianowej służy jako miara integralności błon, ponieważ syntaza cytrynianowa znajduje się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej i w związku z tym nie powinna występować w zawiesinach mitochondriów z nienaruszonymi błonami. Rysunek 1 przedstawia aktywność syntazy cytrynianowej w niepoddanych sonikacji próbkach mitochondrialnych w porównaniu z próbkami poddanymi sonikacji z tej samej izolacji. Sonikacja mitochondriów prowadzi do statystycznie istotnego wzrostu aktywności syntazy cytry...

Dyskusja

Przedstawione w niniejszym artykule metody zawierają szczegółowy opis procedury izolacji mitochondriów z minimalnych ilości (~75-100 mg) mięśni szkieletowych myszy. Ta procedura izolacji jest w stanie uzyskać wysoko funkcjonujące, czyste mitochondria (~ 450 μg), o czym świadczą wskaźniki zużycia_O2 , wartości RCR, maksymalna aktywność syntazy cytrynianu i ekspresja białka z immunoblottingu. Co ważne, mitochondria wyizolowane z tej procedury mogą być wykorzystywane do wielu testów respirometycznych z technologią...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zasadniczo tłusty	Sigma Aldrich	A6003	N/A
Bez kwasów - BSA
Tris/HCl	Promega	H5123	N/A
KCL	Sigma Aldrich	P9541	N/A
Tris Base	Promega	H5135	N/A
EDTA	Sigma	Aldrich E6511	N/A
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	N/A
Sacharoza	Sigma Aldrich	S7903	N/A
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	N/A
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa	Thermo Scientific	25200-056	N/A
Chlorek sodu Białe kryształy lub krystaliczny proszek ≥ 99.0 %	Fisher Scientific	BP3581	N/A
Dodecylosiarczan sodu	Sigma Aldrich	L3771	N/a
Deoksycholan sodu	Sigma Aldrich	D6750	N/a
Eter polioksyetylenofenylowy (12), rozgałęziony	Sigma Aldrich	238651	N/A
Jednokrawędziowe żyletki	Fisher Scientific	12-640	N/A
Falcon- 100 uM Nylonowe sitka komórkowe	Fisher Scientific	352360	N/A
Halt Protease & Koktajl z inhibitorami fosforanów	Thermo Scientific	1861284	N/A
1,5 ml probówki do mikrowirówek z nakrętką	Thermo Scientific	3474	N/A
kulki z tlenku cyrkonu	Fisher Scientific	C9012112	N/A
GAPDH (1D4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-59540	Nie dotyczy Przeciwciało
anty-COXIV	Sygnalizacja komórkowa	4844s	Wystarczy dowolne mitochondrialne białko błony wewnętrznej
Sprzężone z peroksydazą powinowactwo Osioł, anty królik IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearh	711-035-152	N / A
Peroksydaza sprzężona z affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearh	115-001-003	Nie dotyczy
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N/A
Zestaw do oznaczania białek BCA Pierce	Thermo Scientific	23225	N/A
Kwas pirogronowy, 98%	Sigma Aldrich	107360	Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C,pH do 7,4 z KOH przed użyciem w teście respirometrycznym
Kwas bursztynowy	Sigma Aldrich	S9512	Przechowywać w temperaturze pokojowej, pH do 7,4 z KOH przed użyciem w teście respirometrycznym
Kwas jabłkowy L(-), BioXtra, ≥ 95%	Sigma Aldrich	M6413	Przechowywać w temperaturze pokojowej, do 7,4 z KOH przed użyciem w teście respirometrycznym
Kwas L-glutaminowy	Sigma Aldrich	G1251	Przechowywać w temperaturze pokojowej, do 7,4 z KOH przed użyciem w teście respirometrycznym, do 7,4 z KOH przed użyciem w teście
Chlorek palmitoilu L-karnityny	Sigma Aldrich	P1645	Przechowywać w temperaturze -20 stopni C
Oligomycyna A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Przechowywać w temperaturze -20 ° C
Cyjanek karbonylu 4-(trifluorometoksy)	Sigma Aldrich	C2920	Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni; C
fenylohydrazon
≥ 98% (TLC), proszek [FCCP]
Antymycyna A z Streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Sklep pod adresem -20 ° C
Sól monopotasowa adenozyno-5′-difosforanu odwadniająca [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Przechowywać w temperaturze -20 ° C, do 7,4 z KOH przed użyciem w teście
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Przechowywać w temperaturze pokojowej