In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

Podsumowanie

Ten protokół replikuje fizjologiczny lub patologiczny przepływ krwi in vitro, aby pomóc w określeniu odpowiedzi komórek w patologiach chorobowych. Wprowadzając komorę tłumiącą ciśnienie za pompą krwi, przepływ krwi przez naczynia krwionośne może zostać ponownie podsumowany i nałożony na monowarstwę śródbłonka naczyniowego lub kokulturę mimetyczną.

Streszczenie

Choroby naczyniowe są częstą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badania wpływu dynamiki przepływu na patologie chorób naczyniowych. Niezdrowe tętnice często objawiają się usztywnieniem ścian, bliznowaceniem lub częściowym zwężeniem, które mogą wpływać na szybkość przepływu płynów i wielkość przepływu pulsacyjnego lub wskaźnik pulsacji. Odtworzenie różnych warunków przepływu jest wynikiem dostrojenia komory tłumiącej ciśnienie przepływu za pompą krwi. Wprowadzenie powietrza do zamkniętego systemu przepływu pozwala ściśliwemu medium na pochłanianie pulsacyjnego ciśnienia z pompy, a tym samym zmianę wskaźnika pulsacji. Opisana tutaj metoda jest po prostu odtworzona, z wysoce kontrolowanymi danymi wejściowymi i łatwo mierzalnymi wynikami. Pewne ograniczenia polegają na odtwarzaniu złożonego fizjologicznego kształtu fali impulsowej, który jest tylko przybliżony przez system. Na komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich i fibroblasty wpływa przepływ krwi przez tętnicę. Składnik dynamiczny przepływu krwi zależy od pojemności minutowej serca i podatności ściany tętnicy. Mechaniczna transdukcja dynamiki przepływu w komórkach naczyniowych może wyzwalać uwalnianie cytokin i przesłuchiwanie między typami komórek w tętnicy. Kohodowla komórek naczyniowych jest dokładniejszym obrazem odzwierciedlającym interakcję komórka-komórka na ścianie naczynia krwionośnego i odpowiedź naczyniową na sygnalizację mechaniczną. Udział dynamiki przepływu, w tym odpowiedzi komórki na dynamiczne i średnie (lub stałe) składowe przepływu, jest zatem ważnym wskaźnikiem w określaniu patologii choroby i skuteczności leczenia. Poprzez wprowadzenie modelu kohodowli in vitro i tłumienia ciśnienia za pompą krwi, która wytwarza symulowany rzut serca, można badać różne patologie chorób tętnic.

Wprowadzenie

Wskaźniki zachorowalności na choroby sercowo-naczyniowe są największe w Ameryce, a wiele z nich wynika z niezdrowego układu krwinek. Zdrowe tętnice składają się z elastycznej tkanki z miękką powierzchnią światła pokrytą monowarstwą komórek śródbłonka (EC). Przepływ tętniczy można modelować jako funkcję fali oscylacyjnej o dodatnim średnim natężeniu przepływu. Wskaźnik pulsatywności (PI) jest ilorazem wielkości oscylacji i średniego przepływu (PI = (maks. - min.) / średnia)^,1 i został zamodelowany in vitro ze zmienną elastycznością naczyń. ² Elastyczność tętnic jest ważna w magazynowaniu energii przepływu ze skurczów serca, rozszerzania się pod ciśnieniem skurczowym i odgrywa znaczącą rolę w modulowaniu przepływu krwi PI. Ponieważ serce utrzymuje stały, pulowy, objętościowy przepływ, rozszerzenie tętnic zwiększa pole przekroju poprzecznego, zwiększając stabilność przepływu poprzez zmniejszenie prędkości przepływu, naprężeń ścinających i PI. Często w niezdrowych tętnicach występują zmiany elastyczności lub podatności, wykazując usztywnienie spowodowane przebudową naczyń krwionośnych, bliznowatą tkanką lub zwapnieniem ^3,4. Ponadto inne zaburzenia naczyniowe, takie jak przerost neointimy (NIH)^,5 tętniak i^{nadciśnienie6} oraz zwłóknienie naczyń⁴, mogą zwężać średnicę naczynia. Jednak obecne leczenie farmakologiczne i leczenie za pomocą urządzeń w chorobach naczyniowych często zaniedbuje znaczenie zgodności ścian naczyń lub dynamiki przepływu krwi w chorobie naczyniowej, która często jest skomplikowana przez zmiany w morfologii i właściwościach naczyń. Ani angioplastyka balonowa, ani stentowanie nie rozwiązują problemu elastyczności ścian⁷. Dlatego modelowanie in vitro przepływów krwi wynikających z choroby tętnic i leczenia jest ważne w badaniu patologii chorobowych i przyszłej skuteczności leczenia. W niniejszym artykule opisano metodę replikacji fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi przeznaczoną do określenia odpowiedzi komórek w patologiach chorób naczyniowych. Przepływ płynu powoduje naprężenie ścinające na ścianie naczynia, co jest ważnym sygnałem mechanicznym dla zdrowia naczynia, wpływającym na wszystkie komórki w obrębie układu naczyniowego. Zidentyfikowano kilka mechanicznych czujników na śródbłonku naczyniowym do ścinania płynu, w tym rzęski pierwotnej, które wykazano w ostatnich badaniach nad mechanosensacją śródbłonka⁸. Na aktywność i morfologię komórek śródbłonka ma wpływ prędkość, kierunek i pulsacja przepływu. Dodatkowo, na migrację komórek mięśni gładkich (SMC) mogą wpływać sygnały mechaniczne przepływu o niskiej prędkości przez płyn śródmiąższowy⁹, a także mogą być przenoszone przez sygnalizację parakrynną z komórek śródbłonka poprzez ich odpowiedź na przepływ i mechano-transdukcję sygnałów przepływu poprzez uwalnianie cytokin¹⁰. Zależność od "dawki" średniego ścinania, PI i sygnalizacji parakrynnej może być również współzależna. W tym celu określenie odpowiedzi komórek naczyniowych na ścinanie płynu przy zróżnicowanym "dawkowaniu" w hodowli jednowarstwowej lub kokulturze in vitro może dostarczyć mechanistycznych informacji na temat przebudowy naczyń krwionośnych i poprawić przewidywanie chorób i leczenia. System przepływu zastosowany w tym eksperymencie składa się z pompy krwi, zbiornika powietrza tłumiącego przepływ przed przepływem, przepływomierza używanego tylko podczas konfiguracji eksperymentalnej, hodowli komórkowej za nim, komory przepływu z równoległą płytką i zbiornika pożywki. Kontrolę zmiennych przepływu naczyniowego, takich jak średnie natężenie przepływu, uderzenia na minutę i PI, można osiągnąć poprzez kontrolowanie natężenia przepływu, częstotliwości impulsów i wprowadzenie tłumienia ciśnienia. Pulsacyjne pompy krwi są dostępne ze zmiennym przemieszczeniem skoku, przy kontrolowanej częstotliwości udaru, odnoszącej się bezpośrednio do średniego objętościowego natężenia przepływu i częstotliwości tętna. Wprowadzenie zbiornika powietrza w obiegu przepływu pozwala na tłumienie ciśnienia, zmniejszając wielkość oscylacji przepływu. Media są nieściśliwym płynem, podczas gdy powietrze w komorze tłumienia jest ściśliwe, co pozwala na pochłanianie nadmiernego ciśnienia z fali przepływowej przez sprężanie powietrza. Stosunek powietrza do mediów pozwala na kontrolę nad stopniem tłumienia. Z akrylu stworzono niestandardową komorę przepływową do hodowli komórkowych o długości 75 mm i szerokości 50 mm. Przepływ wchodzi przez otwór wlotowy i rozszerza się przez kolektor wlotowy, zapewniając stały przepływ w całej komorze przepływowej. Podobny przepływ i struktury występują na wylocie z komory. Komórki są wysiewane na funkcjonalizowanych szkiełkach, a następnie umieszczane w komorze przepływowej. Pozwala to na uzyskanie dużych populacji, które można łatwo odzyskać po badaniu. Eksperymenty z kokulturami mogą wykorzystywać porowatą membranę poliwęglanową w celu wyeliminowania kontaktu między komórkami między kulturami, umożliwiając jednocześnie transport cytokin/przepływ. System ten był wcześniej używany do modelowania wysokiego przepływu PI i jego wpływu na hodowlę jednowarstwową śródbłonka i kokulturę EC/SMC ^1,10, w celu zbadania odpowiedzi komórek na chorobę o patologicznie wysokim PI. Opisując protokół używany do modelowania tych warunków przepływu, mamy nadzieję pomóc innym w określeniu udziału sygnału przepływu w odpowiedzi komórki.

Protokół

1. Silanizacja i funkcjonalizacja biomolekułami szkiełka lub membrany poliwęglanowej

Uwaga: Wiele substancji chemicznych i roztworów stosowanych w tym protokole charakteryzuje się wysokim tempem parowania (etanol (EtOH), aceton itp.). Inne etapy wymagają długich czasów inkubacji, aby zminimalizować parowanie. W celu uszczelnienia pojemników zaleca się stosowanie folii Parafilm. Ostrożnie: Wiele z chemikaliów (w tym: kwas siarkowy, aceton, (3-aminopropyl)trietoksysilan, glutaraldehyd, EtOH) jest uznawanych za niebezpieczne lub lotne. Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki (MSDS) każdego materiału w celu zapewnienia właściwego przechowywania, obchodzenia się z nimi oraz utylizacji.

1. Umieść nową szkiełko przedmiotowe o wymiarach 75 mm na 50 mm na 1 mm w czystej, szklanej kuwecie do barwienia, bez względu na orientację, zapewniając całkowite zanurzenie. Używaj tego pojemnika w krokach 1.1-1.12.
   Uwaga: W przypadku kokultury, we wszystkich kolejnych krokach dotyczących funkcjonalizacji PC i wysiewu EC należy uwzględnić membranę z poliwęglanu (PC) o rozmiarze porów 0,4 mikrona, dociętą do rozmiaru 75 mm na 50 mm.
2. Zanurz szkiełko w kwasie siarkowym (20%) na noc (O/N).
   Ostrzeżenie: Przed użyciem zapoznaj się z kartą charakterystyki (MSDS) kwasu siarkowego.
3. Umyj szkiełko, zanurzając je w wodzie dejonizowanej (DI) przez 5 min, trzykrotnie, za każdym razem wymieniając wodę DI.
4. Zanurz szkiełko w acetonie na 30 min.
   Ostrzeżenie: Przed użyciem zapoznaj się z kartą charakterystyki (MSDS) acetonu.
5. Zanurz szkiełko w 6% roztworze (3-aminopropyl)trietoksysilanu w acetonie na noc (O/N).
   Ostrzeżenie: Przed użyciem zapoznaj się z kartą charakterystyki (MSDS) (3-aminopropyl)trietoksysilanu i acetonu.
6. Zanurz szkiełko w acetonie przez 5 min, trzykrotnie, za każdym razem wymieniając aceton.
   Ostrzeżenie: Przed użyciem zapoznaj się z kartą charakterystyki (MSDS) acetonu.
7. Umyj szkiełko, zanurzając je w wodzie DI przez 5 min, trzykrotnie, za każdym razem wymieniając wodę DI.
8. Zanurz szkiełko w 1,5% roztworze glutaraldehydu w wodzie DI na 60 min.
   Ostrzeżenie: Przed użyciem zapoznaj się z kartą charakterystyki (MSDS) glutaraldehydu.
9. Umyj szkiełko, zanurzając je w wodzie DI przez 5 min, dwukrotnie, za każdym razem wymieniając wodę DI.
10. Umieść szkiełka w 70% etanolu (EtOH) na 30 min w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.
11. Usun EtOH i pozwól pozostałym resztkom odparować. Zanurz szkiełka w sterylnym DI i odlej nadmiar wody, aby rehydratować szkiełka.
    Uwaga: Szkiełka lub membrana PC mogą zostać zamknięte w uchwycie do szkiełek i przechowywane w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia. Przed użyciem do hodowli komórkowej powtórz kroki 1.10 i 1.11.
12. Wyjmij szkiełko z uchwytu i umieść je w kwadratowej szalce Petriego o wymiarach 100 mm na 100 mm w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    Uwaga: Ten pojemnik będzie używany we wszystkich pozostałych krokach.
    1. Przygotuj szkiełko lub membranę PC do wysiewu komórek śródbłonka do eksperymentu z monokulturą.
       1. Pokryj funkcjonalizowane szkiełko lub membranę PC (krok 1.11) 1 ml roztworu fibronektyny (25 μg/ml) z jednej strony, pokrywając przybliżony obszar wystawiony na działanie komory hodowli komórkowej.
       2. Inkubuj szkiełka lub membranę PC w sterylnym inkubatorze ustawionym na 37 °C przez 1-2 h.
       3. Po inkubacji odessaj pozostały roztwór za pomocą szklanej pipety aspiracyjnej podłączonej do próżni.
          Uwaga: Szkiełka mogą być teraz przechowywane na noc (O/N) w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.
    2. Wykonaj kroki 1.12.2 wyłącznie w celu przygotowania kokultury EC/SMC. Przygotuj i wysiej kulturę komórek mięśni gładkich (SMC) do eksperymentu z kokulturą.
       1. Umieść uszczelkę silikonową na wierzchu szkiełka (krok 1.11) o średnicy zewnętrznej 75 mm na 50 mm, średnicy wewnętrznej 50 mm na 30 mm, grubości 0,5 mm i perforacjach dopasowanych do próżni komory przepływowej.
       2. Przygotuj 1 ml zawiesiny SMC w 10% FBS/DMEM. Zneutralizuj 1 ml roztworu kolagenu typu I o stężeniu 2 mg/ml za pomocą 7% roztworu NaHCO₃ i 0,1 M NaOH do pH 7,4, a następnie wymieszaj z zawiesiną SMC do uzyskania końcowej gęstości komórek 2 x 10⁶ komórek/ml.
       3. Rozprowadź roztwór SMC wewnątrz uszczelki i inkubuj szkiełka w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 30 min.
       4. Po inkubacji pokryj szkiełko 25 ml 0,1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zmieszanej z pożywką DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) na 72 h.
13. Hoduj komórki śródbłonka (ECs) na szkiełku szklanym/membranie poliwęglanowej.
    1. Wysiej 1 ml ECs w 10% FBS/DMEM, z początkowym stężeniem 6,0 x 10⁵ komórek/ml, na powierzchnie pokryte fibronektyną szkiełka szklanego lub membrany poliwęglanowej.
    2. Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂ i 10% FBS przez 120 min.
    3. Pokryj szkiełka z komórkami dodatkowym 10% FBS/DMEM i umieść w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na noc (O/N), aż osiągną 70%-80% konfluencji.

2. Wyznaczanie lepkości cieczy i objętościowego natężenia przepływu

Uwaga: Rotacyjne wiskozymetry są urządzeniami precyzyjnymi, dlatego przed kalibracją, zerowaniem lub przeprowadzaniem pomiarów należy zapoznać się z instrukcją obsługi wiskozymetru.

1. Wyznaczyć pożądaną wartość naprężenia ścinającego płynu (τ) na podstawie literatury dotyczącej docelowego układu naczyniowego w eksperymencie.
2. Zmierzyć lepkość (μ) 1% FBS/DMEM za pomocą wiskozymetru rotacyjnego.
3. Wyznaczyć wymaganą objętościową prędkość przepływu (Q) z równania Poiseuille'a:
   ,
   gdzie τ = naprężenie ścinające płynu, μ = lepkość, Q = objętościowa prędkość przepływu, w = szerokość komory, a h = wysokość komory).
4. Ustawić pompę na prędkość przepływu wyznaczoną w kroku 2.3 i stosować ją we wszystkich kolejnych etapach.

3. Wyznaczenie indeksu pulsacyjności

Uwaga: Wszystkie porty połączeniowe w systemie powinny być połączone za pomocą odpowiednio dobranych złączy pierścieniowych z kolcem lub żeńskich złączy luer z kolcem. Następnie do złączy z kolcem można podłączyć rurki z PVC, aby zamknąć obwód.

1. Podłączyć obwód przepływowy zgodnie z Rysunkiem 2, z komorą tłumiącą (Rysunek 3) oraz ultradźwiękowym przepływomierzem w odpowiednim kierunku przepływu.
   Uwaga: Ultradźwiękowy przepływomierz jest czułym urządzeniem; przed użyciem należy zapoznać się z instrukcją obsługi.
2. Wypełnić obwód przepływowy i zbiornik wodą DI, upewniając się, że rurka wylotowa zbiornika (do pompy) jest zanurzona w objętości zbiornika. Zwizualizować przebieg fali przepływu za pomocą przepływomierza.
3. Otworzyć zawór odpowietrzający w komorze tłumiącej, aby zmienić stosunek objętości cieczy do powietrza. Zamykać zawór odpowietrzający w różnych odstępach poziomów cieczy i obliczyć indeks pulsacyjności (PI = (V_Max - V_Min) / V_Mean), korzystając z szczytu (V_Max), dołka (V_Min) oraz średniej (V_Mean) przebiegu fali przepływu. Zapisać wartości PI w notatniku.
4. Zaznaczyć otrzymany poziom cieczy i PI na komorze tłumiącej za pomocą permanentnego pisaka z włókniną do późniejszego użytku. Określić pożądane poziomy PI na podstawie literatury patologicznej¹¹.
5. Formowanie rurek silikonowych – opcjonalna, bardziej zaawansowana metoda kontrolowania pulsacyjności
   1. Wymieszać bazę elastomeru silikonowego i utwardzacz w różnych proporcjach (np. stosunek bazy do sieciującego od 10:1 do 36:1) dla różnych docelowych modułów sprężystości, zgodnie z wcześniejszą ilustracją.²
   2. Wyprodukować rurki silikonowe poprzez powtarzalny proces zanurzania i utwardzania, krótko zanurzając stalową kaniulę (14 G) w mieszaninie prepolimeru silikonowego o określonym stosunku bazy do sieciującego.
   3. Umieścić kaniulę pokrytą prepolimerem w piekarniku ustawionym na 60 °C na 4 hr, aby utwardzić powłokę polimerową na kaniuli, zmieniając jej kierunek w połowie procesu utwardzania.
   4. Powtórzyć proces zanurzania z tą samą mieszaniną elastomeru silikonowego i ponownie umieścić w piekarniku na kolejne 4 hr, co pozwoli uzyskać rurki o grubości ~0.3 mm.
   5. Zdjąć ultracienką rurkę silikonową ze stalowej kaniuli.
   6. Podłączyć rurki do obwodu przepływowego zamiast komory tłumiącej i przetestować PI dla każdej z nich zgodnie z punktem 3.3.

4. Sterylizacja pompy

1. Zanurzyć komorę przepływową (Rysunek 2), rurki PVC oraz uszczelki w 10% nadtlenku wodoru (H₂O₂). Przed krokiem 4 wypłukać sterylną wodą dejonizowaną (DI).
2. Umieścić pompę do krwi na wolnej półce inkubatora.
   Uwaga: Półki inkubatora powinny być wykonane ze stali nierdzewnej i być w stanie utrzymać ciężar całego obiegu przepływowego.
3. Wypełnić obieg przepływowy i zbiornik 10% H₂O₂, upewniając się, że rurka wylotowa zbiornika (do pompy) jest zanurzona w objętości zbiornika. Cyrkulować H₂O₂, pompując roztwór przez obieg przez 20 min w komorze z laminarnym przepływem powietrza przy włączonym świetle UV.
4. Odssać cały H₂O₂ z rurek i wypłukać sterylnym PBS, pompując go przez obieg przepływowy.

5. Montaż komory przepływowej

Uwaga: Komora przepływowa składa się z akrylowej płyty wykonanej na zamówienie, z portami próżniowymi oraz wlotowym i wylotowym portem przepływu (patrz Rysunek 2). Montaż komory polega na umieszczeniu komory przepływowej i uszczelek na szkiełkach do hodowli, przy zachowaniu odpowiedniego wyrównania, co opisano poniżej.

1. Podgrzać 1% FBS/DMEM w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i przygotować komorę przepływową.
   1. Wyjąć preparat z EC z medium (z kroku 1.13) i nałożyć na niego uszczelkę stroną z komórkami do góry.
   2. (Opcjonalnie) Wyjąć membranę PC z medium (z kroku 1.13) i nałożyć na nią uszczelkę stroną z komórkami do góry. Pod membraną PC umieścić preparat z kokulturą z wysianymi SMC (krok 1.12.2).
2. Wyrównać kanał próżniowy komory przepływowej z otworami w uszczelce (Rycina 2).
3. Podłączyć rurkę próżniową do portów próżniowych (Rycina 2), upewniając się, że medium nie wycieka do układu próżni.
4. Umieścić arkusz poliwęglanowy pod szkiełkiem przedmiotowym i zacisnąć zespół komory przepływowej za pomocą zacisków sprężynowych, po jednym z każdej strony komory przepływowej (Ryciny 2 oraz 5).
5. Umieścić system przepływowy w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂, a następnie napełnić obieg medium, pompując je z wypełnionego zbiornika przy niskiej pulsacyjności. Utrzymywać ten przepływ przez 4 hr w celu wstępnego kondycjonowania komórek.
6. Dostosować objętość cieczy w komorze tłumiącej do zaznaczonego poziomu PI i inkubować przez wymagany czas.

Wyniki

Utrzymanie warunków przepływu zależy od prawidłowego montażu obwodu przepływowego (Rysunek 1). Średnica rurek jest istotnym parametrem podczas montażu, ponieważ większe średnice zmniejszają opór przepływu i wynikający z tego spadek ciśnienia przed i za komorą hodowlaną. Aby zapewnić zamierzone ciśnienie i prędkość przepływu, należy zmontować system z przepływomierzem przed eksperymentem, stosując odpowiednie rurki. Wyrównanie kanału próżniowego komory hodowlanej (Rysunek 2) z perforacjam...

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodę odtwarzania przepływu pulsacyjnego in vitro i może być podstawowym pierwszym krokiem w określaniu udziału warunków przepływu w patologiach chorobowych. Wcześniejsze badania z wykorzystaniem tego protokołu wykazały, że warunki przepływu przyczyniają się do naczyniowej odpowiedzi zapalnej. ^1,10 Ponadto protokół ten jest przeznaczony dla doświadczonych laboratoriów. W związku z tym nie opisano tu ani dogłębnej mechaniki płynów, ani analizy biochemicznej. Aby uzyskać...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aceton	Sigma-Aldrich	34850
Kwas siarkowy	Sigma-Aldrich	320501
(3-aminopropylo)trietoksysilan	Sigma-Aldrich	440140
Roztwór aldehydu glutarowego	Sigma-Aldrich	G5882
Etanol	Sigma-Aldrich	459844
Szkiełko szkiełkowe (70  mm x 50  mm)	Sigma-Aldrich	CLS294775X50
Membrana poliwęglanowa	Millipore Corp.
Uszczelka silikonowa	Grace Bio-Labs	RD 475464
Fibronektyna (25 μ g / ml)	Sigma-Aldrich	F1141
Kolagen typu I	Sigma-Aldrich	C3867
NaHCO3	Fluka	36486
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
Komora			Ta komora jest wykonana na zamówienie i można ją zamówić przy użyciu rysunku technicznego Rysunek 3.
Pompa krwi	Aparat Harvard	529552
rurki z poliwęglanu winylu	US Plastik	65066, 65063, 65062	Mogą być wymagane różne rozmiary
Połączenia Luer	Nordson Medical	Różne	Wymagane będą różne rozmiary, a do wymiany należy zakupić pewną liczbę części.
Komora hodowlana	Obrabiany we własnym	zakresie	akryl na zamówienie można kupić w arkuszach i obrobić zgodnie z przeznaczeniem. Rysunek techniczny pokazany na Rysunek 2 może być użyty do odtworzenia tej komory.
Kwadratowa szalka Petriego	Cole-Parmer	EW-14007-10
Szklany uchwyt na szkiełko	Capitol Scientific	WHE-900303
Surowica bydlęca	płodu Mediatech, Inc.	35-010-CV
Zmodyfikowany Eagle Medium	Mediatech, Inc. firmy Dulbecco	10-013-CV
Przepływomierz	Sonotec, GmbH	Sonoflow co.55/060
Zestaw elastomerów Sylgard	Sigma-Aldrich	761036-5EA
14 G Kaniula stalowa	Ogólne zaopatrzenie	laboratoryjne S8365-1

HTTP09030 tłumiąca