In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

Podsumowanie

Ten protokół replikuje fizjologiczny lub patologiczny przepływ krwi in vitro, aby pomóc w określeniu odpowiedzi komórek w patologiach chorobowych. Wprowadzając komorę tłumiącą ciśnienie za pompą krwi, przepływ krwi przez naczynia krwionośne może zostać ponownie podsumowany i nałożony na monowarstwę śródbłonka naczyniowego lub kokulturę mimetyczną.

Streszczenie

Choroby naczyniowe są częstą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badania wpływu dynamiki przepływu na patologie chorób naczyniowych. Niezdrowe tętnice często objawiają się usztywnieniem ścian, bliznowaceniem lub częściowym zwężeniem, które mogą wpływać na szybkość przepływu płynów i wielkość przepływu pulsacyjnego lub wskaźnik pulsacji. Odtworzenie różnych warunków przepływu jest wynikiem dostrojenia komory tłumiącej ciśnienie przepływu za pompą krwi. Wprowadzenie powietrza do zamkniętego systemu przepływu pozwala ściśliwemu medium na pochłanianie pulsacyjnego ciśnienia z pompy, a tym samym zmianę wskaźnika pulsacji. Opisana tutaj metoda jest po prostu odtworzona, z wysoce kontrolowanymi danymi wejściowymi i łatwo mierzalnymi wynikami. Pewne ograniczenia polegają na odtwarzaniu złożonego fizjologicznego kształtu fali impulsowej, który jest tylko przybliżony przez system. Na komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich i fibroblasty wpływa przepływ krwi przez tętnicę. Składnik dynamiczny przepływu krwi zależy od pojemności minutowej serca i podatności ściany tętnicy. Mechaniczna transdukcja dynamiki przepływu w komórkach naczyniowych może wyzwalać uwalnianie cytokin i przesłuchiwanie między typami komórek w tętnicy. Kohodowla komórek naczyniowych jest dokładniejszym obrazem odzwierciedlającym interakcję komórka-komórka na ścianie naczynia krwionośnego i odpowiedź naczyniową na sygnalizację mechaniczną. Udział dynamiki przepływu, w tym odpowiedzi komórki na dynamiczne i średnie (lub stałe) składowe przepływu, jest zatem ważnym wskaźnikiem w określaniu patologii choroby i skuteczności leczenia. Poprzez wprowadzenie modelu kohodowli in vitro i tłumienia ciśnienia za pompą krwi, która wytwarza symulowany rzut serca, można badać różne patologie chorób tętnic.

Wprowadzenie

Wskaźniki zachorowalności na choroby sercowo-naczyniowe są największe w Ameryce, a wiele z nich wynika z niezdrowego układu krwinek. Zdrowe tętnice składają się z elastycznej tkanki z miękką powierzchnią światła pokrytą monowarstwą komórek śródbłonka (EC). Przepływ tętniczy można modelować jako funkcję fali oscylacyjnej o dodatnim średnim natężeniu przepływu. Wskaźnik pulsatywności (PI) jest ilorazem wielkości oscylacji i średniego przepływu (PI = (maks. - min.) / średnia)^,1 i został zamodelowany in vitro ze zmienną elastycznością naczyń. ² Elastyczność tętnic jest ważna w magazynowaniu energii przepływu ze skurczów serca, rozszerzania się pod ciśnieniem skurczowym i odgrywa znaczącą rolę w modulowaniu przepływu krwi PI. Ponieważ serce utrzymuje stały, pulowy, objętościowy przepływ, rozszerzenie tętnic zwiększa pole przekroju poprzecznego, zwiększając stabilność przepływu poprzez zmniejszenie prędkości przepływu, naprężeń ścinających i PI. Często w niezdrowych tętnicach występują zmiany elastyczności lub podatności, wykazując usztywnienie spowodowane przebudową naczyń krwionośnych, bliznowatą tkanką lub zwapnieniem ^3,4. Ponadto inne zaburzenia naczyniowe, takie jak przerost neointimy (NIH)^,5 tętniak i^{nadciśnienie6} oraz zwłóknienie naczyń⁴, mogą zwężać średnicę naczynia. Jednak obecne leczenie farmakologiczne i leczenie za pomocą urządzeń w chorobach naczyniowych często zaniedbuje znaczenie zgodności ścian naczyń lub dynamiki przepływu krwi w chorobie naczyniowej, która często jest skomplikowana przez zmiany w morfologii i właściwościach naczyń. Ani angioplastyka balonowa, ani stentowanie nie rozwiązują problemu elastyczności ścian⁷. Dlatego modelowanie in vitro przepływów krwi wynikających z choroby tętnic i leczenia jest ważne w badaniu patologii chorobowych i przyszłej skuteczności leczenia. W niniejszym artykule opisano metodę replikacji fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi przeznaczoną do określenia odpowiedzi komórek w patologiach chorób naczyniowych. Przepływ płynu powoduje naprężenie ścinające na ścianie naczynia, co jest ważnym sygnałem mechanicznym dla zdrowia naczynia, wpływającym na wszystkie komórki w obrębie układu naczyniowego. Zidentyfikowano kilka mechanicznych czujników na śródbłonku naczyniowym do ścinania płynu, w tym rzęski pierwotnej, które wykazano w ostatnich badaniach nad mechanosensacją śródbłonka⁸. Na aktywność i morfologię komórek śródbłonka ma wpływ prędkość, kierunek i pulsacja przepływu. Dodatkowo, na migrację komórek mięśni gładkich (SMC) mogą wpływać sygnały mechaniczne przepływu o niskiej prędkości przez płyn śródmiąższowy⁹, a także mogą być przenoszone przez sygnalizację parakrynną z komórek śródbłonka poprzez ich odpowiedź na przepływ i mechano-transdukcję sygnałów przepływu poprzez uwalnianie cytokin¹⁰. Zależność od "dawki" średniego ścinania, PI i sygnalizacji parakrynnej może być również współzależna. W tym celu określenie odpowiedzi komórek naczyniowych na ścinanie płynu przy zróżnicowanym "dawkowaniu" w hodowli jednowarstwowej lub kokulturze in vitro może dostarczyć mechanistycznych informacji na temat przebudowy naczyń krwionośnych i poprawić przewidywanie chorób i leczenia. System przepływu zastosowany w tym eksperymencie składa się z pompy krwi, zbiornika powietrza tłumiącego przepływ przed przepływem, przepływomierza używanego tylko podczas konfiguracji eksperymentalnej, hodowli komórkowej za nim, komory przepływu z równoległą płytką i zbiornika pożywki. Kontrolę zmiennych przepływu naczyniowego, takich jak średnie natężenie przepływu, uderzenia na minutę i PI, można osiągnąć poprzez kontrolowanie natężenia przepływu, częstotliwości impulsów i wprowadzenie tłumienia ciśnienia. Pulsacyjne pompy krwi są dostępne ze zmiennym przemieszczeniem skoku, przy kontrolowanej częstotliwości udaru, odnoszącej się bezpośrednio do średniego objętościowego natężenia przepływu i częstotliwości tętna. Wprowadzenie zbiornika powietrza w obiegu przepływu pozwala na tłumienie ciśnienia, zmniejszając wielkość oscylacji przepływu. Media są nieściśliwym płynem, podczas gdy powietrze w komorze tłumienia jest ściśliwe, co pozwala na pochłanianie nadmiernego ciśnienia z fali przepływowej przez sprężanie powietrza. Stosunek powietrza do mediów pozwala na kontrolę nad stopniem tłumienia. Z akrylu stworzono niestandardową komorę przepływową do hodowli komórkowych o długości 75 mm i szerokości 50 mm. Przepływ wchodzi przez otwór wlotowy i rozszerza się przez kolektor wlotowy, zapewniając stały przepływ w całej komorze przepływowej. Podobny przepływ i struktury występują na wylocie z komory. Komórki są wysiewane na funkcjonalizowanych szkiełkach, a następnie umieszczane w komorze przepływowej. Pozwala to na uzyskanie dużych populacji, które można łatwo odzyskać po badaniu. Eksperymenty z kokulturami mogą wykorzystywać porowatą membranę poliwęglanową w celu wyeliminowania kontaktu między komórkami między kulturami, umożliwiając jednocześnie transport cytokin/przepływ. System ten był wcześniej używany do modelowania wysokiego przepływu PI i jego wpływu na hodowlę jednowarstwową śródbłonka i kokulturę EC/SMC ^1,10, w celu zbadania odpowiedzi komórek na chorobę o patologicznie wysokim PI. Opisując protokół używany do modelowania tych warunków przepływu, mamy nadzieję pomóc innym w określeniu udziału sygnału przepływu w odpowiedzi komórki.

Protokół

1. Silanizacja i funkcjonalizacja biomolekuł membrany szkiełkowej lub poliwęglanowej

Uwaga: Wiele substancji chemicznych i roztworów w tym protokole ma wysokie tempo parowania (etanol (EtOH), aceton, itp.). Inne etapy wiążą się z długim czasem inkubacji przy niskich szybkościach parowania. Folia parafinowa jest zalecana do uszczelniania pojemników. Uwaga: Wiele chemikaliów (w tym: kwas siarkowy, aceton, (3-aminopropylo)trietoksysilan, aldehyd glutarowy, EtOH) jest uważanych za niebezpieczne lub lotne. Zapoznaj się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) każdego materiału w celu prawidłowego przechowywania, obchodzenia się i utylizacji przed użyciem.

1. Umieść nowe szkiełko o wymiarach 75 mm na 50 mm na 1 mm w czystym, szklanym naczyniu do barwienia bez względu na orientację, zapewniając pełne zanurzenie. Użyj kontenera dla kroków 1.1-1.12.
   Uwaga: W przypadku kohodowli należy dołączyć membranę poliwęglanową (PC) o wielkości porów 0,4 mikrona, przyciętą do rozmiaru 75 mm na 50 mm, do wszystkich kolejnych etapów funkcjonalizacji PC i wysiewu EC.
2. Zanurzyć szkiełko w kwasie siarkowym (20%), O/N.
   Ostrzeżenie: Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki kwasu siarkowego.
3. Umyj szkiełko, zanurzając je w wodzie dejonizowanej (DI) na 5 minut, trzy razy, za każdym razem zmieniając DI.
4. Zanurz szkiełko w acetonie na 30 min.
   Uwaga: Przed użyciem skonsultuj się z MSDS pod kątem acetonu.
5. Zanurzyć szkiełko w 6% (3-aminopropylo)trietoksysilanie/roztworze acetonu O/N.
   Ostrzeżenie: Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki (3-aminopropylo)trietoksysilanu i acetonu.
6. Zanurz szkiełko w acetonie na 5 minut, trzy razy, za każdym razem zmieniając aceton.
   Uwaga: Przed użyciem skonsultuj się z MSDS pod kątem acetonu.
7. Umyj szkiełko, zanurzając je w DI na 5 minut, trzy razy, za każdym razem zmieniając DI.
8. Zanurzyć szkiełko w 1,5% roztworze aldehydu glutarowego / DI na 60 min.
   Ostrzeżenie: Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki pod kątem aldehydu glutarowego.
9. Umyj szkiełko, zanurzając je w DI na 5 minut, dwa razy, za każdym razem zmieniając DI.
10. Umieść szkiełka w 70% etanolu (EtOH) na 30 minut w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.
11. Usuń EtOH i pozwól, aby pozostała pozostałość odparowała. Zanurz szkiełka w sterylnym DI i opróżnij w celu nawodnienia szkiełek.
    Uwaga: Szkiełka lub membranę PC mogą być szczelnie zamknięte w szklanym uchwycie na szkiełko i przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia. Po użyciu do hodowli komórkowej powtórz kroki 1.10 i 1.11.
12. Wyjmij szkiełko z uchwytu prowadnicy i umieść je na kwadratowej szalce Petriego o wymiarach 100 mm na 100 mm w okapie z przepływem laminarnym.
    Uwaga: Ten kontener będzie używany do wszystkich pozostałych kroków.
    1. Przygotuj szkiełko lub komputer do wysiewu komórek śródbłonka do eksperymentu monokulturowego.
       1. Pokryć funkcjonalizowany szkiełko podstawowe lub PC (krok 1.11) 1 ml roztworu fibronektyny (25 μg/ml) z jednej strony, pokrywając przybliżony obszar wystawiony na działanie komory do hodowli komórkowej.
       2. Inkubować szkiełka podstawowe lub komputer w sterylnym inkubatorze ustawionym w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny.
       3. Po inkubacji odessać pozostały roztwór za pomocą szklanej pipety z aspiratorem podłączonej do próżni.
          Uwaga: Preparaty mogą być teraz przechowywane w temperaturze O/N w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
    2. Postępuj zgodnie z krokami 1.12.2 tylko w celu przygotowania kokultury EC/SMC. Przygotuj i wysiewaj hodowlę komórek mięśni gładkich (SMC) do eksperymentu z jednoczesną hodowlą.
       1. Umieść uszczelkę silikonową na górze suwaka (krok 1.11) o wymiarach 75 mm na 50 mm średnicy zewnętrznej, średnicy wewnętrznej 50 mm na 30 mm, grubości 0,5 mm i perforacji, które są zgodne z próżnią w komorze przepływowej.
       2. Przygotować 1 ml SMC w 10% zawiesinie FBS/DMEM. Zneutralizować 1 ml roztworu 2 mg/ml kolagenu typu I z 7%_NaHCO3 i 0,1 M roztworem NaOH do pH 7,4 i wymieszać z zawiesiną SMC o końcowej gęstości komórek 2 x 10⁶ komórek/ml.
       3. Rozprowadzić roztwór SMC w uszczelce i inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 30 minut.
       4. Po inkubacji przykryć szkiełko 25 ml 0,1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zmieszanej ze zmodyfikowanym podłożem Dulbecco Eagle Medium (DMEM) przez 72 godziny.
13. Hodowla komórek śródbłonka (EC) na szkiełku podstawowym / membranie poliwęglanowej.
    1. Wysiewać 1 ml EC w 10% FBS/DMEM, o początkowym stężeniu 6,0 x 10⁵ komórek/ml, na powierzchniach fibronektyny szkiełka szklanego lub membrany poliwęglanowej.
    2. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i 10% FBS przez 120 minut.
    3. Przykryj szkiełka zawierające komórki dodatkowymi 10% FBS/DMEM i umieść w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ O/N, aż do uzyskania 70%-80% zlewu.

2. Wyznaczanie lepkości płynu i objętościowego natężenia przepływu

Uwaga: Wiskozymetry obrotowe są wrażliwym sprzętem, dlatego przed kalibracją, zerowaniem lub wykonaniem pomiarów należy zapoznać się z instrukcją obsługi lepkościomierza.

1. Określ pożądane ścinanie płynu (τ) na podstawie literatury dotyczącej docelowego układu naczyniowego eksperymentu.
2. Zmierz lepkość 1% FBS/DMEM (μ) za pomocą lepkościomierza rotacyjnego.
3. Określ wymagane objętościowe natężenie przepływu (Q) z równania Poiseuille'a:
   ,
   gdzie τ = ścinanie płynu, μ = lepkość, Q = objętościowe natężenie przepływu, w = szerokość komory, a h = wysokość komory).
4. Ustaw pompę na natężenie przepływu wyznaczone w kroku 2.3 i używaj we wszystkich kolejnych krokach.

3. Wyznaczanie wskaźnika pulsatywności

Uwaga: Wszystkie porty połączeniowe w systemie powinny być połączone odpowiednio dobranymi połączeniami typu lock-to-barb, lub żeńskimi połączeniami typu luer-to-barb. Podłączanie rur PVC można następnie podłączyć do złączek kolczastych i zakończyć obwód.

1. Podłączyć obwód przepływu jak na rysunku 2, z komorą tłumiącą (rysunek 3) i przepływomierzem ultradźwiękowym we właściwym kierunku przepływu.
   Uwaga: Przepływomierz ultradźwiękowy jest wrażliwym elementem wyposażenia, a przed użyciem należy zapoznać się z instrukcją obsługi.
2. Napełnij obwód przepływu i zbiornik wodą DI, upewniając się, że rura wylotowa zbiornika (do pompy) jest zanurzona w objętości zbiornika. Wizualizacja przebiegu przepływu za pomocą przepływomierza.
3. Otwórz zawór spustowy powietrza w komorze tłumienia, aby zmienić stosunek objętości płynu do powietrza. Zamknij zawór spustowy powietrza w różnych odstępach czasu od poziomu płynu i oblicz wskaźnik pulsacji (PI = (V_Max - V_Min) / V_Mean) na podstawie wartości szczytowej fali przepływu (V_Max), doliny (V_Min) i średniej (V_Mean). Rejestrowanie wartości PI w notesie.
4. Zaznacz wynikowy poziom płynu i PI w komorze tłumienia za pomocą pisaka z filcową końcówką do użycia w przyszłości. Określ pożądane poziomy PI z literatury patologicznej¹¹.
5. Tworzenie rurki krzemowej - Opcjonalna, bardziej zaawansowana metoda kontrolowania pulsacji
   1. Wymieszaj bazę z elastomeru silikonowego i utwardzacz w różnych proporcjach (np. stosunek bazy do środka sieciującego od 10:1 do 36:1) w celu uzyskania różnych docelowych modułów sprężystości, jak pokazano wcześniej. ^{cyfra arabska}
   2. Wytwarzaj rurki silikonowe w wielokrotnym procesie utwardzania przez zanurzenie, na krótko zanurzając stalową kaniulę (14 G) w silikonowej mieszaninie prepolimerów o określonym stosunku bazy do środka sieciującego.
   3. Umieść kaniulę pokrytą prepolimerem w piekarniku ustawionym na 60 °C na 4 godziny, aby utwardzić powłokę polimerową na kaniuli, zmieniając kierunek w środku procesu utwardzania.
   4. Powtórz proces zanurzania z tą samą mieszanką elastomerów silikonowych i wstaw z powrotem do piekarnika na dodatkowe 4 godziny, co daje rurki o grubości ~0,3 mm.
   5. Wyjmij ultracienką silikonową rurkę z kaniuli ze stali nierdzewnej.
   6. Podłączyć rurki do obwodu przepływowego zamiast do studzienki tłumiącej i przetestować PI dla każdej z nich, jak w ppkt 3.3.

4. Sterylizacja pompy

1. Zanurz komorę przepływową (rysunek 2), rurki PVC i uszczelki w 10% nadtlenku wodoru (_H2O2). Umyć sterylnym DI przed krokiem 4.
2. Umieść pompę krwi na zapasowej półce inkubatora.
   Uwaga: Półki inkubatora powinny być wykonane ze stali nierdzewnej i być w stanie utrzymać ciężar całego obwodu przepływu.
3. Napełnij obwód przepływu i zbiornik 10% H₂O_{2 ,} upewniając się, że rura wylotowa zbiornika (do pompy) jest zanurzona w objętości zbiornika. Cyrkulować_H2O2, pompując przez obwód przez 20 minut w okapie z przepływem laminarnym przy włączonym świetle UV.
4. Odessać całe_H2O2z rurki i przemyć sterylnym PBS, pompując przez obwód przepływowy.

5. Zespół komory przepływowej

Uwaga: Komora przepływu składa się z akrylowej, wykonanej na zamówienie płyty, z portami próżniowymi oraz portami przepływu wlotowego i wylotowego (patrz Rysunek 2). Montaż studzienki polega na umieszczeniu komory przepływowej i uszczelek na szkiełkach hodowlanych, odpowiednio ustawionych i jest opisany poniżej.

1. Rozgrzać 1% FBS/DMEM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przygotować komorę przepływową.
   1. Wyjmij szkiełko EC z nośnika (z kroku 1.13) i umieść uszczelkę na górze stroną z komórkami do góry.
   2. (Opcjonalnie) Wyjmij membranę PC z nośnika (z kroku 1.13) i umieść uszczelkę na górze komórką do góry. Umieść szkiełko do kokultury z zasianym SMC (krok 1.12.2) pod membraną PC.
2. Dopasuj kanał podciśnieniowy komory przepływowej do otworów w uszczelce (Rysunek 2).
3. Podłącz rurkę próżniową do portów próżniowych (Rysunek 2), upewniając się, że nie ma wycieków mediów do podciśnienia.
4. Umieść arkusz poliwęglanu pod szklanym szkiełkiem i clamp zespół komory przepływowej ze sprężyną clamps, po jednym z każdej strony komory przepływowej (rysunki 2 i 5).
5. Umieścić system przepływowy w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ i napełnić obwód mediami, pompując z napełnionego zbiornika z niską pulsacją. Utrzymuj ten przepływ przez 4 godziny w celu wstępnego kondycjonowania komórek.
6. Dostosuj objętość płynu w komorze tłumienia do oznaczonego poziomu PI i kulturę na żądany czas.

Wyniki

Utrzymanie warunków przepływu zależy od prawidłowego montażu obwodu przepływu (Rysunek 1). Średnica rurki jest ważnym wyborem podczas montażu, przy większych średnicach zmniejszających opór przepływu i wynikający z tego spadek ciśnienia przed i za komorą hodowlaną. Aby zapewnić zamierzone ciśnienie i prędkość przepływu, zmontuj system z przepływomierzem przed eksperymentowaniem z zamierzonymi rurkami. Wyrównanie kanału próżniowego komory hodowlanej (rysunek 2) z perforacją na silikonowej...

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodę odtwarzania przepływu pulsacyjnego in vitro i może być podstawowym pierwszym krokiem w określaniu udziału warunków przepływu w patologiach chorobowych. Wcześniejsze badania z wykorzystaniem tego protokołu wykazały, że warunki przepływu przyczyniają się do naczyniowej odpowiedzi zapalnej. ^1,10 Ponadto protokół ten jest przeznaczony dla doświadczonych laboratoriów. W związku z tym nie opisano tu ani dogłębnej mechaniki płynów, ani analizy biochemicznej. Aby uzyskać...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aceton	Sigma-Aldrich	34850
Kwas siarkowy	Sigma-Aldrich	320501
(3-aminopropylo)trietoksysilan	Sigma-Aldrich	440140
Roztwór aldehydu glutarowego	Sigma-Aldrich	G5882
Etanol	Sigma-Aldrich	459844
Szkiełko szkiełkowe (70  mm x 50  mm)	Sigma-Aldrich	CLS294775X50
Membrana poliwęglanowa	Millipore Corp.
Uszczelka silikonowa	Grace Bio-Labs	RD 475464
Fibronektyna (25 μ g / ml)	Sigma-Aldrich	F1141
Kolagen typu I	Sigma-Aldrich	C3867
NaHCO3	Fluka	36486
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
Komora			Ta komora jest wykonana na zamówienie i można ją zamówić przy użyciu rysunku technicznego Rysunek 3.
Pompa krwi	Aparat Harvard	529552
rurki z poliwęglanu winylu	US Plastik	65066, 65063, 65062	Mogą być wymagane różne rozmiary
Połączenia Luer	Nordson Medical	Różne	Wymagane będą różne rozmiary, a do wymiany należy zakupić pewną liczbę części.
Komora hodowlana	Obrabiany we własnym	zakresie	akryl na zamówienie można kupić w arkuszach i obrobić zgodnie z przeznaczeniem. Rysunek techniczny pokazany na Rysunek 2 może być użyty do odtworzenia tej komory.
Kwadratowa szalka Petriego	Cole-Parmer	EW-14007-10
Szklany uchwyt na szkiełko	Capitol Scientific	WHE-900303
Surowica bydlęca	płodu Mediatech, Inc.	35-010-CV
Zmodyfikowany Eagle Medium	Mediatech, Inc. firmy Dulbecco	10-013-CV
Przepływomierz	Sonotec, GmbH	Sonoflow co.55/060
Zestaw elastomerów Sylgard	Sigma-Aldrich	761036-5EA
14 G Kaniula stalowa	Ogólne zaopatrzenie	laboratoryjne S8365-1