Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Broder Rühmann; Jochen Schmid; Volker Sieber

doi:10.3791/53249

Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

DOI:

10.3791/53249

⸱

11 kwietnia 2016

Broder Rühmann¹ , Jochen Schmid¹ , Volker Sieber¹

¹Chair of Chemistry of Biogenic Resources, Technische Universität München

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy zautomatyzowaną, modułową, wysokoprzepustową metodę identyfikacji i charakterystyki mikrobiologicznych egzopolisacharydów w małej skali. Metoda ta łączy szybką preselekcję w celu analizy całkowitej ilości wydzielanych polisacharydów ze szczegółowym odciskiem palca węglowodanów, aby umożliwić szybkie badanie przesiewowe nowo wyizolowanych szczepów bakteryjnych lub całych kolekcji szczepów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele mikroorganizmów jest zdolnych do produkcji i wydzielania egzopolisacharydów (EPS), które mają ważne implikacje w dziedzinach medycyny, zastosowań spożywczych lub w zastępowaniu chemikaliów na bazie ropy naftowej. Opisujemy platformę analityczną, która ma być zautomatyzowana w systemie obsługi cieczy, która umożliwia szybką i niezawodną analizę rodzaju i ilości EPS wytwarzanego przez mikroorganizmy. Umożliwia użytkownikowi identyfikację nowych naturalnych mikrobiologicznych producentów egzopolisacharydów oraz analizę odcisku palca węglowodanów odpowiednich polimerów w ciągu jednego dnia w wysokiej przepustowości (HT). Za pomocą tej platformy można badać kolekcje szczepów, a także biblioteki wariantów szczepów, które można uzyskać w podejściach inżynieryjnych. Platforma ma modułową konfigurację, która pozwala na rozdzielenie protokołu na dwie główne części. Po pierwsze, istnieje zautomatyzowany system przesiewowy, który łączy w sobie różne moduły wykrywania polisacharydów: półilościową analizę tworzenia lepkości na etapie wirowania, analizę tworzenia polimerów poprzez wytrącanie alkoholu oraz oznaczanie całkowitej zawartości węglowodanów poprzez przemianę fenolowo-siarkowo-kwasową. W tym przypadku możliwe jest przesiewanie do 384 szczepów na cykl. Druga część zawiera szczegółową analizę monosacharydów dla wszystkich wybranych producentów EPS zidentyfikowanych w pierwszej części poprzez połączenie dwóch podstawowych modułów: analizy pełnego składu monomerów za pomocą ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z wykrywaniem pułapki jonowej w ultrafiolecie i jonizacji elektrorozpylanej (UHPLC-UV-ESI-MS) oraz oznaczania pirogronianu jako podstawnika polimerowego (obecność ketalu pirogronianowego) poprzez utlenianie enzymatyczne, które jest sprzężone z tworzeniem koloru. Wszystkie moduły analityczne tej platformy przesiewowej można łączyć na różne sposoby i dostosowywać do indywidualnych wymagań. Dodatkowo wszystkie mogą być obsługiwane ręcznie lub wykonywane za pomocą systemu obsługi cieczy. W ten sposób platforma przesiewowa zapewnia ogromną elastyczność w identyfikacji różnych EPS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiologiczne egzopolisacharydy (EPS) to strukturalnie bardzo zróżnicowana grupa polimerów, które spełniają różne funkcje biologiczne. Zwykle są one zbudowane ze złożonych jednostek powtórzeniowych, które wyróżniają się różnymi rodzajami monomerów (cukier, pochodne cukru, kwasy cukrowe), wiązaniami między tymi monomerami i ich podstawieniami. Różnorodność strukturalna polisacharydów mikrobiologicznych nadaje raczej różne cechy członkom tej klasy cząsteczek, co pozwala na ich zastosowanie w różnych dziedzinach, takich jak żywność¹, kosmetyki^2,3, chemia budowlana⁴ lub uzdatnianie wody⁵. Aby jeszcze bardziej poszerzyć zakres zastosowań tych biopochodnych i takich zrównoważonych polimerów, identyfikacja nowych naturalnych polisacharydów mikrobiologicznych, a także inżynieria wariantów strukturalnych stanowią obiecujące podejście. Tak czy inaczej, wymagana jest szybka metoda przesiewowa, aby szybko zeskanować ogromną liczbę szczepów drobnoustrojów pod kątem tworzenia polisacharydów i przeanalizować ich produkty. W związku z tym opracowaliśmy niedawno 96-dołkową platformę przesiewową HT do analizy produkcji polisacharydów mikrobiologicznych z naturalnych izolatów lub zmodyfikowanych wariantów szczepów, która obejmuje identyfikację składu monomerycznego⁶.

Zastosowanie tej platformy do pierwszej rundy badań przesiewowych ~500 naturalnych izolatów pozwoliło nam zidentyfikować tylko około 10 do 20% izolowanych szczepów jako zdolnych do produkcji EPS (dane nie pokazane). Oznacza to, że 80-90% analizowanych szczepów nie wytwarzało EPS w zastosowanych warunkach, a zatem dalsza analiza szczegółowego odcisku palca węglowodanów nie była konieczna. Ponieważ ta wysoce wyrafinowana identyfikacja składu monomerycznego jest procesem czasochłonnym, zwłaszcza w przypadku analizy danych, szybka metoda wstępnego badania przesiewowego w celu identyfikacji szczepów dodatnich w produkcji EPS drastycznie zwiększyłaby wydajność. Ponadto odczynniki, materiały eksploatacyjne i czas pomiaru w UHPLC-UV-ESI-MS zostałyby zredukowane. Ponadto różne moduły analityczne z jednej strony sprawiają, że metoda jest wysoce niezawodna, ale z drugiej strony komplikują ręczną obsługę więcej niż dwóch 96-dołkowych płytek równolegle, a tym samym ograniczają pełny potencjał metody. Z tych powodów zdecydowaliśmy się na opracowanie zautomatyzowanej platformy przesiewowej. W związku z tym połączyliśmy modułowy format istniejącej techniki odcisków palców węglowodanów z w pełni zautomatyzowaną metodą szybkiego wykrywania całkowitej zawartości cukru, opartą na pomiarze absorbancji.

Metoda kwasu fenolowo-siarkowego nadal stanowi metodę wyboru do szybkiego oznaczania całkowitej zawartości węglowodanów w bakteryjnych i roślinnych polisacharydach^7,8. Metoda ta została po raz pierwszy opisana przez Dubois i wsp. ⁹ i dostosowane do różnych zastosowań i wielkości próbek, nawet dla małych skali na płytkach 96-dołkowych^10,11. Metoda kwasu fenolowo-siarkowego mierzy całkowitą zawartość węglowodanów za pomocą jednej wartości, sumując wszystkie węglowodany monomeryczne, oligomeryczne i polimerowe w próbkach.

Biorąc pod uwagę te aspekty, wybór odpowiedniego podłoża uprawowego jest niezbędny do zastosowania tej metody. Złożone podłoża zawierające oligomeryczne lub polimerowe związki węglowodanowe, takie jak ekstrakt drożdżowy, mogą prowadzić do zmiany zawartości polimeru i dlatego należy ich bezwzględnie unikać. Ponadto duże ilości cukrów są wykorzystywane jako źródło C do uprawy szczepów. Wysoki poziom węglowodanów pozostałych w procesie uprawy może negatywnie wpływać na pomiar zawartości EPS.

Dlatego zaleca się stosowanie zdefiniowanych i czystych cukrów. W naszych eksperymentach wykorzystaliśmy glukozę do hodowli komórek. Pozostała glukoza po hodowli została zredukowana przez filtrację żelową i oznaczona za pomocą testu glukozy. Na koniec obliczono ekwiwalenty glukozy polisacharydów, odejmując pozostałą glukozę po filtracji żelowej od całkowitej zawartości węglowodanów, która została wykryta metodą fenolowo-siarkową. Filtracja żelowa i test glukozy w połączeniu z metodą fenolowo-siarkową zapewniają wiarygodne wyniki i mogą być naszym pierwszym, całkowicie zautomatyzowanym systemem wykrywania.

Dwa nowe moduły analityczne zostały włączone do zautomatyzowanej platformy przesiewowej, aby zwiększyć ilość informacji z systemu wykrywania EPS: opady i obserwacja wzrostu lepkości.

Wiele różnych EPS - np. sukcynoglikan, ksantan i kwas okrężnicy¹² - są modyfikowane niewęglowodanowym ketalem pirogronianowym na pozycjach cukru C4 i C6. Te ketale pirogronianowe (podobnie jak półestry sukcynylu i kwasy uronowe) przyczyniają się do charakteru polianionowego, a tym samym do właściwości fizycznych polimeru poprzez oddziaływanie za pośrednictwem dwuwartościowych mostków kationowych¹³. W celu zidentyfikowania tych konkretnych polimerów ustalono oznaczanie pirogronianu jako kolejnego dodatkowego modułu analitycznego. Zwiększa to informacje o podstawnikach polisacharydowych i ich potencjalnych właściwościach makroskopowych.

Połączenie wszystkich modułów umożliwia identyfikację różnych EPS, jak również szybkie i efektywne określenie producentów EPS. W ten sposób platformę przesiewową można podzielić na dwie główne części (rys. 1). W ramach zautomatyzowanego przesiewania (część I) przepływ pracy jest w pełni zautomatyzowany (Tabela 1) w celu szybkiej wstępnej selekcji szczepów wytwarzających EPS. Analiza odcisków palców węglowodanów (część II) ilościowo określa skład monomerów EPS wytwarzanych przez wstępnie wybrane szczepy. W ten sposób analiza danych została zminimalizowana w celu optymalizacji badań przesiewowych dużych zbiorów szczepów. Daje to możliwość analizy 384 szczepów w jednym zautomatyzowanym cyklu przesiewowym oraz przy dwóch możliwych seriach dziennie po 768 szczepów dziennie. Dodatkowo, analiza odcisków palców węglowodanów daje jeszcze bardziej szczegółowy przegląd wszystkich zidentyfikowanych EPS. Umożliwia to ukierunkowaną analizę i identyfikację tylko nieznacznie różniących się wariantów EPS lub zupełnie nowych w porównaniu z opisanymi już strukturami chemicznymi EPS.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zautomatyzowane badania przesiewowe

Uwaga: Wszystkie kroki związane z obsługą cieczy są wykonywane za pomocą zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy. Skład stołu roboczego robota przedstawiono na rysunku 2. Wszystkie materiały eksploatacyjne są przechowywane w karuzeli magazynowej, chyba że zaznaczono inaczej. Na wszystkich etapach zautomatyzowanego przesiewania manipulator robotyczny (RM) przesuwa materiały eksploatacyjne (płytka z głęboką studzienką (DWP), płytka z mikromiareczkowaniem (MTP), płytka reakcji łańcuchowej polimerazy (płytka PCR) i tak dalej) między pozycjami karuzeli (CP) a pozycjami stołu roboczego (WTP). Wszystkie etapy pipetowania są wykonywane za pomocą 96-kanałowego ramienia pipetowego, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie kroki są zaprogramowane i wykonywane automatycznie w formacie 96-dołkowym.

Uprawa szczepów (zadanie 1 na rysunku 1)
Uwaga: Należy zająć się inokulacją przypuszczalnych szczepów wytwarzających EPS i uszczelnianiem płytek uprawowych w sterylnych warunkach (przepływ laminarny). Zautomatyzowane szybkie przesiewanie może obsłużyć cztery 96-dołkowe płytki na cykl. Przetestowano już różne szczepy kilku rodzajów⁶.
1. Ręcznie zaszczepić kulturę wstępną (1 ml pożywki EPS w DWP) za pomocą 96-pinowego replikatora z 96-dołkowej płytki podstawowej glicerolu. Przykryj płytkę oddychającą folią uszczelniającą, aby uniknąć parowania i umożliwić napowietrzenie. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 48 godzin przy 1 000 obr./min na wytrząsarce MTP.
2. Zaszczepić główną kulturę (990 μl pożywki EPS w DWP) przenosząc 10 μl kultury wstępnej za pomocą 50 μl 12-kanałowej pipety wielopipetowej i inkubować w tych samych warunkach, co hodowla wstępna. Zwróć uwagę na wszystkie odmiany, które nie rosną.
Przygotowanie stołu roboczego robota i karuzeli magazynowej
1. Umieść wszystkie materiały eksploatacyjne wymienione w sekcji Materiały i wyposażenie we właściwej pozycji w karuzeli magazynowej. Dodać 990 μl podwójnie destylowanej wody (ddH₂O) do każdej studzienki DWP w celu rozcieńczenia 1:100 do testu glukozy (pozycja karuzeli 4-1 do 4-4).
2. Ułożyć koryto o pojemności 250 ml zawierające 150 ml ddH₂O w pozycji stołu roboczego (WTP) 11.
3. Umieścić 250 ml koryta zawierającego 50 ml mieszaniny odczynników do oznaczania glukozy (4 ml 500 mM fosforanu potasu (pH 5,7), 1,5 ml 50 mM kwasu 2,2-azynobis-(3etylobenziazolino)-6-sulfonowego, 2 ml 100 U oksydazy glukozowej, 10 μl 1 000 M peroksydazy chrzanowej i 42,49 ml ddH₂O) w pozycji WTP 1-2.
4. Umieść dwie puste atrapy F-bottom MTP na pozycji WTP 3-1 i 3-2.
5. Usuń oddychającą folię uszczelniającą, przydziel główne kultury w pozycjach karuzeli (CP) 1-1 do 1-4 i uruchom zautomatyzowany program robota.
Wyrównanie płyt do filtracji żelowej
Uwaga: Żelowe płytki filtracyjne, które są używane podczas tego przesiewania, mogą być ponownie użyte. W tym celu przemyć i odwirować po trzy razy 150 μl ddH₂O o stężeniu 2 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 20 °C. Następnie przechowywać w temperaturze 4 °C z 75 μl 20% etanolu i przykryć silikonową matą z nasadką.
1. Przenieść koryto o pojemności 250 ml (CP 5-7) z 5 mM buforem octanu amonu (pH 5,6) do WTP 3-3.
2. Przenieś płytki do filtracji żelu (CP 1-6, 1-7, 2-6 i 2-7) z karuzeli do WTP 4-1 do 4-4.
3. Odessać 150 μl buforu octanu amonu za pomocą końcówek o objętości 200 μl i dozować do środka wszystkich płytek do filtracji żelu w celu zrównoważenia.
4. Przenieść płytki do filtracji żelu do wirówki (2 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 20 °C).
5. Przenieś płytki z powrotem na stół roboczy, powtórz kroki 1.3.3, 1.3.4 i 1.3.3. Nie powtarzaj etapu wirowania, aby uniknąć odwodnienia płytek do filtracji żelu. Przechowuj zrównoważone płytki do filtracji żelowej z powrotem w karuzeli.
Usuwanie komórek przez wirowanie (zadanie 1 na rysunku 1)
Uwaga: Aby zapewnić niskie tło w ramach podejścia przesiewowego, należy przeanalizować bezkomórkowy EPS zawierający tylko supernatanty i usunąć komórki przez odwirowanie po hodowli.
1. Przenieść DWP z głównej kultury z karuzeli (1-1 do 1-4) do wirówki (4 300 x g przez 30 minut w temperaturze 20 °C).
2. Przygotuj stół roboczy za pomocą RM, aby przetworzyć główną kulturę.
  Uwaga: W przypadku kroków od 1.4.2 do 1.4.3.5 system zawsze obsługuje dwie płytki równolegle, a następnie powtarza wszystkie kroki z dwiema następnymi płytami.
  1. Do wytrącania przed filtracją przesunąć MTP z CP 6-1 i 6-2 do WTP 4-1 i 5-1. Przenieś MTP wskaźnika pH z CP 7-1 i 7-2 do WTP 4-2 i 5-2.
  2. Przenieść płytę filtracyjną wraz z płytą kolektora z CP 2-1 i 2-2 do WTP 4-3 i 5-3. Przenieść główną kulturę DWP 1-1 i 1-2 z wirówki do WTP 4-4 i 5-4.
  3. Przygotuj moduły analityczne.
    Uwaga: Weź 200 μl końcówek z magazynu końcówek (pozycja 2-1 do 2-4). Aby zmniejszyć ilość materiałów eksploatacyjnych, należy użyć tego samego zestawu końcówek dla kroku 1.4.3.1.
    1. Przenieść 180 μl supernatantu z hodowli głównej na płytkę filtracyjną. Odessać 150 μl z supernatantu z hodowli głównej i dozować 50 μl do MTP w celu wytrącenia przed filtracją i 100 μl do tabliczki wskaźnika pH.
      Uwaga: Oznaczenie pH nie jest konieczne; Jednak po dodaniu 12,5 ml wskaźnika czerwieni metylowej (50 mg w 50 ml etanolu) do każdej studzienki za pomocą wieloetapowej pipety wskazuje to na silne szczepy wytwarzające kwasy. Informacje te mogą być przydatne w celu uniknięcia zahamowania wzrostu (przy niskim pH) w przypadku dalszych upraw, np. w celu przeprowadzenia drugiego badania przesiewowego o wyższym stężeniu buforowym. Co więcej, niskie pH może również indukować produkcję EPS w celu ochrony komórki przed kwaśnym środowiskiem.
    2. Powtórzyć krok 1.4.3.1 dla drugiej płytki głównej hodowli. Użyj nowego zestawu końcówek.
    3. Przenieś płytki filtracyjne do wirówki i wyjmij wszystkie inne płytki ze stołu roboczego z powrotem do ich pozycji początkowych w karuzeli.
    4. Powtórzyć kroki od 1.4.2.1 do 1.4.3.3 dla trzeciej i czwartej płytki hodowlanej.
    5. Zwróć uwagę na te buliony fermentacyjne, które wykazują zmniejszoną sedymentację po odwirowaniu głównych płytek hodowlanych, gdy są one przenoszone z powrotem do karuzeli (kontrola lepkości).
Filtracja 96-dołkowa w celu całkowitego usunięcia komórek (zadanie 2 na rysunku 1)
Uwaga: Aby zapewnić usunięcie komórek z lepkiego bulionu fermentacyjnego, w badaniu przesiewowym znajduje się etap filtracji.
1. Odwirować płytki filtracyjne o sile 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C i przywrócić je do pozycji wyjściowej karuzeli.
2. Przygotować płytki do filtracji żelu.
  1. Przenieść zrównoważone płytki do filtracji żelowej z karuzeli do wirówki i wirować w temperaturze 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 20 °C.
  2. Przenieść płytki do filtracji żelu z wirówki do WTP 4-1 do 44.
  3. Przesunąć świeże płytki kolektora do filtracji żelu z CP (3-1 do 3-4) do WTP (5-1 do 5-4).
  4. Przenieść zrównoważone płytki do filtracji żelowej (WTP 4-1 do 4-4) na płytki ze świeżym kolektorem (5-1 do 5-4).
  5. Oczyść stół roboczy z wyjątkiem pozycji 5-1 i 5-2 i przesuń pozycję 5-1 do pozycji 4-1.
3. Przygotuj stół roboczy za pomocą RM do przetworzenia filtratów.
  Uwaga: W przypadku kroków od 1.5.3 do 1.6.3.5 system obsługuje dwie tabliczki równolegle i powtarza wszystkie kroki z dwiema następnymi płytami.
  1. Przenieś końcówki o pojemności 50 μl z karuzeli (4-6 i 4-7) do WTP 3-3 i 3-4.
  2. Przenieś płytki filtracyjne z CP 3-1 do 3-2 na stół roboczy (4-4 i 5-4).
  3. Przenieść DWP (rozcieńczenie 1:100) w celu wykrycia zużycia glukozy z CP 4-1 i 4-2 do WTP 4-2 i 5-1.
  4. Przesunąć MTP dla drugiego opadu po filtracji z CP 8-1 i 8-2 do WTP 4-3 i 5-3.
  5. Zdjąć płyty filtracyjne z płyt kolektora (WTP 4-4 i 5-4) i przesunąć je do WTP 3-1 i 3-2.
4. Przygotować moduły analityczne po filtracji. Aby zmniejszyć ilość materiałów eksploatacyjnych, należy użyć tego samego zestawu końcówek dla kroków 1.5.4.1 i 1.5.4.3.
  1. Wziąć 50 μl końcówek i odpipetować 10 μl podwielokrotności filtratu do DWP (rozcieńczenie 1:100) w celu oznaczenia glukozy (zużycie glukozy).
  2. Odpipetować 35 μl filtratu do środka zrównoważonej płytki żelowo-filtracyjnej i 50 μl do MTP, który jest używany do wytrącania.
  3. Powtórzyć kroki od 1.5.4.1 do 1.5.4.2 dla drugiej płytki filtracyjnej.
  4. Przenieś płytki do filtracji żelu do wirówki i przesuń wszystkie inne płytki ze stołu roboczego z powrotem do pozycji początkowych w karuzeli.
  5. Powtórzyć kroki od 1.5.3.1 do 1.5.4.4 dla trzeciej i czwartej płytki filtracyjnej.
  6. Po ponownym umieszczeniu wszystkich płytek w karuzeli należy zwrócić uwagę na supernatanty o wysokiej lepkości, na co wskazują pozostałości w płycie filtracyjnej (kontrola wysokiej lepkości po etapie filtracji). Brak filtratu może prowadzić do fałszywie ujemnych wyników w następujących modułach analitycznych.
Usuwanie glukozy za pomocą 96-dołkowej filtracji żelowej (zadanie 3 na rysunku 1)
1. Odwirować płytki do filtracji żelu przy 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 20 °C.
2. Przygotuj stół roboczy za pomocą manipulatora robota do przetwarzania filtratów żelowych.
  1. Przekaż 50 μl napiwków z karuzeli (5-3 i 5-4) do WTP 3-3 i 3-4.
  2. W celu oznaczenia pozostałej glukozy po filtracji żelowej przenieść dwa MTP z CP 9-1 i 9-2 do WTP 4-1 i 5-1.
  3. W przypadku metody fenolowo-siarkowej przenieść dwa MTP z CP 8-5 i 8-6 do WTP 4-2 i 5-2.
  4. Przenieść dwie żelowe płytki filtracyjne z wirówki do WTP (4-3 i 5-3).
  5. Zdjąć płytki do filtracji żelu z płyty kolektora (4-3 i 5-3) i przesunąć je do WTP 3-1 i 3-2.
3. Przygotuj stół roboczy za pomocą manipulatora robota do przetwarzania filtratów żelowych.
  Uwaga: Aby zmniejszyć ilość materiałów eksploatacyjnych, należy użyć tego samego zestawu końcówek dla kroków 1.6.3.1 i 1.6.3.2.
  1. Aby wykryć pozostałą glukozę po filtracji żelowej (rozcieńczenie 1:10), weź 50 μl końcówek i przenieś 25 μl ddH₂O (WTP 1-1) do świeżego MTP. Odessać 20 μl ddH₂O (WTP 1-1), 5 μl powietrza i 5 μl filtratu żelowego i dozować do tej samej płytki.
  2. Do metody fenolowo-kwasowo-siarkowej odpipetować 20 μl filtratu żelowego do MTP.
  3. Powtórzyć czynności 1.6.3.1 i 1.6.3.2 dla drugiej płytki żelowo-filtracyjnej.
  4. Przenieś wszystkie talerze ze stołu roboczego z powrotem do pozycji początkowych w ich karuzeli.
  5. Powtórzyć kroki od 1.6.2.1 do 1.6.3.4 dla trzeciej i czwartej płytki do filtracji żelu.
Moduły do oznaczania glukozy
1. Przygotuj stół roboczy za pomocą manipulatora robotycznego do wykonania testu glukozy.
  1. Przenieść DWP (rozcieńczenie 1:100) z CP 4-1 i 4-4 do WTP 5-1 i 5-4.
  2. Przenieś wszystkie MTP z CP 9-5 i 9-8 do WTP 4-1 i 4-4.
  3. Weź końcówki o pojemności 200 μl i wymieszaj rozcieńczenie, zasysając i dozując dziesięciokrotnie większą objętość niż 180 μl. Następnie odpipetować 50 μl podwielokrotności do MTP.
  4. Powtórzyć kroki 1.7.1.2 i 1.7.1.3 dla wszystkich czterech DWP (rozcieńczenie 1:100).
  5. Usuń wszystkie DWP (5-1 do 5-4) ze stołu roboczego.
2. Przygotuj stół roboczy, aby rozpocząć test glukozy.
  1. W celu oznaczenia pozostałej glukozy po filtracji żelowej przenieść wszystkie MTP z CP (9-1 do 9-4) do WTP (5-1 do 5-4).
  2. Przesunąć płytkę kalibracyjną do oznaczania zawartości glukozy — zawierającą trzykrotnie po 50 μl następujących stężeń glukozy (90, 45, 18, 9, 4,5, 1,8, 0,9, 0,45 i 0 mg/l) — z punktu kontroli koncentracji na czynności prawidłowych 9-9 do roztworu WTP 3-3.
  3. Weź 200 μl końcówek i odessaj 50 μl mieszaniny odczynników do oznaczania glukozy z WTP 1-2, aby rozpocząć pierwszy test. Przenieść MTP do inkubatora (30 °C przy 150 obr./min przez 30 min).
  4. Ustaw harmonogram uruchamiania programu z 5-minutowym opóźnieniem między płytami.
  5. Po 30 minutach inkubacji przenieść płytki z inkubatora do czytnika MTP i zarejestrować absorbancję przy 418 i 480 nm.
  6. Po pomiarze przesuń talerze do ich pozycji wyjściowej w karuzeli.
Przygotowanie opadu atmosferycznego
Uwaga: W celu oceny produkcji EPS należy przeprowadzić wytrącanie supernatantu za pomocą 2-propanolu przed i po pierwszym etapie filtracji. Ponadto należy ocenić adsorpcję polimeru na membranie filtracyjnej, obserwując włókna i płatki w pierwszym, ale nie w drugim wytrąceniu.
Uwaga: Z 2-propanolem jako łatwopalną cieczą należy obchodzić się wyłącznie pod wyciągiem.
1. Wyjmij wszystkie płytki opadowe (CP 6-1 do 6-4 i 8-1 do 8-4) z karuzeli. I dodać ręcznie 150 μl 2-propanolu do każdego dołka za pomocą wieloetapowej pipety o pojemności 12,5 ml.
2. Przykryj wszystkie MTP silikonową matą nasadkową i wstrząśnij w temperaturze pokojowej (RT) (10 min przy 900 obr./min). Obserwuj wzrokowo formacje włókien lub płatków po wstrząsaniu, które wskazują na produkcję EPS.
Metoda kwasu fenolowo-siarkowego
Uwaga: Stężony kwas siarkowy i fenol należy obchodzić pod wyciągiem. Fenol jest środkiem i mutagennym.
1. W przypadku metody kwasu fenolowo-siarkowego wyjąć płytki (CP 8-5 do 8-8) z karuzeli i umieścić je w układzie obsługi cieczy (pozycje 4 do 8). Dołączyć płytkę kalibracyjną z 20 μl glukozy o różnych stężeniach (10; 5; 2,5; 1; 0,5; 0,25; 0,1; 0,05; 0 g/l) w trzech egzemplarzach.
2. Umieścić pojemnik na odpady w pozycji 1, pojemnik na końcówki o pojemności 200 μl w pozycji 2 i koryto o pojemności 250 ml ze 110 ml kwasu fenolowo-siarkowego (świeżo przygotowanego na lodzie z 18,3 ml fenolu 5% (w/v) w ddH₂O i 91,7 ml stężonego kwasu siarkowego) w miejscu 3.
3. Użyj 8-kanałowej pipety z końcówkami o pojemności 300 μl i przenieś 180 μl kwasu fenolowo-siarkowego do każdego rzędu wszystkich płytek.
4. Przykryj wszystkie MTP pokrywkami, wymieszaj je przez wytrząsanie (5 min przy 900 obr./min, RT) i inkubuj przez 35 minut w temperaturze 80 °C w piecu do uzyskania reakcji kolorystycznej. Po schłodzeniu pod wyciągiem zmierz gęstość wygaszania przy długości fali 480 nm.
Wybór supernatantów dodatnich pod względem EPS (zadanie 4 na rysunku 1)
1. Do oceny produkcji EPS należy wybrać te szczepy z automatycznego badania przesiewowego, które spełniają co najmniej dwa z trzech kryteriów jako pozytywne (kontrola lepkości 2.6.1 i 2.6.2, wykrycie polimeru 2.6.3, ekwiwalent glukozy 2.6.5). Przenieść pozostałe filtraty z dodatnich trafień do nowego MTP w celu dalszego przetwarzania.
  Uwaga: Gdy płytki są pokryte aluminiową folią uszczelniającą, można je przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej tydzień. W tym czasie należy wykonać oznaczenie odcisku palca węglowodanów.

2. Odcisk palca węglowodanów

Uwaga: Wszystkie kroki dla odcisku palca węglowodanów są wykonywane ręcznie.

Filtracja żelowa dodatnich supernatantów (zadanie 5 na rysunku 1)
Uwaga: Filtracja żelowa jest konieczna, ponieważ po automatycznym badaniu przesiewowym nie pozostał żaden filtrat. Filtracja żelowa o objętości powyżej 35 μl powoduje zmniejszenie skuteczności oczyszczania.
1. Przygotować równowagę płytek do filtracji żelu, dozując 150 μl buforu octanu amonu do wszystkich studzienek za pomocą wielostopniowej pipety o pojemności 12,5 ml.
2. Przenieść płytkę do filtracji żelu do wirówki (2 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 20 °C).
3. Powtórz kroki 2.1.1, 2.1.2 i ponownie 2.1.1. Odwirować płytkę do filtracji żelu przy 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 20 °C przed dalszym użyciem.
4. Odpipetować 35 μl filtratu do środka płytki do filtracji żelu za pomocą 12-kanałowej pipety o pojemności 50 μl.
5. Odwirować płytkę do filtracji żelu o sile 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 20 °C, a następnie zdjąć ją z płytki zbiorczej.
6. Przygotować test glukozy przed hydrolizą: Przeprowadzić rozcieńczenie w stosunku 1:10, dodając 45 μl ddH₂O i 5 μl filtratu żelowego za pomocą 12-kanałowej pipety o pojemności 50 μl i przykryć MTP silikonową matą z nasadką.
  Uwaga: W celu prawidłowego określenia wartości stężenia glukozy w polimerze należy zmierzyć zawartość glukozy przed hydrolizą i odjąć ją od zawartości glukozy określonej ilościowo po etapie hydrolizy.
7. Przygotować test pirogronianowy przed hydrolizą: Wykonać rozcieńczenie w stosunku 1:20 za pomocą 12-kanałowej pipety o pojemności 200 μl, aby dodać 95 μl ddH₂O, przenieść 5 μl filtratu żelowego do każdej studzienki i uszczelnić MTP matą z silikonową nasadką.
96-dołkowa mikrohydroliza (zadanie 6 na rysunku 1)
Uwaga: Przed użyciem rozgrzej piec inkubacyjny (wraz z łaźnią piaskową) do 121 °C przez co najmniej 1.5 godziny. Opracowano specjalne urządzenie zaciskowe, aby uniknąć parowania podczas etapu hydrolizy z małą skalą.
1. Wziąć nową płytkę PCR i przenieść 20 μl filtratu żelowego za pomocą 12-kanałowej pipety o pojemności 50 μl.
  Uwaga: Kwas trifluorooctowy jest kwasem i toksycznym. Roztwór amonu jest. Z oboma chemikaliami należy obchodzić się tylko pod wyciągiem.
2. Do każdego dołka dodać 20 μl 4 M kwasu trifluorooctowego za pomocą 1,25 ml wieloetapowej pipety. Następnie przykryj płytkę PCR matą z elastomeru termoplastycznego (TPE) i umieść płytkę PCR w specjalnym urządzeniu zaciskowym.
3. Wymieszać roztwory, odwracając urządzenie mocujące dziesięć razy. Umieść płytkę PCR w wirówce i wiruj z prędkością 2 000 x g przez 2 minuty, aby zebrać cały płyn na dnie. Włóż płytkę PCR z powrotem do urządzenia zaciskowego i zabezpiecz urządzenie.
4. Umieścić zabezpieczone urządzenie mocujące w podgrzanej łaźni piaskowej i inkubować przez 90 minut w temperaturze 121 °C.
5. Wyjmij urządzenie zaciskowe z kąpieli piaskowej i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.
6. Odkręcić i ponownie wirować w wirówce o stężeniu 2 000 x g przez 2 minuty, aby zebrać cały kondensat na dnie studzienek i zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu podczas usuwania maty nasadkowej.
7. Dodać 3,2% roztwór amoniaku, aby dostosować pH do ok. 8 za pomocą 12-kanałowej pipety o pojemności 200 μl. Przykryj płytkę PCR matą z TPE i potrząśnij nią ręcznie za pomocą urządzenia zaciskowego.
8. Po neutralizacji odwirować płytkę PCR o masie 2 000 x g przez 2 min.
Wysokoprzepustowa derywatyzacja węglowodanów 1-fenylo-3-metylo-5-pirazolonu (HT-PMP) (zadanie 7 na rysunku 1)
1. Przenieść 25 μl zobojętnionego hydrolizatu na świeżą płytkę PCR za pomocą 12-kanałowej pipety 50 μl.
  Uwaga: Po pobraniu podwielokrotności należy sprawdzić neutralizację pozostałej cieczy na płytce do hydrolizy poprzez dodanie 12,5 μl wskaźnika czerwieni fenolowej (0,05 g czerwieni fenolowej w 5 ml 20% etanolu) za pomocą pipety wieloetapowej o pojemności 1,25 ml. Wszystkie studzienki, które nie zmieniają koloru na różowy (pH 8), nie są prawidłowo derywatyzowane.
2. Dodać 75 μl mieszaniny odczynników do derywatyzacji (125 mg PMP, 7 ml metanolu, 3,06 ml_ddH2O i 438 μl 3,2% roztworu amonu) i przykryć płytkę matą z TPE.
3. Po wstrząśnięciu płytki PCR w urządzeniu zaciskowym, należy odwirować płytkę o masie 2 000 x g przez 2 minuty, aby zgromadzić cały płyn na dnie.
4. W celu derywatyzacji umieścić płytkę PCR w cyklerze PCR w temperaturze 70 °C na 100 minut, a następnie schłodzić do 20 °C.
5. Przenieś podwielokrotność 20 μl do nowego MTP za pomocą 12-kanałowej pipety o pojemności 50 μl. Następnie użyj 12-kanałowej pipety o pojemności 200 μl i dodaj 130 μl 19,23 mM kwasu octowego (0,962 ml 1 M kwasu octowego + 49,038 ml ddH₂O) do każdej linii. Wymieszać bezpośrednio przez zasysanie i dozowanie (co najmniej sześć razy) i przenieść całą ciecz na płytkę filtracyjną 0,2 μm z płytką kolektora MTP.
6. Odwirować płytkę (1 000 x g przez 5 minut), wyjąć płytkę filtracyjną, uszczelnić MTP silikonową matą z nasadką i umieścić MTP w UHPLC-UV-ESI-MS w celu oznaczenia węglowodanowego odcisku palca¹⁴.
Przygotowanie testu glukozy
1. Przeprowadzić rozcieńczenie w stosunku 1:10 poprzez dodanie 45 μl ddH₂O i 5 μl zobojętnionego hydrolizatu za pomocą 12-kanałowej pipety o pojemności 50 μl i przykryć MTP silikonową matą z nasadką. Dodać trzy razy po 50 μl różnych wzorców glukozy (500, 250, 100, 50, 25, 10, 5, 2,5 i 0 μM) do nowego MTP używanego do kalibracji.
2. Dodać 50 μl mieszaniny odczynników do oznaczania glukozy (przepis krok 1.2.3) za pomocą 12-kanałowej pipety o pojemności 50 μl. Następnie przykryć płytki silikonową matą z kapslem i inkubować w temperaturze 30 °C i 400 obr./min przez 30 minut w inkubatorze MTP.
3. Bezpośrednio po inkubacji dokonać odczytu absorbancji w czytniku MTP przy 418 nm i 480 nm w czytniku MTP. W celu obliczenia stężenia glukozy należy przeprowadzić kalibrację liniową, jak przeprowadzono w kroku 2.6.4.
Przygotowanie testu pirogronianowego
1. Rozcieńczyć w stosunku 1:20 za pomocą 12-kanałowej pipety o pojemności 200 μl. Dodać 95 μl ddH₂O i przenieść 5 μl zobojętnionego hydrolizatu do każdej studzienki. Przykryj MTP silikonową matą z nasadką.
2. Za pomocą 12-kanałowej pipety 200 μl soli sodowej N-(karboksymetyloamino-karbonylo)-4,4'-bis(dimetyloamino)-difenyloaminy (DA-64), 300 μl 10 mM pirofosforanu tiaminy, 60 μl 100 mM sześciowodnego chlorku magnezu, 2,4 ml 500 mM puffera fosforanu potasu (pH 5,7), 30 μl 100 U oksydazy pirogronianowej, 12 μl 1000 U peroksydazy chrzanowej i 24,19 ml _ddH2O) dodać 100 μl.
3. Przykryć płytki silikonową matą nasadową i inkubować w temperaturze 37 °C i 150 obr./min przez 30 min. Bezpośrednio po inkubacji zmierzyć absorbancję w czytniku MTP przy długości fali 727 i 540 nm.
Ocena wszystkich wyników zautomatyzowanego badania przesiewowego i odcisków palców węglowodanów.
1. Należy zwrócić uwagę na te próbki, które wykazują zmniejszoną sedymentację po odwirowaniu głównych płytek hodowlanych i przechowywaniu ich z powrotem w karuzeli (etap kontroli lepkości 1.4.1). Próbki, w których nie stwierdzono tworzenia się osadów, są dodatnie (kryterium 1 dla zautomatyzowanych badań przesiewowych).
2. Należy zwrócić uwagę na supernatanty o wysokiej lepkości, które są oznaczone pozostałościami w płycie filtracyjnej po etapie filtracji (etap kontroli wysokiej lepkości 1.5.4.6). Brak filtratu może prowadzić do fałszywie ujemnego wyniku w następujących modułach analitycznych. Próbki, w których utrzymują się supernatanty hodowlane w studzienkach filtracyjnych, są dodatnie (również kryterium 1 dla zautomatyzowanych badań przesiewowych).
3. Obserwuj wzrokowo tworzenie się włókien lub płatków po inkubacji. Rób notatki, ponieważ oznacza to polisacharydy. Oceń brak opadów za pomocą (-); niskie wytrącanie włókien lub płatków z (+) i wysokie wytrącanie z (++). Ponadto należy wykryć adsorpcję polimeru na membranie filtracyjnej poprzez obserwację włókien i płatków w pierwszym, ale nie w drugim wytrącaniu (kryterium 2 dla automatycznego przesiewania).
4. Wykonaj kalibrację liniową w celu obliczenia stężenia glukozy.
  
  Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego równania.
5. Przeprowadzić kalibrację liniową (absorpcja powyżej stężenia) w zakresie od 5 do 0,1 g/l glukozy. Obliczanie ekwiwalentu glukozy dla hydrolizowanych polimerów i ocena za pomocą następujących parametrów: ekwiwalent glukozy: >700 mg/L = dodatni; 300-700 mg/L = przypuszczalnie dodatni; <300 mg/L = ujemny w odniesieniu do tworzenia EPS (kryterium 3 dla zautomatyzowanych badań przesiewowych).
  
  Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego równania.
6. Określić ilościowo wszystkie węglowodany oznaczone metodą HT-PMP. Zsumuj wszystkie ilości i oceń w następujący sposób: >300 mg/L (dodatni); 150-300 mg/L (przypuszczalnie dodatnie) i <150 mg/L (ujemne).
7. W celu obliczenia stężenia pirogronianu należy przeprowadzić kalibrację liniową (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5 i 0 μM). Aby wykluczyć pozostały pirogronian w supernatancie, należy skorygować zawartość pirogronianu po hydrolizie za pomocą zawartości pirogronianu przed hydrolizą.
  
  Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego równania.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Walidacja metody fenolowo-siarkowej wykazała dobre wyniki ze współczynnikiem determinacji (r²) wynoszącym 0,9998 (Tabela 2). W przypadku stężenia 5 g/l współczynnik zmienności (CV) i dokładność wykazały dobrą wydajność z błędem 1,8% i 2,2%, ale niższą wydajność dla wzorca 0,25 g/l z błędem 5,3% (CV) i 6,1% (błąd systematyczny).

Współczynniki determinacji obu krzywych kalibracji testu pirogronianowego (z matrycą i bez) wynosiły >0,9999 w zakresie kalibracji 150 μM (>Tabela 3). Współczynniki zmienności (CV) dla najwyższego i najniższego poziomu kalibracji wynosiły <4,6%, a dokładność wykazała bardzo dobrą wydajność w całym zakresie kalibracji z błędem mniejszym niż 3,9%. W związku z tym matryca z etapu hydrolizy nie wykazała żadnego wpływu na test enzymatyczny, który jest zatem w stanie zmierzyć pirogronian przed i po hydrolizie.

Tabela 4 pokazuje szczegółowe wyniki trzech przykładowych nowych szczepów, które udało się zidentyfikować za pomocą platformy przesiewowej. W lewej części tabeli przedstawiono wyniki zautomatyzowanych modułów przesiewowych dotyczących tworzenia lepkości, produkcji polimerów i ekwiwalentu glukozy z całkowitej hydrolizy, które wykorzystano jako parametry oceny do szczegółowej analizy odcisków palców węglowodanów. Odcisk palca węglowodanów oparty na skalibrowanych cukrach, a także nieznanych cukrach, dimerach i podstawnikach znajduje się w prawej części tabeli. Korzystając z tych informacji, można obliczyć skład monomeryczny i porównać go ze znanymi już strukturami polimerowymi. Ponadto można przeprowadzić ukierunkowane badania przesiewowe pod kątem interesujących kompozycji monomerycznych i rzadkich węglowodanów.

Wysoka wydajność hydrolizy w skali mikro i derywatyzacji HT-PMP została zademonstrowana w naszej poprzedniej pracy¹⁴. Ponadto walidacja filtracji żelowej i odcisku palca węglowodanów dla różnych rodzajów została opisana w innej publikacji⁶. Podsumowując, platforma przesiewowa o modułowej budowie może być łatwo modyfikowana i dostosowywana do indywidualnych wymagań użytkownika. Zautomatyzowane przesiewanie platformy umożliwia ośmiokrotnie większą przepustowość i daje wiarygodne wyniki. Nowatorskie moduły analityczne, takie jak test pirogronianowy, można zintegrować, a w połączeniu z analizą węglowodanowych odcisków palców dostarczają one bardzo szczegółowych informacji na temat zidentyfikowanego EPS. W związku z tym platforma przesiewowa jest niezbędna przy poszukiwaniu zarówno nieznacznie zmodyfikowanych, jak i całkowicie nowatorskich wariantów EPS.

figure-results-1
Rysunek 1: Ogólny schemat modułowej platformy przesiewowej egzopolisacharydów o wysokiej przepustowości. Zautomatyzowana kontrola przesiewowa obejmuje pierwsze trzy zadania. Po wyhodowaniu bakterii na płytkach 96-dołkowych, komórki są usuwane przez odwirowanie (zadanie 1) i filtrację w 96-dołkowej (zadanie 2). Następnie pozostałe cukry monomeryczne z pożywki wzrostowej są usuwane za pomocą 96-dołkowej filtracji żelowej (zadanie 3). Próbki zawierające EPS są oceniane w zadaniu 4. Węglowodanowy odcisk palca platformy przesiewowej zawiera trzy ostatnie zadania. Pozostały filtrat dodatnich trafień z zadania 2 stanowi podstawę dla filtratu żelowego w zadaniu 5. Po hydrolizie w zadaniu 6 odcisk palca węglowodanów można przeanalizować metodą HT-PMP (wysokoprzepustowy 1-fenylo-3-metylo-5-pirazolon, zadanie 7). Po wszystkich zadaniach wykonywane są różne moduły analityczne i/lub kontrola lepkości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Konfiguracja stołu roboczego robota dla platformy przesiewającej. Pokazano układy obu stołów roboczych robota do obsługi cieczy: (A) zrobotyzowany system obsługi cieczy i (B) stacja obsługi cieczy. (A) Zestaw składa się z nośnika na mikropłytki z dwoma pozycjami (pozycje 1-1 do 1-2), nośnika na końcówki jednorazowe z czterema pozycjami (pozycje 2-1 do 2-4) oraz trzech nośników na mikropłytki z czterema pozycjami każdy (pozycje 3-1 do 3-4, 4-1 do 4-4 i 5-1 do 5-4). Ponadto dostępna jest karuzela magazynowa z pięcioma nośnikami hotelowymi (od 1 do 5) każdy na siedem płytek głębinowych (DWP) i czterema nośnikami hotelowymi (6-9) każdy na 21 płytek z mikromiareczkowaniem. Osprzęt zainstalowany w robocie do obsługi cieczy to 96-kanałowe ramię pipet do użytku z jednorazowymi końcówkami i zrobotyzowanym manipulatorem (RM), który przesuwa płytki/sprzęt między stołem roboczym, karuzelą magazynową, czytnikiem MTP, wirówką i inkubatorem do wytrząsania. (B) Stacja obsługi cieczy jest wyposażona w ramię do obsługi cieczy i 8-kanałową pipetę o pojemności 300 μl, pojemnik na odpady w pozycji 1, adapter końcówki z końcówkami o pojemności 300 μl (pozycja 2), adapter wysokości 30 z rynną o pojemności 250 ml (pozycja 3) oraz adapter o pięciu wysokościach 60 do MTP (pozycja 4 do 8). Numeracja pozycji jest przywołana w całym niniejszym protokole. Można również użyć alternatywnych stołów roboczych, jeśli dostępne są równoważne konfiguracje. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Zawartość pirogronianu w 16 dostępnych na rynku polimerach oznaczona za pomocą testu pirogronianowego. Po hydrolizie i zobojętnieniu roztworów polimerów o stężeniu 1 g/l, test pirogronianowy przeprowadzono z rozcieńczenia 1:10 (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Schemat blokowy modułowej platformy przesiewowej o wysokiej przepustowości. Zautomatyzowany system przesiewowy, który łączy w sobie różne moduły wykrywania polisacharydów: analizę tworzenia lepkości, produkcję polimerów i oznaczanie całkowitej zawartości węglowodanów. Druga część zawiera szczegółową analizę monosacharydów dla wszystkich wybranych producentów EPS zidentyfikowanych w pierwszej części. Wszystkie dane z automatycznego badania przesiewowego oraz dane z odcisku palca węglowodanów za pośrednictwem UHPLC-ESI-MS są gromadzone w bazie danych i umożliwiają prostą identyfikację strukturalnie powiązanych wariantów już znanego EPS lub nowego EPS, a tym samym ukierunkowane badania przesiewowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Krok główny / Moduł analityczny	Przepływ pracy	Obserwacja / Opis
Uprawa szczepów	1 ml styropianu (EPS)^{pożywki a} Hodowla wstępna 48 godz., 30 °C, 1 000 obr./min^a Kultura główna 48 godz., 30 °C, 1 000 obr./min^a	Produkcja styropianu
Usuwanie komórek / lepkość	Wirowanie: 30 min przy 4 300 x g	Brak granulek = zwiększona lepkość = dodatnia
Wykrywanie polimeru: Wytrącanie	50 μl supernatant + 150 μl 2-propanol^B Wytrząsanie 10 min przy natężeniu obrotowym i 900 obr./min^b	Wizualny: Włókna i płatki = dodatnie wytrącanie polimeru
Usuwanie komórek / wysoka lepkość	180 μl supernatant kultury głównej Wirowanie: 10 min przy 3 000 x g Membrana z włókna szklanego 1,0 μm	Brak przepływu filtra = wysoka lepkość = dodatnia
Wykrywanie polimeru: Wytrącanie	50 μl filtratu + 150 μl 2-propanolu^B Wytrząsanie 10 min przy natężeniu obrotowym i 900 obr./min^b	Wizualny: Włókna i płatki = dodatnie wytrącanie polimeru
Zużycie glukozy: Oznaczenie glukozy	Rozcieńczenie 1:100: 10 μl filtratu + 990 μl ddH₂O 50 μl podwielokrotność + 50 μl odczynnika-mix Inkubacja 30 min w 30 °C 150 obr./min Pomiar 418-480 nm	Pozostała glukoza po hodowli
Filtracja żelowa	Równoważenie: 3 x 150 μl NH 4-octanowy bufor pH 5,6 2 x 2 min przy 2,000 x g 1 x 2 min przy 1,000 x g Filtracja żelowa: 35 μl filtratu, 2 min przy 1 000 x g Mycie: 3 x 150 μl ddH₂O, 2 min przy 2 000 x g 75 μl 20% etanolu do przechowywania	Oczyszczanie polimeru: Usuwanie soli, pirogronianu, glukozy i innych monomerów cukrowych z supernatantu hodowlanego
Pozostała glukoza po filtracji żelowej Oznaczenie glukozy	Rozcieńczenie 1:10: 25 μl ddH₂O + 20 μl_ddH2O i 5 μl filtratu + 50 μl mieszaniny odczynników Inkubacja 30 min w 30 °C, 150 obr./min Pomiar 418-480 nm	Odejmowanie pozostałej glukozy po filtracji żelowej od metody fenolowo-siarkowej
Ekwiwalent glukozy: Metoda kwasu fenolowo-siarkowego^c	20 μl filtratu żelowego + 180 μl kwasu fenolowo-siarkowego (30 μl 5% (w/v) fenolu w ddH₂O + 150 μl stężonego H₂SO₄ (ρ = 1,84 g/ml)) Wytrząsanie 5 min przy 900 obr./min Inkubacja 35 min w temperaturze 80 °C Pomiar przy 480 nm	Ekwiwalent glukozy: Δ (liczba kwasu fenolowo-siarkowego - pozostała glukoza po filtracji żelowej) <300 mg/L ujemny >300 i <700 mg/L przypuszczalnie dodatnie >700 mg/L dodatni
^aObsługiwane ręcznie w sterylnych warunkach (przepływ laminarny).
^b Łatwopalna ciecz obsługiwana ręcznie pod wyciągiem.
^c Kwas fenolowo-siarkowy obsługiwany za pomocą Brand Liquid Handling Station (LHS) pod wyciągiem.

Tabela 1: Kompletny przebieg automatycznego wstępnego badania przesiewowego z robotycznym systemem obsługi cieczy i stacją obsługi cieczy. Przegląd wszystkich parametrów dla zautomatyzowanych modułów analitycznych.

pkt. Rozdział szt. osób

Liniowość			Lod	Loq
r²^{a powiedział:}	Nachylenie^A	Odsunięcie^a	mg/L	mg/L
0,9998	0,0007	-0,021	50	100

Standardowy		Średnia^b	Precyzja^b	Precyzja^b
mg/L		mg/L	Wskaźnik zaopatrzenia (CV%)	Stronniczość (%error)
5,000		5 112	1.8	2.2
250		Rozdział 265	5.3	6.1
a Średnia z ośmiu pomiarów, ^kalibracja z sześcioma poziomami glukozy od 0,1 do 5 g/L
^b Wykonywane za pomocą testu t-Studenta (α = 0,05; n = 8).
LOD: granica determinacji, LOQ: granica kwantyfikacji, CV: współczynnik zmienności.

Tabela 2: Walidacja metody fenolowo-siarkowo-kwasowej została przeprowadzona za pomocą stacji obsługi cieczy. Liniowość obliczono na podstawie sześciopunktowej kalibracji (n = 8). Podano tu średnią, precyzję i dokładność dwóch przykładowo dobranych stężeń glukozy.

pkt. szt. Rozdział pkt. pkt. Rozdział pkt. pkt. pkt. pkt.

	Liniowość			Loq
	r²^{a powiedział:}	Nachylenie^A	Odsunięcie^a	μM
bez matrycy	0,99999	0,0223	-0,0019	1
Rozcieńczona matryca 1:10	0,99999	0,0221	-0,0011	1

	norma	Średnia^b	Precyzja^b	Precyzja^b
	μM	μM	Wskaźnik zaopatrzenia (CV%)	Stronniczość (%error)
bez matrycy	50	Lokal z numerem 49,96	Klasa 3,05	-0,09
	1	Klasa 1,04	Do godziny 2,95	3,86
Rozcieńczona matryca 1:10	50	Norma 49,98	0,44	-0,04
	1	godz. 1.00	Godzina 4,58	0,33
a Średnia z trzech pomiarów, ^kalibracja z sześcioma stężeniami pirogronianu od 1 do 50 μM.
^b (n = 3)
LOQ: granica kwantyfikacji, CV: współczynnik zmienności.

Tabela 3: Walidacja testu pirogronianowego z i bez rozcieńczonej w stosunku 1:10 zobojętnionej matrycy kwasu trifluorooctowego. Przeprowadzono dwie kalibracje sześciopunktowe (n = 3) z oceną i bez oceny wpływów matrycy. Obliczono średnią, precyzję i dokładność dwóch przykładowo dobranych stężeń pirogronianu z efektem rozcieńczenia 1:10 i bez efektu.

figure-results-5
Tabela 4: Wyniki trzech przykładowych szczepów badanych za pomocą platformy. Dane zebrane z automatycznego badania przesiewowego i odcisku palca węglowodanów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę jako plik Microsoft Excel.

szt. pkt. szt. pkt. pkt. TGL pkt. SZT. pkt. pkt. szt. pkt. szt. pkt. pkt. SZT. pkt. TGL pkt. szt. pkt. TGL pkt. szt. szt. Rozdział szt. TGL pkt. Rozdział SZT. pkt. szt.

węglowodan	Maksymalna absorpcja [nm]	Absorpcja przy 480 nm średnia±SD		Absorbancja w stosunku do glukozy [%]
Guma Diutan	470	0,342	±0,010	Rozdział 187
Guma gellan	472	0,334	±0,002	183 Rozdział 183
Guma guar	Z numerem 478	0,387	±0,017	Z numerem 212
Gummi arabski	Okręg wyborczy 476	0,393	±0,034	Rozdział 215
Kwas hialuronowy	484	0,231	±0,011	126 Rozdział 126
Guma Karaya	Z numerem 478	0,455	±0,023	Rozdział 249
Guma konjac	480	0,297	±0,009	163 Rozdział 163
Guma modrzewiowa	480	0,337	±0,032	185 Rozdział 185
Mączka chleba świętojańskiego	Z numerem 478	0,354	±0,033	Rozdział 194
Skleroglukan	484	0,168	0 010 ±	Rozdział 92
Sukcynoglikan	482	0,168	±0,005	Rozdział 92
Guma tara	480	0,318	±0,016	174
Tragakant	Z numerem 478	0,513	±0,003	281
Guma Welan	472	0,226	±0,016	124
Firma Xylan	472	0,567	±0,007	Rozdział 311
Guma ksantanowa	482	0,245	±0,021	134
glukoza	484	0,191	±0,014	100
SD: odchylenie standardowe

Tabela 5: Wyniki uzyskane metodą fenolowo-siarkową dla 16 dostępnych na rynku polimerów i glukozy. Maksimum absorpcji i absorpcji przy 480 nm 16 dostępnych na rynku polimerów (1 g/L) oraz glukozy (1 g/L) zmierzono metodą fenolowo-siarkową. Obliczono absorbancję w stosunku do glukozy wszystkich polimerów.

szt. szt. pkt. jedn. osób osób szt. szt.

	norma	Średnia^a	Precyzja^a	Precyzja^a
	mg/L	mg/L	Wskaźnik zaopatrzenia (CV%)	Stronniczość (%error)
Rozcieńczenie 1:10	450	460	Pytanie 1,01	2.14
	Rozdział 45	44,7	Rozdział 1,41	-0,70
Rozcieńczenie 1:100	4 500	5 026	Pytanie 1,19	Rozdział 11,6
	450	471	Pytanie 1,16	Godzina 4,55
^b Wykonywane za pomocą testu t-Studenta (α = 0,05; n = 8).
CV: współczynnik zmienności.

Tabela 6: Walidacja automatycznego rozcieńczania do testu glukozy. Zwalidowano rozcieńczenie do testu glukozy po hodowli (1:100) i po filtracji żelowej (1:10). Dwa stężenia glukozy (n = 8) rozcieńczono za pomocą systemu obsługi cieczy i oceniono. Obliczono średnią, precyzję i dokładność.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. jezdnego pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Teoretyczna wartość stężenia glukozy	Pokryty silikonową matą do czapek			Test parowania (odkryty)
Teoretyczna wartość stężenia glukozy	Średnia^a	Precyzja^a	Precyzja^a	Średnia^a	Precyzja^a	Precyzja^a	parowanie
mg/L	mg/L	CV %	Stronniczość (%error)	mg/L	CV %	Stronniczość (%error)	%błąd
45,0	45,2	0,69	0,44	46,0	0,66	Godzina 2,05	Godzina 1,60
18,0	Rozdział 17,7	0,80	-1,68	18,0	0,72	-0,01	Rejon 1,69
9,0	8,74	Godzina 1,20	-2,98	8,92	0,81	-0,95	Godzina 2.09
Rozdział 4.5	Godzina 4,50	Pytanie 1,26	-0,04	Godzina 4,58	Wynik 1,57	1,76	Godzina 1,80
1.8	1,85	0,74	Godzina 2,90	Pozycja 2.01	Wynik 2,82	Rozdział 11,6	Godzina 8,48
0,9	Pytanie 1,03	1,43	Rozdział 14,1	Pytanie 1,16	Pytanie 3,52	Z dnia 28,3	Rozdział 12.4
^a (n = 4)
CV: współczynnik zmienności.

Tabela 7: Ocena efektu parowania zakrytego i odkrytego MTP. Sześć różnych wzorców glukozy (n = 4) przechowywano w karuzeli przez 3,5 godziny w temperaturze pokojowej. Efekt parowania oceniano przy użyciu niepokrytych i pokrytych (mata silikonowa) próbek wzorcowych. Obliczono średnią, precyzję, dokładność i błąd parowania w %.

osób szt. osób TGL pkt. szt. szt. Rozdział

	Przed filtracją żelową		Po filtracji żelowej		Pozostała glukoza po filtracji żelowej
	Średnia^a	SD^a	Średnia^a	SD^a	Pozostała glukoza po filtracji żelowej
	mg/L	mg/L	mg/L	mg/L	%
1	8 647	Rozdział 110	259	Rozdział 121	Godzina 3.00
cyfra arabska	5 108	56 Rozdział 56	Rozdział 116	37	Wynik 2,27
3	2 014	12	50,8	14	Pytanie 2,52
4	1 015	12	Pytanie 25,1	Rozdział 8.1	Godzina 2,47
5	510	Pytanie 4.9	Rozdział 12,8	4.3	Klasa 2,51
6	Rozdział 223	8,6	6,6	1,5	Wynik 2,94
7	122 Rozdział 122	5,6	4.3	0,9	Rejon 3,48
8	75	6,0	3.1	0,3	Rozdział 4.18
^a (n=8)
SD: odchylenie standardowe

Tabela 8: Wyniki skuteczności filtracji żelowej. Określono osiem różnych standardów glukozy przed i po filtracji żelowej, aby ocenić skuteczność filtracji żelowej. Obliczono średnią, odchylenie standardowe i pozostałą glukozę po filtracji żelowej w %.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykrywanie polisacharydów metodą fenolowo-siarkową: Różne monosacharydy wykazują różne maksima absorpcji i współczynniki ekstynkcji molowej przy zastosowaniu tej metody⁹. Powoduje to różne maksima wchłaniania polimerów, które zawierają kilka cukrów w różnych ilościach. Różne długości fal maksimów absorpcji dla 16 różnych dostępnych na rynku polimerów podano w tabeli 5. Polimery rozpuszczono (1 g/l) w ddH₂O, wymieszano (150 obr./min) przez noc i zmierzono metodą fenolowo-siarkową. Guma Diutan wykazała najniższe maksima wchłanialności przy 470 nm, a skleroglukan i kwas hialuronowy najwyższe przy 484 nm. Na podstawie tych wyników wybrano 480 nm dla tej platformy przesiewowej. Absorbancję względną polimerów obliczono na podstawie absorbancji uzyskanej przy 1 g/l glukozy (ustawionej na 100%). Najniższe wyniki uzyskano w przypadku skleroglukanu i sukcynoglikanu, w obu przypadkach po 92%. Było to oczekiwane, ponieważ skleroglukan zawiera tylko glukozę, a sukcynoglikan zawiera glukozę i galaktozę w stosunku 7:1. Oba polimery handlowe mają różne straty wysuszenia i różną zawartość popiołu, co jest powodem, dla którego teoretyczna wartość ~110% nie została osiągnięta. Xylan wykazał najwyższą absorbancję względną na poziomie 311%. Powodem tego jest wysoki współczynnik ekstynkcji molowej osiągnięty z ksylozy ze względu na bardziej dominującą formę furanozy. Przy poziomie glukozy 0,1 g/l osiągnięto granicę oznaczalności, a także granicę wykrywalności przy stężeniu <0,05 g/l. Jednak granica wykrywalności dla szczepów dodatnich w badaniu przesiewowym jest wyższa niż 0,7 g/l, a zatem test wykazał dobrą wydajność. W celu uzyskania wiarygodnych wyników, pozostałą glukozę po filtracji żelowej oznaczono za pomocą testu glukozy i wartość tę odjęto od wartości z metody fenolowo-siarkowej.

Zautomatyzowane rozcieńczanie glukozy: Zbadano wydajność oznaczania glukozy po hodowli (rozcieńczenie 1:100). W tym celu 10 μl supernatantu przeniesiono do 990 μl ddH₂O na płytce głębokiej studzienki i wymieszano przez dziesięciokrotne zasysanie i dozowanie 180 μl z tego rozcieńczenia. Drugim krytycznym krokiem było prawidłowe odpipetowanie tylko 5 μl podwielokrotności do rozcieńczenia 1:10 z testu glukozy po filtracji żelowej. W celu wytworzenia rozcieńczenia 25 μl ddH₂O przeniesiono najpierw końcówką o wielkości 50 μl, a następnie odessano razem 20 μl ddH₂O i 5 μl filtratu żelowego. Zapewnia to lepsze usunięcie 5 μl podwielokrotności z końcówki. Oba etapy rozcieńczania zostały zweryfikowane z różnymi standardami glukozy za pomocą testu glukozy. Wyniki dla dwóch przykładowych stężeń przedstawiono w tabeli 6. Rozcieńczenie 1:100 do oznaczania zawartości glukozy po hodowli wykazało wysoką precyzję dla obu wzorców z CV <1,2%. W tym samym czasie dokładność dla wyższego standardu wynosiła do 11,6 (błąd procentowy). Jest to jednak nieistotne, ponieważ oznaczanie glukozy reprezentuje tylko pozostałą zawartość glukozy po hodowli, a zatem nie jest ważne dla wykrywania polimerów. Rozcieńczenie 1:10 pozostałej glukozy po filtracji żelowej wykazało bardzo wiarygodne wyniki z CV <1,4% i błędem dokładności <2,1%.

Rozważenie parowania: Badanie przesiewowe wymaga 3,5 godziny od pierwszego kroku do pierwszego testu glukozy. Aby dowiedzieć się, czy ten przedział czasowy ma wpływ na nieograniczone przechowywanie MTP, 50 μl wzorców kalibracyjnych do oznaczania glukozy przechowywano z pokrywą i bez niej przez 3,5 godziny w karuzeli robota. W zakresie kalibracji (od 45 do 4,5 mg/l) stężenie próbki prawie nie wzrosło. Wzrost – spowodowany parowaniem – wynosił poniżej 2,1% i tylko dla dwóch najniższych stężeń (1,8 i 0,9 mg/L) osiągnął aż 12,4% (tab. 7).

Filtracja żelowa: Duże ilości niemetabolizowanej glukozy zakłócają ilościowe wykrywanie glukozy z hydrolizowanego polimeru. W związku z tym konieczne było przeprowadzenie etapu filtracji żelowej w celu usunięcia pozostałej glukozy po uprawie. Dodatkowo filtracja żelowa oczyszcza polimer zawierający supernatant z soli i monomerycznych związków węglowodanowych, innych niż glukoza, w celu zminimalizowania tła analitycznego w analizie monomerów. Na etapie filtracji żelowej 35 μl filtratu umieszczono w środku studni. W celu walidacji niezawodności filtracji żelowej w zautomatyzowanym systemie przefiltrowano osiem wzorców kalibracyjnych od 0,045 do 9 g/l glukozy (n = 8). Stężenie glukozy w każdym stężeniu było zawsze obniżone o więcej niż 95% wartości początkowej (tab. 8). W ten sposób filtracja żelowa wykazała bardzo dobre wyniki dla różnych stężeń glukozy. Dodatkowo, pozostała glukoza po filtracji żelowej została również oznaczona za pomocą testu glukozy i odjęta od oznaczenia fenolowo-siarkowo-kwasowego, aby otrzymać odpowiednią ilość ekwiwalentu glukozy dla hydrolizowanego polimeru.

Test pirogronianowy: Przede wszystkim zbadano, czy zneutralizowana i rozcieńczona (1:10) matryca TFA z etapu hydrolizy zakłóca reakcję enzymatyczną. W związku z tym pełny test został przeprowadzony dwukrotnie, raz z matrycą i jeden raz bez matrycy i wykazał wiarygodne wyniki. Na koniec udało się zmierzyć zawartość pirogronianu w 16 dostępnych na rynku polimerach, co przedstawiono na rysunku 3. Powszechnie wiadomo, że spośród tych 16 polimerów tylko sukcynoglikan i ksantan naturalnie zawierają pirogronian. W naszym teście pirogronianowym oba te polimery zostały prawidłowo zidentyfikowane. W skleroglukanie wykryto również znaczne ilości gumy welan i pirogronianu ksylanu. Ogólnie rzecz biorąc, możliwości tego podejścia zostały zweryfikowane, a test pirogronianowy wykazał wysoką wydajność. Okazało się, że jest on w stanie wykryć pirogronian w różnych polimerach po hydrolizie.

Odcisk palca węglowodanów: Po wykonaniu wszystkich modułów analitycznych w zautomatyzowanym badaniu przesiewowym, potencjalni producenci EPS zostali wybrani do analizy odcisków palców węglowodanów. W tym celu zastosowano kilka kryteriów: 1) Pozytywna obserwacja lepkości po odwirowaniu i/lub po filtracji. 2) Opady przed i po filtracji. Obserwowane włókna i płatki oceniono jako pozytywne. 3) Wartość ekwiwalentu glukozy z metody fenolowo-siarkowej. Wartości >700 mg/L zostały ocenione jako pozytywne, a wartości od 300 do 700 mg/L zostały ocenione jako przypuszczalni producenci EPS. Gdy dwa lub trzy kryteria zostały ocenione jako pozytywne, szczepy zostały wybrane do dalszej analizy odcisków palców węglowodanów. Kryteria można dostosować do indywidualnego celu przesiewania EPS (np. EPS o niskiej lepkości). Nasze podejście miało na celu znalezienie wydajnych producentów styropianu. W przypadku poszukiwania szczepów, które wytwarzają tylko niewielkie ilości EPS, należy zmniejszyć limit oceny ekwiwalentu glukozy.

Korzyści techniczne i przyszłe zastosowania: Jedną z interesujących cech tego protokołu jest modułowy charakter kroków i różnych modułów analitycznych. Można je łączyć na różne sposoby, dostosowywać do indywidualnych wymagań i łatwo wdrażać nowatorskie moduły. Ponadto moduły analityczne mogą być używane oddzielnie, np. moduł hydrolizy w połączeniu z modułem derywatyzacji HT-PMP jest w stanie przeprowadzić analizę składu monomerycznego z różnych roztworów polimerowych (1 g/l) w formacie 96-dołkowym. W przypadku laboratoriów, które nie mają dostępu do systemu obsługi cieczy, pełne przesiewanie może być wykonywane ręcznie bez żadnych zmian w schemacie pipetowania. Jednak zastosowanie systemu obsługi cieczy zwiększa przepustowość do 768 szczepów (zamiast 192 szczepów w przypadku ręcznego przesiewania) dziennie. Opisany tutaj protokół umożliwia badanie przesiewowe różnych rodzajów, a tym samym badanie przesiewowe dużych kolekcji szczepów w celu zidentyfikowania nowych producentów EPS i przeanalizowania ich odcisku palca węglowodanów w jednym podejściu (ryc. 4). Co więcej, za pomocą szczegółowej analizy monosacharydów można przeprowadzić ukierunkowane badania przesiewowe pod kątem polisacharydów zawierających rzadkie cukry, takie jak fukoza, kwasy uronowe, a nawet nieznane cukry. Można również wykryć różne kombinacje cukrów w określonych proporcjach. Umożliwia to prostą identyfikację strukturalnie powiązanych wariantów już znanego EPS lub nowatorskiego EPS.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy Thomasowi Howe'owi i Jörgowi Carstenowi za programowanie i wsparcie techniczne przy systemach obsługi cieczy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96-dołkowa płytka głębinowa 2,0 ml (DWP)	Greiner Bio-One	780271	Kultura główna (CP 1-1 do 1-4), płytki równowagowe do filtracji żelowej (CP 1-6, 1-7, 2-6 i 2-7), rozcieńczenie 1:100 do oznaczania glukozy (CP 4-1 do 4-4) zawierające 990 &mikro; l z ddH₂O
Oddychająca folia uszczelniająca	Axygen	BF-400-S Folia	inkubacyjna do hodowli wstępnej i głównej Aluminiowa
folia uszczelniająca	Axygen	PCR-AS-200-80	° Folia do przechowywania C do płytek z glicerolem
MCA96 Zagnieżdżone jednorazowe końcówki 200 i mikro; l	TECAN	30038619	Pozycja stołu roboczego (WTP 2-1 do 2-4)
A/B szklana płyta filtracyjna 1 &mikro; m	Pall Corporation	PN 8031	Przechowywany na płytce kolektora (CP 2-1 do 2-4)
96-dołkowa mikro płytka miareczkowa V-Bottom	Greiner Bio-One	651201	Płytka kolektora do płytki filtracyjnej (CP 2-1 do 2-4)
96-dołkowa kolumna spinowa G-25	Aparat Harvard	74-5612	Przechowywana na myciu DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 i 2-7)
96-dołkowa mikro płytka miareczkowa V-Bottom	Nunc	249944	Płytka kolektora do płyty do filtracji żelowej (CP 3-1 do 3-4)
Zagnieżdżone końcówki jednorazowe SBS 50 µ l końcówki	TECAN	30038609	Pozycja karuzelowa (CP 4-6, 4-7 i 5-1 do 5-6)
Koryto 250 ml	Axygen	Res-SW96-HP	Woda WTP 1-1, Mieszanina odczynników do oznaczania glukozy WPT 1-2, bufor octanu amonu pH 5,6 (CP 5-7)
96-dołkowa mikropłytka miareczkowa F-Bottom (MTP)	Greiner Bio-One	655101	strącanie 1 (CP 6-1 do 6-4), wartość pH (CP 7-1 do 7-4), wytrącanie 2 (CP 8-1 do 8-4), metoda kwasu fenolowo-siarkowego (CP 8-5 do 8-8), test glukozy (CP 9-1 do 9-9), płytki atrapy (WTP 3-1, 3-2)
96-dołkowa mata silikonowa	Whatmann	7704-0105	Mata ochronna do MTP
200 µ l końcówki do pipet	Sarstedt	70.760.002	Do ręcznej obsługi
1 000 &mikro; l końcówki do pipet	Sarstedt	70.762	Do ręcznej obsługi
96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania PCR	Marka	781350	Hydroliza, derywatyzacja PMP
TPE (elastomer termoplastyczny) mata do czapek	Marka	781405	Hydroliza, PMP-derywatyzacja
Płyta filtracyjna 0,2 &mikro; m Supor	Pall Corporation	PN 8019	Filtracja próbek do analizy UHPLC-ESI-MS z płytką kolektora MTP
Końcówki do pipet LHS 5-300 &mikro; l	Marka	732150	Markowy system LHS
Oksydaza glukozowa	Sigma-Aldrich	G2133	Test glukozy
Peroksydaza chrzanowa	Sigma-Aldrich	P6782	Test glukozy, test pirowatowy
DA-64 (N-(sól sodowa karboksymetyloaminokarbonylo)-4,4'-bis(dimetyloamino)-difenyloamina)Wako	Chemicals GmbH	043-22351	Test pirogronianowy
Oksydaza pirogronianowa	Test Sigma-Aldrich	P4591	Test pirowatowy
Fosforan potasu dwuzasadowy	Carl-Roth	P749.3	Test pirowatu i glukozy
Jednozasadowy fosforan potasu	Carl-Roth	3904.3	Test pirogronowy i glukozy
Pirofosforan tiaminy	Sigma-Aldrich	C8754	Test pirowata:
Chlorek magnezu sześciowodny	Sigma-Aldrich	31413	Test pirogronowy
2-propanol	VWR	20922.466	Strącanie
Fenol	VWR	20599.231	Metoda fenolowo-siarkowa
Kwas siarkowy	Carl-Roth	4623.4	Metoda fenolowo-siarkowa
Kwas trifluorooctowy	Sigma-Aldrich	T6508	Hydroliza
Roztwór amonu	Carl-Roth	P093.1	Hydroliza, PMP-derywatyzacja
Etanol absolut	VWR	20821.321	Hydroliza, PMP-derywatyzacja
Fenol czerwony	Alfa Aesar	B21710	Hydroliza, PMP-derywatyzacja
1-fenylo-3-metylo-5-pirazolon	Sigma-Aldrich	M70800	PMP-derywatyzacja
Metanol LC-MS	VWR	83638.320	PMP-derywatyzacja
Acetonitryl LC-MS	VWR	83040.320	PMP-derywatyzacja
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	338826	PMP-derywatyzacja
Etanol absolut	VWR	20821.321	PMP-derywatyzacja
Czerwień metylowa	Alfa Aesar	36667	Wartość pH
Zrobotyzowany system obsługi cieczy	Tecan	Freedom EVO	w Rysunek 2
Stacja obsługi cieczy Marka LHS		709400	Konfiguracja stołu roboczego w Rysunek 2
Adapter końcówki	Marka	709434	Konfiguracja stołu roboczego w Rysunek 2
Płyn kończy się MC 20-300 &mikro; l	Marka	709416	Konfiguracja stołu roboczego w Rysunek 2< / mocny>
Adapter 60 mm	Marka	709430	Konfiguracja stołu roboczego w Rysunek 2< / silny>

DWP Konfiguracja stołu roboczego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Milani, J., Maleki, G. Ch. 2, Hydrocolloids in Food Industry. Food Industrial Processes - Methods and Equipment. Valdez, B. 2, InTech. (2012).
Thibodeau, A. Protecting the skin from environmental stresses with an exopolysaccharide formulation. Cosmet Toiletries. 120 (12), 81-90 (2005).
Prajapati, V. D., Jani, G. K., Zala, B. S., Khutliwala, T. A. An insight into the emerging exopolysaccharide gellan gum as a novel polymer. Carbohydr Polym. 93 (2), 670-678 (2013).
Schmidt, W., Brouwers, H. J. H., Kuehne, H. C., Meng, B. The working mechanism of starch and diutan gum in cementitious and limestone dispersions in presence of polycarboxylate ether superplasticizers. Appl. Rheol. 23 (5), 52903(2013).
Srinivasan, R. Natural Polysaccharides as Treatment Agents for Wastewater. Green Materials for Sustainable Water Remediation and Treatment. , The Royal Society of Chemistry. 51-81 (2013).
Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. High throughput exopolysaccharide screening platform: From strain cultivation to monosaccharide composition and carbohydrate fingerprinting in one day. Carbohydr Polym. 122, 212-220 (2015).
Ortega-Morales, B. O., et al. Characterization of extracellular polymers synthesized by tropical intertidal biofilm bacteria. J Appl Microbiol. 102 (1), 254-264 (2007).
Xu, R., Ma, S., Wang, Y., Liu, L., Li, P. Screening identification and statistic optimization of a novel exopolysaccharide producing Lactobacillus paracasei HCT. Afr. J. Microbiol. Res. 4 (9), 783-795 (2010).
Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28 (3), 350-356 (1956).
Masuko, T., et al. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).
Geater, C. W., Fehr, W. R., Wilson, L. A., Robyt, J. F. A more rapid method of total sugar analysis for soybean seed. Crop Sci. 41 (1), 250-252 (2001).
Sutherland, I. W. Ch 16, Microbial Exopolysaccharides. Polysaccharides Structural Diversity and Functional Versatility. Dumitriu, S. , Marcel Dekker. 431-457 (2005).
Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. C. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances?. Microbial extracellular polymeric substances: characterization, structure and function. Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. C. , Springer. 258(1999).
Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Fast carbohydrate analysis via liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection in 96-well format. J. Chromatogr. A. 1350, 44-50 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Exopolysaccharide Screening Carbohydrate Fingerprint Analysis Automated Screening Platform High Throughput Analysis Viscosity Formation Detection Alcohol Precipitation Method Phenol Sulfuric Acid Assay UHPLC UV ESI MS Monosaccharide Composition Analysis Gel Filtration Method

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły