Nauka miejsca i reagowania w labiryncie wieży na otwartym polu

Podsumowanie

Labirynt Wieży Otwartego Pola (OFTM) to labirynt stworzony do badania behawioralnych i neuronalnych mechanizmów uczenia się przestrzennego (np. uczenia się miejsca lub odpowiedzi) u szczurów. Ten labirynt jest szczególnie przydatny dla eksperymentatorów, którzy chcą wykorzystać bezstresowy paradygmat labiryntu do zbadania uczenia się przestrzennego w swoich badaniach.

Streszczenie

Ten protokół opisuje, w jaki sposób paradygmat otwartego labiryntu wieży (OFTM) jest używany do badania uczenia się przestrzennego u gryzoni. Ten labirynt jest szczególnie przydatny do zbadania, w jaki sposób szczury uczą się korzystać z uczenia się miejsca lub reakcji, aby skutecznie poruszać się po arenie na otwartym polu. Ponadto protokół ten opisuje, w jaki sposób OFTM różni się od innych paradygmatów labiryntu behawioralnego, które są powszechnie stosowane do badania uczenia się przestrzennego u gryzoni. OFTM opisany w tym artykule został zaadaptowany z wcześniej opisanego przez Cole'a, Clippertona i Walta (2007). W szczególności OFTM został stworzony do testowania uczenia się przestrzennego u gryzoni bez konieczności rozważania, w jaki sposób "stres" może odgrywać rolę jako zmienna zakłócająca. Eksperymenty wykazały, że sam stres może znacząco wpływać na funkcje poznawcze¹. Sekcja reprezentatywnych wyników zawiera dane z eksperymentu, w którym wykorzystano OFTM do zbadania wpływu leczenia estradiolem na uczenie się miejsca i odpowiedzi u dorosłych samic szczurów Sprague Dawley². Przyszłe badania będą miały na celu zbadanie roli hipokampa i prążkowia w uczeniu się na miejscu i odpowiedzi w OFTM.

Wprowadzenie

Labirynt wieżowy otwartego pola (OFTM) może być wykorzystany do zbadania behawioralnych i neurobiologicznych mechanizmów uczenia się przestrzennego u gryzoni. Co ważne, OFTM pozwala naukowcom badać zarówno "place-based", jak i "response-based" typy uczenia się. Podczas uczenia się miejsca zwierzę porusza się po labiryncie, korzystając ze wskazówek przestrzennych w otaczającym środowisku (np. nagroda w postaci jedzenia znajduje się obok wysokiej latarni). Podczas uczenia się odpowiedzi zwierzę wykonuje określoną reakcję zwrotną niezależnie od swojego położenia względem wskazówek przestrzennych (np. skręć w lewo lub w prawo, aby znaleźć nagrodę w postaci jedzenia). Wcześniej donoszono, że uczenie się odpowiedzi i uczenie się w miejscu opierają się na dwóch różnych systemach pamięci^{3, 4}, a mapowanie ich mechanizmów neuronalnych jest ciągłym dążeniem naukowym^{2, 5-7}. Konstrukcja OFTM została zaadaptowana z wcześniej opisanej⁸.

Paradygmaty otwartego pola (składnik OFTM) są powszechnie używane do badania lęku u gryzoni⁹. Podczas typowego testu lęku na otwartym polu szczury, które spędzają więcej czasu na środku otwartego pola, mają niższy poziom stresu i niepokoju niż szczury, które spędzają więcej czasu w pobliżu obwodu. W OFTM szczur musi wejść do środka labiryntu, aby znaleźć nagrodę w postaci jedzenia. Dlatego prawidłowa nawigacja w OFTM wskazuje, że szczury te nie są zestresowane. Jednym z powodów, dla których szczury nie są zestresowane podczas treningu, jest to, że w przeciwieństwie do standardowych testów treningu lękowego na otwartym polu, OFTM wymaga fazy wstępnego treningu, podczas której szczur jest wstępnie wystawiony na labirynt przez długi okres czasu. Ponadto trening odbywa się w słabo oświetlonym otoczeniu, co dodatkowo zmniejsza wywołujący niepokój aspekt otwartego pola, które jest zazwyczaj jasno oświetlone.

Kolejną unikalną cechą OFTM, w porównaniu do niektórych innych labiryntów, jest sposób mierzenia nauki. Eksperymentatorzy korzystający z labiryntu wodnego Morrisa lub labiryntu Barnesa zazwyczaj mierzą uczenie się, analizując prędkość i/lub długość ścieżki, jaką pokonuje szczur, aby dotrzeć do miejsca docelowego. Na te zależne miary mogą mieć wpływ czynniki niezwiązane z uczeniem się, takie jak zmiany w ogólnej aktywności motorycznej szczura. Jednak OFTM mierzy uczenie się za pomocą procentu poprawnej odpowiedzi pierwszego wyboru, jaką szczur wykonuje, aby znaleźć nagrodę w postaci jedzenia. Ta zależna miara nie jest podatna na zmiany w sprawności motorycznej i dlatego dokładniej ocenia uczenie się niż pomiary prędkości i odległości. Niemniej jednak eksperymentator może również zmierzyć prędkość i odległość przebytą przez szczura w OFTM za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo.

Inne typy labiryntów, takie jak labirynt T, Labirynt Morrisa i Labirynt Barnesa, mogą być używane do nauki miejsca i odpowiedzi. Jednak OFTM jest wyjątkowy pod kilkoma godnymi uwagi względami. Po pierwsze, OFTM jest bardziej czułym testem behawioralnym niż labirynt T, ponieważ OFTM ma szansę na 25%, podczas gdy labirynt T ma szansę na 50%. Po drugie, szczur może skręcać tylko w jeden z dwóch sposobów w labiryncie T, ale ma nieograniczone możliwości wyznaczania trasy podczas nawigacji w OFTM. Po trzecie, w przeciwieństwie do zadań Morris Water Maze i Barnes Maze (które mają nieograniczone możliwości trasy, takie jak OFTM), eksperymenty z użyciem OFTM nie wymagają od szczurów poruszania się w sytuacji awersyjnej. Szczury są zmotywowane do poruszania się w labiryncie wodnym Morrisa, aby uciec przed pływaniem w wodzie i są zmotywowane do poruszania się w labiryncie Barnesa, aby uniknąć przebywania w otwartym, jasno oświetlonym środowisku. Wykazano, że narażenie na labirynt wodny Morrisa lub labirynt Barnesa indukuje uwalnianie hormonu stresu (tj. kortykosteronu) u gryzoni¹⁰. Jednak szczury poruszają się w OFTM, ponieważ są zmotywowane do znalezienia nagrody w postaci jedzenia, a trening odbywa się przy słabym oświetleniu otoczenia. W związku z tym OFTM jest nieawersyjnym zadaniem pożądawczym. Wyniki eksperymentów, które wykorzystują paradygmat stresującego labiryntu do zbadania wpływu manipulacji, takich jak narkotyki, hormony, ćwiczenia lub dieta, na mechanizmy uczenia się i pamięci, mogą być trudne do interpretacji, ponieważ "stres" sam w sobie może wpływać na funkcje poznawcze.

Protokół

Niniejszy protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Christopher Newport.

1. Budowa aparatury OFTM

1. Zbuduj ścianę ograniczającą (wysokość 40 cm, średnica 183 cm) z trzech elementów białego laminatu. Wykonaj okrągłą podłogę labiryntu (średnica 183 cm) z czarnego laminatu i przyklej ją do plastikowego blatu stołu. Przymocuj ścianę ograniczającą do krawędzi stołu za pomocą wkrętów i kleju.
2. Zdekoruj wewnętrzną powierzchnię ściany ograniczającej: jedną ćwiartkę pozostaw jednolicie białą, jedną ćwiartkę pomaluj na jednolity czarny kolor, jedną ćwiartkę pomaluj w czarne pasy, a jedną ćwiartkę w czarne koła.
3. Zbuduj cztery „wieże z pokarmem” (8 cm x 8 cm x 20 cm; Rysunek 1A), wycinając je z kwadratowego białego słupka PVC. Do szczytu każdej wieży przyklej kawałek czarnego laminatu (8 cm x 8 cm). Przymocuj je do podłogi labiryntu za pomocą kleju błyskawicznego w odstępach 54 cm od siebie.
4. Zbuduj trzy „wieże do wstępnego treningu” (odpowiednio o wysokościach 5 cm, 10 cm i 15 cm; Rysunek 1B) z kwadratowego białego słupka PVC. Do szczytu każdej wieży przyklej kawałek czarnego laminatu (8 cm x 8 cm). Wieże te są przyklejone taśmą do podłogi labiryntu wyłącznie podczas fazy wstępnego treningu (opisanej poniżej).
5. Do szczytu każdej wieży z pokarmem przyklej jeden czarny nieprzezroczysty plastikowy kubeczek na pokarm z nakrętką (wykorzystując przezroczysty plastikowy pojemnik na koraliki pomalowany na czarno; wysokość 1,75 cm, średnica 3,75 cm). W każdej nakrętce wywierć trzy małe otwory wentylacyjne (średnica 3 mm). Otwory te uniemożliwiają szczurowi zlokalizowanie „właściwej” wieży z pokarmem za pomocą wskazówek zapachowych. Wysokość wież treningowych sprawia, że szczur nie może zlokalizować „właściwej” wieży, traktując niezakryty kubeczek z pokarmem jako wskazówkę wizualną.

Rycina 1. Fotografie labiryntu wieżowego w otwartym polu (Open-field Tower Maze, OFTM). (A) Szczur jest w stanie odnaleźć i pobrać nagrodę pokarmową tylko z jednej „wieży treningowej” z przynętą w fazie nabywania, a także podczas wszystkich późniejszych treningów i testów. (B) Podczas wstępnego treningu w centrum areny labiryntu umieszczone są trzy „wieże wstępne”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Pomieszczenie z labiryntem OFTM

1. Użyj lampy z żarówką 60 W (Lumens: 800), aby słabo oświetlić pomieszczenie z labiryntem. Lampa powinna znajdować się 3 ft nad podłogą i 2 ft z boku labiryntu, będąc skierowaną w stronę sufitu. W tle odtwórz biały szum (~70 dB) za pomocą generatora dźwięków.
2. Zamontuj cyfrową kamerę wideo na suficie nad labiryntem, aby przesyłać obraz do komputera. Zawieś nieprzezroczystą zasłonę, aby oddzielić labirynt od obszaru monitorowania komputerowego.

3. Obsługa szczurów, restrykcje żywieniowe i kwaterowanie

1. Każdy eksperymentator powinien obchodzić się ze wszystkimi szczurami przez siedem dni (4 min dziennie) przed rozpoczęciem wstępnego treningu.
2. Wprowadzić szczury na dietę z ograniczeniem pokarmu (1 h swobodnego żerowania dziennie). Taka dieta zapewnia motywację szczurów do zdobywania nagród podczas treningu, przy jednoczesnym utrzymaniu prawidłowej masy ciała (~90% masy ciała przy swobodnym żerowaniu).
3. Przez cały czas trwania eksperymentu kwaterować szczury po dwa w klatce (w przypadku samic). Samice szczurów kwaterowane parami wykazują niższy poziom lęku niż samice kwaterowane pojedynczo¹².

4. Procedury wstępnego szkolenia

1. Umieść w każdym niezakrytym kubku z pokarmem na siedmiu wieżach nagrodę pokarmową (np. jeden kawałek płatków owocowych).
2. Umieść szczura w labiryncie w losowym miejscu i pozostaw go tam, aż odnajdzie i spożyje wszystkie siedem nagród pokarmowych, po czym wyjmij go z urządzenia.
   1. Jeśli szczur nie zdobędzie wszystkich nagród pokarmowych w ciągu 10 min, usuń go z labiryntu i powtórz procedury wstępnego treningu następnego dnia. Uwaga: niektóre szczury będą potrzebowały więcej czasu niż inne, aby początkowo nauczyć się pobierać nagrody pokarmowe z szczytów wież.
   2. Jeśli szczur nie zdobędzie i nie spożyje wszystkich siedmiu nagród pokarmowych z wież w ciągu pierwszych dwóch dni wstępnego treningu, przeprowadź dodatkowe 30 min sesje w OFTM, aż nagrody zostaną pobrane. Zazwyczaj szczur odnajdzie i spożyje wszystkie nagrody pokarmowe po jednej lub dwóch takich 30 min sesjach.

5. Procedury treningu lokalizacji i treningu odpowiedzi

1. Przypisz każdemu szczurowi dwa z czterech miejsc startowych. Zastosuj kontrbalansowanie dla następujących parametrów: punktu wypuszczenia z miejsca startowego w obrębie każdego dnia treningowego oraz pomiędzy dniami; rodzaju uczenia się (przestrzennego vs reakcyjnego); „poprawnej wieży” dla wszystkich osobników uczących się przestrzennie oraz kierunku skrętu, którego uczy się każdy osobnik uczący się reakcyjnie (w prawo vs w lewo).
2. Na początku każdego dnia treningowego włącz generator szumu i uruchom program do nagrywania wideo. Umieść przynętę we wszystkich czterech wieżach i zakryj trzy z czterech miseczek z pokarmem, pozostawiając odsłoniętą nagrodę pokarmową w wieży „poprawnej”.
3. W każdej próbie rozpocznij nagrywanie wideo (instrukcje znajdują się w instrukcji obsługi producenta), a następnie umieść szczura w labiryncie w przypisanym mu miejscu startowym. Następnie przejdź za zasłonę, aby obserwować zachowanie szczura na monitorze komputera. Wyjmij szczura z labiryntu natychmiast po pobraniu nagrody lub po upływie 3 min i zatrzymaj nagrywanie wideo.
   1. W przypadku szczurów w grupie uczenia przestrzennego zawsze używaj tej samej „poprawnej” wieży z pokarmem i umieszczaj szczura w jednym z dwóch miejsc startowych. Osobnik uczący się przestrzennie rozwiązuje OFTM poprzez odnalezienie konkretnej lokalizacji przy użyciu wskazówek przestrzennych dostępnych w labiryncie. Na przykład: umieść przynętę w wieży D (= wieża „poprawna”) i wypuść szczura z miejsca startowego „2” lub „3” (strzałki ciągłe na Rysunku 2A, po lewej), lub umieść przynętę w wieży A i wypuść szczura z miejsca startowego „1” lub „4” (strzałki przerywane na Rysunku 2A, po lewej).
   2. W przypadku szczurów w grupie uczenia reakcyjnego zmieniaj „poprawną” wieżę z pokarmem w zależności od miejsca startowego. Osobniki uczące się reakcyjnie rozwiązują OFTM poprzez naukę wykonywania określonego skrętu (np. zawsze w prawo), niezależnie od miejsca startowego w labiryncie. Na przykład: umieść przynętę w wieży D i wypuść szczura z miejsca startowego „3”, lub umieść przynętę w wieży B i wypuść tego samego szczura z miejsca startowego „2” (strzałki ciągłe na Rysunku 2B, po lewej). Dla innego szczura: umieść przynętę w wieży B i wypuść szczura z lokalizacji „1”, lub umieść przynętę w wieży A i wypuść tego szczura z lokalizacji „4” (strzałki przerywane na Rysunku 2B, po lewej).
4. Przeprowadź ze wszystkimi szczurami łącznie 48 prób treningowych w ciągu 12 dni (cztery próby dziennie).

Rycina 2. Schemat z widoku z góry przedstawiający procedury treningowe i testowe dla uczenia się miejsca oraz reakcji. Na rysunku przedstawiono lokalizacje startowe i miejsca nagrody pokarmowej dla osobników uczących się miejsca (A, lewo) i reakcji (B, lewo), a także lokalizacje startowe i nagrody stosowane podczas testu zmiany punktu startowego dla osobników uczących się miejsca (A, prawo) i reakcji (B, prawo). Numery wskazują punkt startowy szczura; szare kwadraty reprezentują wieże z pokarmem; linie ciągłe i przerywane wskazują wieżę z przynętą. Lokalizacje startowe są zrównoważone w obrębie każdego warunku treningowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Procedury testowania przełączania lokalizacji startowej

1. Gdy wszystkie szczury osiągną poziom asymptotyczny (~80% poprawnych pierwszych wyborów), przeprowadź „test zmiany miejsca startu” (Start Location Switch Test), aby sprawdzić trwałość wyuczonego zachowania.
2. Zastosuj kontrbalans dla nowych miejsc startu (i.e., miejsc startu, które nie były wcześniej wykorzystywane dla danego szczura).
3. Postępuj zgodnie z procedurami dla każdej próby treningowej opisanymi w sekcji 5 protokołu, stosując nowe miejsca startu.
   1. W przypadku szczura uczącego się miejsca, który pierwotnie był uwalniany z lokalizacji „2” lub „3” i miał wieżę D jako wieżę „poprawną”, umieść szczura w nowym miejscu startu „1” lub „4”, nadal umieszczając przynętę w wieży D (Rysunek 2A, prawa strona).
   2. W przypadku szczura uczącego się reakcji, który pierwotnie był uwalniany z lokalizacji „2” lub „3” i nauczył się skręcać w prawo, aby otrzymać nagrodę (odpowiednio w wieżach B i D), umieść szczura w nowym miejscu startu „1” lub „4” i umieść przynętę odpowiednio w wieży A lub C (co nadal wymagałoby od szczura skrętu w prawo w celu znalezienia nagrody pokarmowej) Rysunek 2B, prawa strona.
   3. Przeprowadź u wszystkich szczurów osiem prób testu zmiany miejsca startu w ciągu dwóch dni (cztery próby dziennie).

7. Analiza danych

1. Osoba oceniająca, która nie brała udziału w szkoleniu szczurów i nie zna przypisanej im grupy traktowania, powinna przeanalizować nagrania wideo z prób, zliczając liczbę reakcji szczura niezbędnych do znalezienia „poprawnej” wieży w każdej próbie (wskaźnikiem jest podniesienie się szczura nad miseczką z pokarmem).
2. Oblicz procent prób w każdym dniu szkolenia, w których szczur znalazł nagrodę przy pierwszym wyborze (% poprawnych reakcji przy pierwszym wyborze). Na podstawie tych wartości wykreśl krzywe uczenia się dla poszczególnych dni szkolenia. W analizie statystycznej wykorzystaj procent poprawnych reakcji przy pierwszym wyborze.
3. Oblicz liczbę prób, po których szczur osiągnął ustalone a priori kryterium opanowania zadania (t.j. poprawne reakcje przy pierwszym wyborze w 8 z 10 kolejnych prób). Z analizy wyklucz szczury, które nie osiągnęły kryterium a priori.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki opisane w niniejszej pracy zostały wcześniej opublikowane w czasopiśmie Neurobiology of Learning & Memory, Elsevier². W tym eksperymencie wykorzystano OFTM do zbadania wpływu przewlekłego oraz cyklicznego podawania estradiolu na uczenie się miejsca i uczenie się reakcji u samic szczurów linii Sprague-Dawley (250 – 300 g; N = 48). Zastosowanie OFTM w tym doświadczeniu było uzasadnione dwoma istotnymi powodami. Po pierwsze, wykazano, że estradiol wywołuje odmienne efekty w uczeniu się ...

Dyskusja

Do badania uczenia się i pamięci u gryzoni można wykorzystać wiele paradygmatów, a każdy z nich ma ważne kroki, które eksperymentatorzy powinni wykonać. W OFTM ważne jest, aby warunki labiryntu (np. położenie labiryntu, wskazówki wewnątrz i na zewnątrz labiryntu, słabe oświetlenie i poziom hałasu w tle, dzienny czas treningu) były utrzymywane na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu. Konieczne jest również zminimalizowanie stresu u szczurów, aby zapewnić ciągłą wydajność w OFTM. Stres u samic szcz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Konstrukcja OFTM dostarcza
okulary ochronne, przezroczyste, niepowlekane	Grainger	4EY97	Służy do ogólnej ochrony oczu podczas budowy labiryntu
Taśma maskująca, Beżowa, 18  mm x 55  m	Grainger	15F739	Uniwersalne
nożyce Wiss	Home Depot	37103278647	Ogólne zaopatrzenie
Okrągły stół składany Lancaster 6 stóp - Heavy Duty biały granit z tworzywa sztucznego - 29"	www.webstaurantstore.com	384YCZ72RND	Używany jako podstawa labiryntu
Arkusz blatu laminowanego w białym matowym wykończeniu (48 x 96 x 0,039)	Home Depot	1573603504896	Używany jako ściany do labiryntu
Laminowany arkusz blatu w czarnym matowym wykończeniu (48 x 96 x 0,039)	Home Depot	1595603504896	Używany jako podłoga labiryntu
Klej, Spray, 24  uncja, 17.6  oz netto. 3M	Grainger	3MA16	Służy do przyklejania podłogi laminowanej do blatu stołu i kawałków laminatu do siebie
16,6 uncji #90 o wysokiej wytrzymałości S	Lowe's	193252	Służy do przyklejania podłogi laminowanej do blatu Superflex
RTV, silikonowy klej uszczelniający, Loctile	VWR	300040-068	Służy do uszczelniania wokół bazy, (między podłogą a ścianami labiryntu)
Uszczelniacz przemysłowy; 10.1  oz	Grainger	4UH06	Służy do uszczelniania wokół bazy, (między podłogą a ścianami labiryntu)
Taśma maskująca malarza; Taśma Szura; 2  w x 60  yd	Grainger	6FET7	Służy do zaznaczania wzorów wizualnych na ścianach labiryntu
Mini/Trim taca na farbę	ACE Hardware	1365105	Służy do przechowywania farby
Mini wałek piankowy 4" 6  pk	ACE Hardware	1494871	Służy do malowania wzorów
Val Sample Set Nbase paint	ACE Hardware	1505031	Używany jako farba do wzoru na ścianach labiryntu
HP Paint Black	Walmart	72450405005	Służy do malowania wzoru na ścianach labiryntu
Pędzel	Walmart	81773801110	Służy do malowania wzoru na ścianach labiryntu
Taśma klejąca, 2  w x 60  yd, 10,5  mil. Black	Grainger	15F767	Służy do owijania zewnętrznej części labiryntu
4x4 8  ft PT sosnowy winyl-CTD Post W/Cap	Home Depot	40933070541	Służy do budowy wież do labiryntu
20 gramów Pro Super Glue	Lowe's	125870	Służy do przyklejania szczytów wież, wież do podłogi labiryntu i kubków na żywność do szczytów wież Pojemniki
koraliki 9 - 1/2	Michaels	652695766978	Używane jako kubki na żywność na szczycie wież
Farba w sprayu,, 12  oz	Grainger	6KP22	Służy do malowania kubków i pokrywek na żywność
Przygotowanie
Conair SU1W Sound Machine; 10 dźwięków	Home Depot	204493600	Używany do szumów tła
Lampa	Walmart	5027698392	Używany do przyciemniania oświetlenia pokoju labiryntu
ES 14 i # 160; W DayLight Żarówka spiralna 4  pk	Home Depot	762148208433	Służy do przyciemniania oświetlenia pokoju labiryntu
Zasłona prysznicowa	Walmart	3429910901	Służy do separacji między labiryntem a eksperymentatorem
Karnisz	Łóżko Wanna & Poza	76598645104	Służy do oddzielania labiryntu od eksperymentatora
Pętle Froot Płatki zbożowe	Walmart	3800039122	Używany jako nagroda
Sprzęt
Rejestrator multimediów Wideo 3:4	Noldus	NMR4-0200	Służy do nagrywania prób treningowych
Monochromatyczna kamera GigE	Noldus	XCFW-BG62	Służy do nagrywania prób treningowych
Laptop Precision M4800	Dell	N/A	Służy do uruchamiania oprogramowania wideo

na pomieszczenianagrywający