Pomiar tempa metabolizmu herbicydów w chwastach dwuskrzydłowych za pomocą testu wyciętych liści

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje, jak tempo metabolizmu herbicydów może być skutecznie określone ilościowo za pomocą wyciętych liści z chwastów dwuliściennych, zmniejszając w ten sposób zmienność i usuwając wszelkie możliwe zakłócające efekty pobierania lub translokacji herbicydów, zwykle obserwowane w testach na całej roślinie.

Streszczenie

Aby wyizolować i dokładnie określić tempo metabolizmu herbicydów w obligatoryjnym krzyżowaniu chwastów dwuliściennych, konopiach wodnych (Amaranthus tuberculatus), opracowaliśmy test wycinanych liści w połączeniu ze strategią klonowania wegetatywnego, aby znormalizować pobieranie herbicydów i usunąć translokację jako czynniki przyczyniające się do odporności na herbicydy (R) i wrażliwej (S) populacji konopi wodnych. Analizy biokinetyczne pestycydów organicznych w roślinach zazwyczaj obejmują określenie wchłaniania, translokacji (dostarczania do miejsca docelowego), losu metabolicznego i interakcji z miejscem docelowym. Metabolizm herbicydów jest ważnym parametrem do pomiaru w chwastach odpornych na herbicydy i uprawach odpornych na herbicydy i zwykle odbywa się za pomocą testów na całej roślinie przy użyciu herbicydów znakowanych radioaktywnie. Jednak jedną z trudności w interpretacji parametrów biokinetycznych pochodzących z metod obejmujących całą roślinę jest to, że na translokację często wpływa tempo metabolizmu herbicydów, ponieważ metabolity polarne zwykle nie są mobilne w roślinie po reakcjach detoksykacji herbicydów. Zalety protokołu opisanego w tym manuskrypcie obejmują powtarzalne, dokładne i szybkie określenie tempa degradacji herbicydów w populacjach R i S, znaczne zmniejszenie ilości spożywanych herbicydów znakowanych radioaktywnie, dużą redukcję materiałów roślinnych znakowanych radioaktywnie wymagających dalszego obchodzenia się i usuwania oraz możliwość wykonywania eksperymentów z herbicydami znakowanymi radioaktywnie w laboratorium lub komorze wzrostowej zamiast w szklarni. Ponieważ oporność na herbicydy nadal się rozwija i rozprzestrzenia w populacjach chwastów dwuliściennych na całym świecie, opracowana i opisana w niniejszym dokumencie metoda oznaczania wycinanych liści zapewni nieocenioną technikę badania odporności opartej na miejscu innym niż docelowe ze względu na zwiększone tempo metabolizmu herbicydów i detoksykacji.

Wprowadzenie

Odporność chwastów na herbicydy stanowi poważne zagrożenie dla globalnej produkcji żywności i włókna^1,2. Obecnie udokumentowano i przebadano tysiące odpornych populacji i biotypów z ponad stu gatunków chwastów na całym świecie³. Głównym mechanizmem, który nadaje roślinom odporność na herbicydy, jest zmiana genów i białek miejsca docelowego herbicydu, w tym mutacje genetyczne, które wpływają na kinetykę wiązania herbicyd-białko lub amplifikację genu miejsca docelowego². Detoksykacja metaboliczna poprzez zwiększoną aktywność enzymów monooksygenazy cytochromu P450 (P450) lub S-transferazy glutationowej (GST) jest kolejnym mechanizmem, który nadaje chwastom odporność na herbicydy, która różni się pod kilkoma względami od mechanizmów opartych na miejscu docelowym². Oporność metaboliczna ma znaczące konsekwencje dla tego, czy koszty przydatności roślin (czyli kary za przydatność) mogą wynikać z mechanizmu odporności na herbicydy, a także w odniesieniu do potencjału pojedynczego mechanizmu detoksykacji w celu nadania odporności krzyżowej lub wielokrotnej na herbicydy w populacjach chwastów^1,2,4. Ogólnie rzecz biorąc, metabolizm herbicydów w roślinach można podzielić na trzy odrębne fazy⁵. Faza I obejmuje konwersję lub aktywację herbicydów, taką jak hydroksylacja pierścieni aromatycznych lub grup alkilowych za pośrednictwem P450 lub reakcje N- lub O-dealkilacji, prowadzące do zwiększonej polarności i częściowej detoksykacji herbicydów^5,6. Nowo wprowadzone grupy funkcyjne w fazie I mogą zapewnić miejsca sprzężeń do sprzęgania ze zredukowanym glutationem przez GST lub z glukozą przez glikozylotransferazy zależne od UDP w fazie^{II 5,7}. Na przykład głównym początkowym metabolitem primisulffuronu metylowego w kukurydzy jest hydroksy-primisulfuron metylowy⁸, który może być dalej metabolizowany do hydroksy-primisulffuronu-glukozydu (faza II), a następnie transportowany do wakuoli w celu długotrwałego przechowywania lub dalszego przetwarzania metabolicznego^5,6 (faza III).

Konopie wodne (Amaranthus tuberculatus) to trudny do opanowania, dwuliścienny gatunek chwastów, który utrudnia produkcję kukurydzy (Zea mays), soi (Glycine max) i bawełny (Gossypium hirsutum) w Stanach Zjednoczonych. Wysoki stopień różnorodności genetycznej konopi wodnych jest ułatwiony przez ich dwupienną biologię i zapylanie przez wiatr na duże odległości, a pojedyncza żeńska roślina konopi wodnych może wyprodukować do miliona nasion⁹. Nasiona te są małe i łatwo się rozprzestrzeniają, co w naturalny sposób nadaje konopiom wodnym skuteczny mechanizm dyspersji. Konopie wodne wykazują ciągłe kiełkowanie przez cały sezon wegetacyjny⁹, a ich nasiona są w stanie wykiełkować po kilku latach spoczynku. Konopie wodne to roślina_C4, która ma wyższe tempo wzrostu niż większość chwastów szerokolistnych w systemach uprawy roli¹⁰. Ponadto liczne populacje konopi wodnych są odporne na wiele rodzin herbicydów³.

Populacja konopi wodnych (oznaczona jako MCR) z Illinois jest odporna na herbicydy hamujące dioksygenazę 4-hydroksy-fenylopirogronianu (HPPD)¹¹, takie jak mezotrion, a także na herbicydy hamujące atrazynę i syntazę acetomleczanu (ALS), w tym primisulfuron metylowy, dzięki mechanizmom nieopartym na miejscu docelowym^12,13. Inna populacja konopi wodnych oznaczona jako ACR¹⁴, która jest oporna na metylo primisulfuron (z powodu mutacji w genie ALS) i odporna na atrazynę, ale wrażliwa na mezotrion, oraz populacja konopi wodnych oznaczona WCS¹⁴, która jest wrażliwa na primisulfuron metylowy, mezotrion i atrazynę, zostały wykorzystane w porównaniu z MCR w naszych wcześniejszych badaniach¹² i obecnych eksperymentach (podsumowanych w Tabeli 1). Wstępne badania nie wykryły zmian w sekwencji lub poziomach ekspresji genu HPPD ani zmniejszonego wychwytu mezotrionu w populacji MCR w porównaniu z populacjami wrażliwymi na mezotrion¹². Jednak badania metabolizmu na całych roślinach wykazały znacznie niższe poziomy rodzicielskiego herbicydu mezotrionu w MCR w porównaniu z ACR i WCS, co korelowało z wcześniejszymi odpowiedziami fenotypowymi na mezotrion^11,12.

Populacja konopi wodnych	skrót	Fenotyp do mezotrionu	Mechanizm oporności na mezotrion	Fenotyp do Primisulfuronu	Mechanizm oporu primisulfuronu
Odporny na hrabstwo McLean	Mcr	odporny	metabolizm*	odporny	metabolizm
Odporny na hrabstwo Adams	Konferencja ACR	czuły	-	odporny	Mutacja w miejscu docelowym w ALS14
Hrabstwo Wayne - Sensitive	Wcs	czuły	-	czuły	-

* Mechanizmy oporności niezwiązane z miejscem docelowym, inne niż zwiększony metabolizm, mogą również nadawać oporność na mezotriony w populacji MCR¹².

Tabela 1: Opis populacji konopi wodnych z Illinois użytych w tym badaniu.

Oprócz określenia tempa metabolizmu herbicydów w nienaruszonych sadzonkach konopi wodnych, w naszych poprzednich badaniach opracowano i zastosowano inne eksperymentalne podejście do zbadania metabolizmu za pomocą testu na wyciętych liściach konopi wodnych¹², jak również różnych inhibitorów P450 (np. tetcyclacis i malation). Metoda ta została zaadaptowana specjalnie dla konopi wodnych na podstawie wcześniejszych badań metabolizmu primisulfuronu i metylu w wycinanych liściach kukurydzy¹⁵, ponieważ test wyciętych liści nie został jeszcze zgłoszony do prowadzenia badań metabolizmu herbicydów w roślinie dwuliściennej. Insektycyd organicznoorganiczny malation był często stosowany w badaniach metabolizmu herbicydów in vivo i in vitro w celu wskazania udziału P450¹⁶. Na przykład tolerancja i szybki metabolizm mezotrionu w kukurydzy są spowodowane hydroksylacją pierścieniową katalizowaną przez P450, co zostało zweryfikowane, gdy malation zwiększył wrażliwość kukurydzy na mezotrion¹⁷. Podobnie, malation hamował metabolizm inhibitora ALS primisulffuronu metylowego w wycinanych liściach kukurydzy¹⁵. Główną zaletą techniki wycinania liści jest to, że generowane dane są niezależne od wzorców translokacji całej rośliny, co jest ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę przy ocenie metabolizmu ogólnoustrojowych, powschodowych herbicydów w roślinach. W związku z tym metoda ta pozwala na ilościowe i jakościowe analizy metaboliczne skoncentrowane na pojedynczym liściu^{poddanym działaniu środka 12}.

Strategia klonowania wegetatywnego, w połączeniu z protokołem wycinania liści, była wcześniej stosowana w konopiach wodnych do prowadzenia badań nad metabolizmem¹². Ze względu na krzyżówkowy charakter konopi wodnych (oddzielne rośliny męskie i żeńskie) oraz duży stopień różnorodności genetycznej w obrębie dwupiennych gatunków Amaranthus ⁹, protokół ten zapewnił, że genetycznie identyczne sadzonki konopi wodnych zostały przeanalizowane w ramach eksperymentów w czasie. W artykule przedstawiono przydatność metody wycinanych liści do pomiaru tempa metabolizmu herbicydów w chwastach dwuliściennych (konopiach wodnych). Ilość pozostałego herbicydu macierzystego została określona w każdym punkcie czasowym (rysunek 1) za pomocą nieliniowej analizy regresji metodą najmniejszych kwadratów i dopasowana do prostej krzywej pierwszego rzędu w celu oszacowania czasu degradacji 50% wchłoniętego herbicydu (DT₅₀). Reprezentatywne chromatogramy z wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC) są wyświetlane dla odpornych na ALS i wrażliwych populacji konopi wodnych, co wskazuje na zanik herbicydu macierzystego i jednoczesne tworzenie się metabolitu (metabolitów) polarnego podczas badania w czasie (ryc. 2). Celem naszego artykułu jest opisanie i zademonstrowanie użyteczności testu wyciętych liści w połączeniu z metodą klonowania wegetatywnego w celu określenia precyzyjnych i powtarzalnych wskaźników metabolizmu herbicydów w roślinach dwuliściennych, przy użyciu herbicydów jednolicie znakowanych pierścieniowo (^URL-14C) w trzech populacjach konopi wodnych, które różnią się reakcjami całej rośliny na herbicydy hamujące HPPD i ALS (Tabela 1).

Protokół

1. Materiał roślinny, warunki wzrostu i klonowanie wegetacyjne

Uwaga: W niniejszym badaniu przebadano trzy populacje amarantusa (waterhemp): MCR (z hrabstwa McLean, IL), ACR (z hrabstwa Adams, IL) oraz WCS (z hrabstwa Wayne, IL) ( Tabela 1).

1. Zebrać i zawiesić nasiona amarantusa grąsza w roztworze agar:woda o stężeniu 0,1 g L^-1 w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 dni w celu zwiększenia kiełkowania. Uwaga: Niektóre populacje amarantusa grąsza wykazują uśpienie, ale ten etap pomaga przełamać spoczynek i sprawić, że nasiona kiełkują bardziej jednorodnie.
2. Kiełkować nasiona każdej populacji amarantusa grąsza (zgodnie z Table 1) w tacach o wymiarach 12 x 12 cm zawierających podłoże ogrodnicze w szklarni.
   1. Utrzymywać warunki w szklarni przy temperaturach dzień/noc 28/22 °C w ramach 16/8-godzinnego fotoperiodu¹².
   2. Uzupełnić naturalne oświetlenie w szklarni światłem z lamp halogenowych, aby zapewnić minimalny strumień fotonów 500 µmol m^-2 sec^-1 na poziomie korony roślin.
3. Przesadzić wykiełkowane siewki o wysokości 2 cm do doniczek o pojemności 80 cm³ w szklarni.
4. Przesadzić siewki do doniczek o pojemności 950 cm³ zawierających mieszankę podłoża ogrodniczego:ziemi:torfu:piasku w proporcji 3:1:1:1, gdy siewki osiągną 4 cm wysokości. Do każdej doniczki dodać 5 g granulek nawozu o spowolnionym uwalnianiu i wymieszać z podłożem.
5. Odciąć i usunąć merystem szczytowy pędu zawierający trzy najmłodsze liście z roślin o wysokości 7 cm, aby wyeliminować dominację wierzchołkową.
   Uwaga: Ten etap zapewnia, że każda roślina wytworzy wystarczającą liczbę 3-centymetrowych pędów bocznych do klonowania.
6. Wyciąć pięć pędów bocznych (o długości 3 cm), gdy siewki osiągną około 14 cm wysokości, z każdej populacji amarantusa grąsza (zgodnie z Table 1). Usunąć większość liści z tych pędów bocznych, aby zmniejszyć utratę wody podczas dalszych zabiegów, pozostawiając jednak dwa najmłodsze liście, aby umożliwić dalszy wzrost po przesadzeniu.
   Uwaga: Postępować ostrożnie, aby nie uszkodzić pędów podczas usuwania liści. Oznaczyć każdą roślinę za pomocą etykiety.
7. Przesadzić pędy boczne do doniczek o pojemności 80 cm³ (jedna siewka na doniczkę) do podłoża ogrodniczego, takiego samego, jakiego użyto do kiełkowania. Podłoże powinno być początkowo nasycone wodą aż do momentu uformowania się korzeni w komorze wzrostu; następnie utrzymać stałą wilgotność i pozostawić doniczki w komorze wzrostu na 7 dni w celu ukorzenienia.
   Uwaga: Rośliny są w tym momencie bardzo wrażliwe i nie powinny być poddawane stresowi.
   1. Utrzymywać warunki w komorze wzrostu przy temperaturach dzień/noc 28/22 °C w ramach 16/8-godzinnego fotoperiodu¹².
   2. Do oświetlenia komory wzrostu można użyć kombinacji żarówek żarowych i fluorescencyjnych, która powinna zapewnić strumień fotonów co najmniej 550 µmol m^-2 sec^-1 na poziomie korony roślin¹².
8. Ponownie przesadzić rośliny do doniczek o pojemności 950 cm³ (jedna siewka na doniczkę) zawierających mieszankę podłoża ogrodniczego:ziemi:torfu:piasku w proporcji 3:1:1:1 (dołączyć również 5 g granulek nawozu o spowolnionym uwalnianiu), gdy sklonowane rośliny osiągną 4 cm wysokości, a następnie przenieść je z powrotem do szklarni.
9. Sklonować rośliny po raz drugi, stosując tę samą metodę opisaną powyżej (t.j. powtórzyć kroki od 1.5 do 1.8, a następnie przejść do kroku 2.1). Dla typowego badania przebiegu czasowego przygotować klony z co najmniej sześciu niezależnych roślin z każdej populacji amarantusa grąsza i oznaczyć je jako linie MCR_1-6, ACR_1-6 oraz WCS_1-6.
   1. Ustanowić co najmniej sześć odrębnych klonalnych linii „rodzicielskich”, aby umożliwić powtórzenie eksperymentu i odpowiednio reprezentować zmienność genetyczną w obrębie każdej populacji amarantusa grąsza.
   2. W zależności od liczby analizowanych punktów czasowych, przygotować wystarczającą liczbę subklonów z każdej klonalnej linii „rodzicielskiej” do przeprowadzenia badania przebiegu czasowego.

2. Przeprowadzenie badania metabolizmu z wykorzystaniem wyciętych liści rdestnicy wodnej

1. W celu analizy metabolizmu herbicydu i DT₅₀ odciąć trzecie od końca najmłodsze liście (o długości 2 do 3 cm; wliczając 0,5 cm przytwierdzonego ogonka) z klonowanych roślin amarantusa komputerowego (waterhemp) o wysokości od 10 do 12 cm.
2. Ponownie odciąć ogonki liściowe z każdej rośliny amarantusa komputerowego pod wodą (zapewniając pozostawienie 0,3 cm ogonka) i umieścić odcięte końce w plastikowych probówkach o pojemności 1,5 ml (jeden liść na probówkę)¹⁵.
   Uwaga: Ponowne cięcie pod wodą zapobiega powstawaniu pęcherzyków powietrza i zatykaniu naczyń ksylemu.
   1. W pierwszej kolejności częściowo zanurzyć odcięte liście z przeciętymi ogonkami w buforze do preinkubacji (200 µl) składającym się z 0,1 M Tris-HCl (pH 6) na 1 h.
   2. Następnie przenieść każdy liść do nowej probówki 1,5 ml zawierającej bufor inkubacyjny (200 µl) składający się z 0,1 M Tris-HCl (pH 6) oraz 150 µM herbicydu [URL-¹⁴C] i inkubować w temperaturze 28 °C przez 1 h, aby umożliwić absorpcję herbicydu przez liście.
      Uwaga: W naszych badaniach zastosowano zarówno ¹⁴C-mesotrion, jak i ¹⁴C-primisulfuron-methyl z aktywnością właściwą wynoszącą około 20 mCi mmol^-1. Zarówno dyfuzja, jak i pobieranie poprzez strumień transpiracyjny ksylemu wpływają na ilość herbicydu pobranego przez liść.
      Uwaga: Wpływ inhibitorów metabolicznych na metabolizm herbicydu można określić poprzez modyfikację kroków 2.2.1 i 2.2.2 opisanych powyżej. Należy dodać 100 µM inhibitora do buforu do preinkubacji i inkubować przez 2 h, a następnie przenieść do buforu inkubacyjnego z herbicydem i ponownie dodać 100 µM inhibitora. Przykładowo, malation i tetcyclacis hamują niektóre aktywności cytochromu P450 w roślinach^15-17.
   3. Przemyć zanurzoną część odciętych liści wodą dejonizowaną i przenieść liście do roztworu soli Murashige i Skooga (MS) o ćwierci stężeniu (500 µl) odpowiednio na 0 h, 5 h, 11 h, 23 h lub 35 h w komorze wzrostowej w celu przeprowadzenia badania kinetyki metabolizmu.
3. Zebrać próbki, wyjmując liście z roztworu inkubacyjnego w odpowiednim punkcie czasowym, a następnie ręcznie rozetrzeć tkankę każdego liścia w ciekłym azocie, używając probówki polipropylenowej (15 ml) i szklanego tłuczka.
4. Wyekstrahować znakowany radiacyjnie herbicyd i jego metabolity z każdego liścia za pomocą 7 ml 90% acetonu przy użyciu laboratoryjnego homogenizatora do tkanek w tej samej probówce polipropylenowej co powyżej. Przepłukać homogenizator dodatkowymi 7 ml 90% acetonu i kontynuować homogenizację do całkowitego sproszkowania tkanki (zazwyczaj około 2 min). Uwaga: 90% aceton może być stosowany do ekstrakcji większości herbicydów z tkanek roślinnych. Jeśli jednak metoda ta nie pozwoli na wyekstrahowanie więcej niż 90% zaabsorbowanych związków znakowanych, jako rozpuszczalnik do ekstrakcji można zastosować 90% metanol lub 90% acetonitryl.
5. Oznakować ekstrakty w 90% acetonie (łącznie 14 ml) i przechowywać w temperaturze -4 °C przez 16 h, aby umożliwić dalszą ekstrakcję.
   Uwaga: Po przeprowadzeniu tej ekstrakcji z traktowanych liści ilość ekstrahowalnej radioaktywności wynosi zazwyczaj co najmniej 98% związków znakowanych zaabsorbowanych przez traktowany liść. Radioaktywność nieekstrahowalna (pozostałości związane) w odciętych liściach wynosiła średnio tylko 0,3% we wszystkich punktach czasowych w naszym poprzednim badaniu¹², jednak wartość ta może się różnić w zależności od zastosowanego herbicydu i badanego punktu czasowego.
6. Odwirować próbki przy 5,000 x g przez 10 min i zagęścić nadlodzie w temperaturze 40 °C za pomocą ewaporatora obrotowego, aż do uzyskania końcowej objętości 0,5 ml. Przenieść tę objętość do plastikowej probówki 2,0 ml.
7. Dodać acetonitryl:wodę (1:1 objętościowo), aby dostosować końcową objętość ekstraktów roślinnych do 1,25 ml, a następnie ponownie odwirować przy 10,000 x g przez 10 min w celu usunięcia ewentualnych cząstek stałych.
8. Zmierzyć całkowitą radioaktywność w aliquocie pobranym z każdej próbki (dpm µl^-1) za pomocą spektroskopiicyntylacyjnej w cieczy (LSS)¹² i znormalizować ilości wstrzykiwanych związków [¹⁴C-znakowanych] do analizy HPLC (na przykład 10,000 całkowitego dpm/próbka/pomiar), aby osie y były jednolite dla wszystkich próbek podczas przedstawiania wyników na wykresach.

3. Analiza HPLC metabolizmu herbicydu w wyciętych liściach

Uwaga: Rozdziel całkowitą ekstrahowalną radioaktywność na herbicyd macierzysty i metabolity herbicydu, stosując następujące warunki RP-HPLC¹².

1. Przeprowadź analizę RP-HPLC z użyciem kolumny C₁₈ (4,6 x 250 mm, rozmiar cząstek 5 µm dla analitycznej HPLC) przy szybkości przepływu 1 ml min^-1 dla większości herbicydów niepolarnych.
   Uwaga: Do optymalizacji rozdziału macierzystego herbicydu od jego metabolitów można również zastosować kolumny RP-HPLC C₄ lub C₁₂. W celu ochrony i przedłużenia żywotności kolumny RP można również zastosować filtr przedkolumnowy i/lub kolumnę ochronną.
   1. W analizie RP-HPLC zastosuj następującą fazę ruchomą: Eluent A, 0,1% kwasu mrówkowego (v/v) w wodzie oraz Eluent B, 100% acetonitrylu klasy HPLC.
      Uwaga: Jako Eluent B do rozdziału bardziej polarnych związków i metabolitów można również zastosować metanol klasy HPLC, jednak należy pamiętać, że może to zmienić czasy retencji.
      Uwaga: Profil elucji zastosowany w naszych badaniach ¹² do rozdziału mezotrionu lub primisulfuronu-metylu od ich polarnych metabolitów to: Krok 1, od A:B (4:1, v/v) do A:B (3:2, v/v) w gradiencie liniowym (12 min); Krok 2, od A:B (3:2, v/v) do A:B (3:7, v/v) w gradiencie liniowym (5 min); Krok 3, od A:B (3:7, v/v) do A:B (1:9, v/v) w gradiencie liniowym przez 2 min (łącznie 19 min).
      Uwaga: Gradienty i kroki izokratyczne mogą wymagać korekty w zależności od właściwości fizycznych substancji macierzystej w celu optymalizacji rozdzielczości.
   2. Po powyższych krokach gradientu liniowego zastosuj gradient liniowy od A:B (1:9, v/v) do A:B (4:1, v/v) (3 min) oraz krok izokratyczny A:B (4:1, v/v) (przez co najmniej 2 min), aby ponownie zrównoważyć kolumnę RP przed wstrzyknięciem kolejnego ekstraktu¹².
2. Wykryj i zwizualizuj związki znakowane promieniotwórczo za pomocą analizatora scyntylacyjnego z przepływem (Flow Scintillation Analyzer). Zapisz ilość pozostałego herbicydu macierzystego w każdej próbce jako procent całkowitej radioaktywności w każdej próbce (wykrytej i ilościowo określonej przez analizator scyntylacyjny z przepływem zgodnie z instrukcjami producenta), aby określić tempo metabolizmu herbicydu w każdej populacji amarantusa w badanym okresie czasu.

4. Procedury statystyczne

1. Rozmieść warianty doświadczalne w całkowicie zrandomizowanym układzie (lub innym układzie odpowiednim do analizy statystycznej). 
2. Przeprowadź dwa niezależne doświadczenia dla każdego wariantu, z których każde składa się z trzech powtórzeń biologicznych. Dwa niezależne doświadczenia obejmują łącznie sześć powtórzeń biologicznych. Jeśli efekt doświadczenia jest nieistotny (α = 0,05), połącz i przeanalizuj dane z każdego niezależnego doświadczenia. Jeśli efekt doświadczenia jest istotny, przeanalizuj każde doświadczenie osobno.
   Uwaga: W Experiment 1 uwzględnij pierwsze trzy powtórzenia biologiczne, a w Experiment 2 kolejne trzy powtórzenia biologiczne. Każde powtórzenie biologiczne reprezentuje odrębną „rodzicielską” linię klonalną pochodzącą z każdej populacji (MCR_1-6, ACR_1-6 oraz WCS_1-6), aby każda analiza przebiegu czasowego wykorzystywała rośliny identyczne genetycznie. Dwa niezależne doświadczenia obejmują łącznie sześć powtórzeń biologicznych, co pozwala na odpowiednią reprezentację zmienności genetycznej i wyznaczenie mediany DT₅₀ dla każdej populacji komosy teoretycznej.
3. Przeanalizuj dane za pomocą nieliniowej analizy regresji metodą najmniejszych kwadratów i dopasuj je do prostej krzywej pierwszego rzędu w celu oszacowania DT₅₀s. Poniższe równanie opisuje ten model:
   
4. gdzie w tym modelu y reprezentuje procent pozostałego herbicydy macierzystego w czasie t, µ_i to DT₅₀ dla każdej populacji komosy teoretycznej i, a parametr C₀  jest szacowaną ilością herbicydy macierzystej obecnej w t = 0¹².

Wyniki

Wykryto znaczne różnice w szybkościach metabolizmu mezotriionu pomiędzy populacjami WCS lub ACR a MCR (Rysunek 1). W każdym punkcie czasowym MCR metabolizowała mezotriion szybciej niż dwie populacje wrażliwe na mezotriion, WCS i ACR, co koreluje z wcześniejszymi odpowiedziami fenotypowymi całych roślin¹¹. Dzięki klonowaniu odpowiedniej liczby roślin z jednej rośliny rodzicielskiej z każdej populacji, analizy kinetyki metabolizmu herbicydu są jednorodne i powtarzalne ze względu...

Dyskusja

Opisana w niniejszym dokumencie metoda wycinania liści była wcześniej stosowana w badaniach nad metabolizmem primisulfuronu w liściach kukurydzy¹⁵, ale nasze wyniki pokazują, że protokół ten jest również skuteczny, dokładny i powtarzalny w pomiarze metabolizmu herbicydów w gatunkach chwastów dwuliściennych¹². Główną zaletą techniki wycinania liści w porównaniu z badaniami na całej roślinie jest to, że wycięty liść jest niezależny od wzorców translokacji całej rośliny powschodowych, herbicydów ogólno...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	Sigma-Aldrich	A1296	do nasion wstępnie kiełkujących
Podłoże doniczkowe	Sun Gro Horticulture	49040233	do wzrostu roślin
Nutricote	Agrivert	TOTAL BLEND 13-13-13 T100	nawóz o spowolnionym działaniu
Komora wzrostu E15	Controlled Environments Limited	20207	hodowla roślin
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500	bufor do wycinanych liści
HCl (skoncentrowany)	Fisher Scientific	A144500	regulują pH buforu
Sole Murashige i Skoog (MS)	Sigma-Aldrich	M0404	inkubacja wyciętych liści
Metanol Fisher	Scientific	A452-4	płucze liście po inkubacji
Aceton	Sigma-Aldrich	179124	ekstrakcje roślinne
Acetonitryl (klasa HPLC)	Macron Fine Chemicals	MKH07610	HPLC faza ruchoma
Kwas mrówkowy	Mallinckrodt Analytical	MK259205	zakwaszania fazy ruchomej
Mikrowirówka	Eppendorf	5417R	Probówki 1,5 lub 2,0 ml
Wirówka (z kontrolowaną temperaturą)	Eppendorf	5810R	Probówki 15 lub 50 ml
Probówka wirówkowa z polipropylenu	Corning Inc.	430790	15 ml, sterylny
Parownik obrotowy	BÜ Koncentrat CHI	R200	próbki
roślinne Płynna spektrometria scyntylacyjna (LSS)	Packard Instruments	104470	określa ilościowo 14C
Wysokosprawna chromatografia cieczowa	Perkin Elmer	N2910401	rozpuszczaniu metabolitów herbicydów
Przepływowy analizator scyntylacyjny	LabLogic System	1103303	do analizy HPLC kolumny 14C
Hypersil Gold C18	Thermo-Scientific	03-050-522	odwrócona faza
Ultima-Flo M	Perkin Elmer	6013579	do analizatora przepływowo-scyntylacyjnego
Koktajl scyntylacyjny (ScintiVerse BD)	Fisher Scientific	SX18	do LSS; biodegradowalny
Homogenizator	laboratoryjny Kinematica	CH-6010	Homogenizacja próbek liści

pH koktajl