Mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu za pośrednictwem Sporosarcina pasteurii

Podsumowanie

Protokoły dla mikrobiologicznie indukowanego wytrącania kalcytu (MICP) przy użyciu bakterii Sporosarcina pasteurii są przedstawione tutaj. Wytrącony węglan wapnia scharakteryzowano za pomocą mikroskopii optycznej i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Wykazano również, że ekspozycja na MICP zwiększa wytrzymałość gąbki na ściskanie.

Streszczenie

Badana tutaj bakteria (S. pasteurii) jest wyjątkowa w swojej zdolności, w odpowiednich warunkach, do wywoływania hydrolizy mocznika (ureolizy) w naturalnie występujących środowiskach poprzez wydzielanie enzymu ureazy. Ten proces ureolizy, poprzez łańcuch reakcji chemicznych, prowadzi do powstania osadów węglanu wapnia. Jest to znane jako mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu (MICP). Właściwe protokoły hodowli dla MICP są szczegółowo opisane tutaj. Na koniec przeprowadzono eksperymenty wizualizacyjne w różnych trybach mikroskopii, aby zrozumieć różne aspekty procesu wytrącania. Techniki takie jak mikroskopia optyczna, skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i rentgenowska spektroskopia fotoelektronowa (XPS) zostały wykorzystane do chemicznej charakterystyki produktu końcowego. Co więcej, zdolność tych osadów do zatykania porów wewnątrz naturalnego porowatego ośrodka została zademonstrowana w eksperymencie jakościowym, w którym użyto prętów gąbczastych do naśladowania sieci porów o różnych skalach długości. Gąbka zanurzona w pożywce hodowlanej zawierającej komórki bakteryjne twardnieje z powodu zatkania jej porów w wyniku ciągłego procesu wytrącania chemicznego. Ten hartowany pręt gąbczasty wykazuje lepszą wytrzymałość w porównaniu z prętem gąbczastym kontrolnym, który ulega ściśnięciu i ściśnięciu pod wpływem przyłożonego obciążenia zewnętrznego, podczas gdy utwardzony pręt jest w stanie utrzymać ten sam ciężar przy niewielkim odkształceniu.

Wprowadzenie

Sporosarcina pasteurii to bakteria Gram-dodatnia zdolna do przetrwania w wysoce zasadowym środowisku (pH~10)¹ i jest jednym z gatunków bakterii, które mogą stać się czynnikiem sprawczym zjawiska zwanego mikrobiologicznie indukowanym wytrącaniem kalcytu (MICP)^2-4. MICP to proces, w którym wytrącanie węglanu wapnia jest indukowane przez niektóre drobnoustroje w odpowiednich warunkach środowiskowych. S. pasteurii zyskał na znaczeniu w ostatnich latach ze względu na jego identyfikację jako możliwego czynnika wywołującego znaczne ilości MICP w pewnych warunkach. Możliwość ta wynika z faktu, że S. pasteurii ma wyjątkową zdolność do wydzielania dużych ilości enzymu ureazy. Enzym ten działa jak katalizator, sprzyjając przyspieszonej lizie mocznika (naturalnie występującego związku biochemicznego o powszechnej i obfitej podaży) w obecności cząsteczek wody. Poprzez kaskadę reakcji proces ten ostatecznie prowadzi do wytworzenia ujemnie naładowanych jonów węglanowych. Jony te z kolei reagują z dodatnimi jonami metali, takimi jak wapń, aby ostatecznie utworzyć osady węglanu wapnia (kalcytu); stąd oznaczenie MICP^5-9.

Proces MICP jest znany i badany od kilkudziesięciu lat^10,11. W ciągu ostatnich kilku lat MICP był badany pod kątem szerokiego zakresu zastosowań inżynieryjnych i środowiskowych, w tym oddolnego budownictwa ekologicznego¹², ulepszania konstrukcji wielkoskalowych^13,14 oraz sekwestracji i składowania dwutlenku węgla^15,16.

Na przykład, Cunnigham¹⁷ et al zaprojektował wysokociśnieniowy reaktor o umiarkowanym przepływie, zawierający rdzeń z piaskowca Berea. Reaktor został zaszczepiony bakterią S. fridgidimarina i w warunkach wtryskiwania nadkrytycznego dwutlenku węgla pod wysokim ciśnieniem zaobserwowano masowe nagromadzenie biomasy wewnątrz objętości porów, co doprowadziło do zmniejszenia przepuszczalności o ponad 95%. Jonkers i Schlangen¹⁸ badali wpływ pewnych specjalnych szczepów bakterii na proces samoleczenia w. Oczekuje się, że zewnętrzna woda transportowana do sieci porów, wchodząca przez pory powierzchniowe, aktywuje uśpione bakterie, które z kolei zwiększają wytrzymałość strukturalną poprzez MICP. Tobler¹⁹ i in. porównali aktywność ureolityczną S. pasteurii z rodzimym mikrokosmosem ureolitycznym wód gruntowych w warunkach sprzyjających MCIP na dużą skalę i stwierdzili, że S. pasteurii ma stałą zdolność do poprawy wytrącania kalcytu, nawet gdy rdzenne społeczności nie miały wcześniejszej aktywności ureazy. Mortensen²⁰ et.al badali wpływ czynników zewnętrznych, takich jak rodzaj gleby, stężenie chlorku amonu, zasolenie, stężenie tlenu i liza komórek na MICP. Wykazanie, że proces oczyszczania biologicznego jest bardzo solidny w odniesieniu do dużej zmienności przestrzeni parametrów, potwierdza przydatność tego procesu do różnych zastosowań remediacji na dużą skalę, pod warunkiem, że zostanie przeprowadzony odpowiedni proces wzbogacania w celu wzmocnienia bakterii. Phillips²¹ i nast. Wszyscy zaprojektowali eksperymenty mające na celu zbadanie zmian przepuszczalności i wytrzymałości kolumny piaskowej i rdzenia z piaskowca po wstrzyknięciu kultur S. pasteurii. Okazało się, że podczas gdy przepuszczalność zmniejszyła się 2-4 razy, podczas gdy wytrzymałość na pękanie wzrosła trzykrotnie.

S. pasteurii i jego rola w MICP są tematami aktywnych badań, a kilka kwestii związanych z mechanizmem chemicznego wytrącania się nie jest jeszcze w pełni zrozumiałych. W związku z tym bardzo ważne jest posiadanie zestawu spójnych, znormalizowanych protokołów w celu dokładnej hodowli odpowiednio wzbogaconego stada S. pasteurii w celu osiągnięcia MICP. W tym miejscu przedstawiamy rygorystyczny protokół, który zapewni powtarzalność i odtwarzalność. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły hodowli S. pasteurii i odpowiedniego wzbogacania pożywki hodowlanej w celu wywołania wytrącenia. Proces ten jest badany za pomocą różnych technik mikroskopowych, takich jak optyczna i skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) oraz rentgenowska spektroskopia fotoelektronowa (XPS). Manuskrypt koncentruje się na procesie MICP. Procedury takie jak SEM i SIMS, będące dobrze ugruntowanymi standardowymi protokołami, nie są opisane oddzielnie.

Protokół

UWAGA: Wykonaj eksperymentalne protokoły w kolejności opisanej poniżej. Protokół hodowli bakteryjnej omówiono w sekcji 1 (patrz również rysunek 1). W sekcji 2 opisano protokół wzbogacania pożywki przy użyciu dodatków zewnętrznych. W rozdziale 3 opisano protokoły mikroskopii wielomodowej. Masa wszystkich poszczególnych części składowych może być mierzona za pomocą wagi analitycznej. Objętość każdego roztworu może być mierzona za pomocą cylindra objętościowego.

UWAGA: Odpowiednie protokoły bezpieczeństwa biologicznego muszą być przestrzegane dla sekcji 1 - 2. Aby uzyskać szczegółowe informacje, skonsultuj się z instytucjonalnym biurem ds. bezpieczeństwa.

1. Kultura bakteryjna

1. Kultura bakterii - Przygotowanie podłoża na płytce agarowej
   1. Zmontuj sprzęt i składniki, takie jak szalki Petriego, kolba, baza Tris, HCl, agar, woda miliporowa, pH-metr itp. Przed użyciem wysterylizować wszystkie pojemniki w autoklawie w temperaturze 121 °C.
   2. Przygotować 1 l 0,13 M wodnego roztworu buforu Tris, mieszając 15,75 g roztworu Tris z 1 litrem wody Millipore. Aby obniżyć poziom pH pierwotnego roztworu (pH 10,4), dodaj 2 800 μl HCl (stężenie 50%). Sprawdzaj w sposób ciągły za pomocą pH-metru, aby ustawić pH = 9.
   3. Podzielić 1 l roztworu buforowego na dwie części w następujący sposób:
      1. Weź 800 ml tego roztworu. Podziel go równo na dwie części po 400 ml każda. Rozpuścić 8 g (NH₄)_2SO4 w jednym roztworze i 16 g ekstraktu drożdżowego w drugim roztworze.
      2. Pobrać pozostały (200 ml) roztwór i ponownie podzielić go na dwie części po 100 ml każda. Wymieszaj 2 g (NH₄)₂SO₄ do jednego. Do drugiego dodać 4 g ekstraktu drożdżowego i 4 g agaru.
   4. Autoklaw oddzielnie 4 roztwory po owinięciu odpowiednich kolb folią aluminiową i przyklejeniu taśm autoklawowych.
      UWAGA: Jeśli używany jest autoklaw stołowy, objętość należy ustawić na 500 ml (temperatura i ciśnienie są automatycznie określane w funkcji objętości).
   5. Po wyjęciu ich z autoklawu odłóż na bok dwa roztwory o objętości 400 ml do wykonania kroku 1.3.1 (poniżej). Wymieszać dwa roztwory o objętości 100 ml, aby uzyskać roztwór o objętości 200 ml. Wlej mieszaninę do 10-12 szalek Petriego.
2. Hodowla bakterii — przygotowanie próbki na płytce agarowej
   1. Wyjmij bulion bakteryjny z zamrażarki (-80 °C) i pozostaw do rozmrożenia. Po prawidłowym rozmrożeniu umieść wywar bakteryjny i płytkę agarową w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
   2. Wybierz mikropipetę o najmniejszym dostępnym wymiarze (0,5 - 10 μl to dobry wybór), aby narazić końcówkę wywarem Sporosarcina pasteurii. Pokryj płytkę agarową końcówką do mikropipety. Umieścić płytkę agarową z prążkami w niewstrząsającym inkubatorze w temperaturze 31 °C na 48 godzin.
   3. Po 48 godzinach wyjąć płytkę z inkubatora i sprawdzić wzrokowo, czy nie ma w niej pojedynczych kolonii. Jeśli nie ma pojedynczych kolonii, umieść je w inkubatorze na kolejne 24 godziny.
   4. Powtarzaj proces, aż zostaną wykryte pojedyncze kolonie. Nie należy przekraczać 7 dni okresu próbnego.
      UWAGA: Jeśli pojedyncze kolonie nie pojawią się nawet po tygodniu, stwierdza się, że kroki nie zostały prawidłowo wykonane i cały proces należy powtórzyć od kroku 1.
3. Hodowla bakterii - przygotowanie próbki końcowej
   1. Zmieszać ze sobą dwa 400 ml roztworów (Tris buffer + (NH₄)₂SO₄ i Tris buffer + ekstrakt drożdżowy (1.5.1) w celu uzyskania 800 ml roztworu. Przenieść 125 ml tego roztworu do kolby.
   2. Przeprowadzić oględziny powierzchni płytki agarowej, aby zidentyfikować obszary o wysokim stężeniu pojedynczych kolonii. Delikatnie szturchnij i rozbij jedną z kolonii za pomocą końcówki mikropipety.
   3. Zanurzyć tę samą końcówkę mikropipety w kolbie o pojemności 125 ml i dokładnie wymieszać, aby upewnić się, że liczba komórek jest wystarczająca do solidnego namnażania. Umieścić kolbę w inkubatorze z wytrząsaniem przy 150 obr./min, 30 °C na 2-3 dni. Po 2 - 3 dniach wyjąć kolbę z inkubatora.
4. Hodowla bakterii - końcowa liczba komórek
   1. Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie nierozcieńczonego roztworu hodowlanego za pomocą PBS, aby osiągnąć rozcieńczenie co najmniej dziesięciu milionów (^10-7), aby zapewnić pojawienie się policzalnych pojedynczych kolonii. Narysuj siedem równoległych linii w równej odległości na jednej z płytek agarowych.
      1. Zrób to, rysując pogrubione linie na dolnej powierzchni szalki Petriego, wystarczająco wyraźne, aby były widoczne z góry. Wrzuć 3 małe krople nierozcieńczonego roztworu do jednego segmentu. Dodać 1 ml nierozcieńczonego roztworu do 9 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu uzyskania rozcieńczenia w stosunku 1:10.
   2. Weź małą porcję (~ 0,1 ml) tego nowo rozcieńczonego roztworu za pomocą pipety i upuść 3 kolejne małe krople na następny segment. Przenieść nowo rozcieńczony roztwór do nowej kolby i dalej rozcieńczać dziesięć razy (10x) przez dodanie PBS. Powoduje to zmniejszenie rozcieńczenia do ^10-2 lub 1:100.
      1. Użyj tego rozwiązania 1:100 w następnym segmencie. Powtórzyć ten proces z małymi objętościami świeżo rozcieńczonych roztworów, kolejno przenosząc je do nowych kolb i stale rozcieńczając dziesięciokrotnie (10x) w połączeniu z PBS, aby uzyskać coraz więcej rozcieńczonych próbek od ^10-3 lub 1:1000 aż do ^10-7 lub 1:10 miliona do ostatniego segmentu.
   3. Wykonać liczenie na płytce Colony-Forming Unit (CFU), aby policzyć liczbę komórek obecnych na płytce agarowej po inkubacji płytki przez 1-2 dni w temperaturze 31 °C. Daje to ilościową miarę liczby bakterii w nierozcieńczonej próbce.
      UWAGA: Wartość CFU jest mierzona w oparciu o zdolność systemu do tworzenia kolonii w określonych warunkach pożywki, temperatury i czasu, przy założeniu, że każda kolonia jest oddzielona i założona przez pojedynczą żywotną komórkę drobnoustrojów.
   4. Uszczelnij szalki Petriego folią samouszczelniającą i przechowuj pozostałe przedmioty w lodówce do wykorzystania w przyszłości.

2. Protokół wzbogacania składników odżywczych w celu przyspieszenia opadów

1. Przenieść 9 ml przygotowanego płynu hodowlanego (komórki + pożywka) do kilku wysterylizowanych probówek wirówkowych, każda o objętości 10 ml każda.
2. Przygotować 100 ml roztworu podstawowego do zewnętrznego wzbogacania, składającego się z czterech składników w następujących stężeniach w pożywce świeżej: mocznik: 2 g/l, chlorek amonu: 1 g/l, wodorowęglan sodu: 212 mg/l, chlorek wapnia: 280 mg/l. Dokładnie odmierzyć wszystkie składniki za pomocą wagi analitycznej i wymieszać wszystko oprócz mocznika ze świeżą pożywką w zlewce i umieścić w autoklawie (121 °C, 15 psi, 15 min).
   1. Po autoklawie zmieszać wymaganą ilość mocznika (2 mg) z 1 ml świeżej pożywki i przepuścić przez strzykawkę wyposażoną w filtr strzykawkowy 0,22 μm, aby zakończyć proces wzbogacania.
   2. Dodać 1 ml pożywki wzbogacającej z dodatkami do wysterylizowanych probówek wirówkowych zawierających 9 ml przygotowanej cieczy hodowlanej (komórki + pożywka) (patrz krok 2.1).
      UWAGA: Spośród wszystkich tych składników, mocznik ulega degradacji w podwyższonych temperaturach i nie może być sterylizowany w autoklawie. W związku z tym, po autoklawowaniu pozostałych składników (121 °C, 15 psi, 15 min), mocznik dodaje się jako ostatni przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
3. Dokładnie wymieszaj każdą rurkę za pomocą mechanicznego wirownika. Umieścić wzbogacone ciecze (komórki + pożywka + dodatki) w inkubatorze bez wstrząsania w temperaturze 30 °C. Regularnie monitorować wszystkie jednostki pod kątem inicjacji wytrącania. Za pomocą mikroskopu świetlnego rozpocznij obserwacje mikroskopowe po wykryciu gołym okiem wystąpienia opadów. Zwykle jest to od 30 do 36 godzin po rozpoczęciu eksperymentów.

3. Protokół dla mikroskopii wielomodowej

1. Przenieś niewielką objętość (~ 1 ml) płynu do mikroskopowego systemu szkła nakrywkowego z komorą mikroskopową o dużym powiększeniu, aby przeprowadzić wstępne obserwacje w trybie jasnego pola. Na początek wszystkie obserwacje należy rozpocząć od najmniejszego powiększenia (4X). co zapewnia szeroki obszar zasięgu, a co za tym idzie globalną informację o rozmieszczeniu osadów.
2. Zaznacz określone obszary ze znacznymi natężeniami opadów i powiększ (20x, 40x, 60x), stopniowo zwiększając powiększenie.
   UWAGA: Ponieważ niemożliwe jest prawidłowe rozdzielenie komórek z zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej (EPS) w jasnym polu (ze względu na bardzo bliskie współczynniki załamania światła), w razie potrzeby włącz tryb kontrastu fazowego. W tym trybie widoczne są tylko kontury błon komórkowych (będące inną fazą niż komórka masowa), co umożliwia wizualne różnicowanie.
3. Na koniec zabarwić niektóre komory bejcą Live/Dead, która selektywnie barwi żywe komponenty na zielono, jednocześnie barwiąc martwe elementy na czerwono. Patrz standardowe protokoły²⁸.
4. Włącz tryb fluorescencyjny, aby prawidłowo odróżnić obszary czerwone i zielone. Czerwone (czerwona kostka filtracyjna o długości fali wzbudzenia 540 - 580 nm, zwierciadło dichroiczne o długości fali 595 nm i filtr barierowy o długości 600 - 660 nm) i zielone (GFP długoprzepustowa zielona kostka filtracyjna o długości fali wzbudzenia 440 - 480 nm, zwierciadło dichroiczne o długości 505 nm i filtr barierowy 510 nm) kostki filtracyjne są używane do ułatwienia wykonywania mikrofotografii fluorescencyjnych.
5. Po zebraniu wszystkich danych w wielu trybach wybierz najlepsze obrazy i ręcznie nakładaj (pojedyncze obrazy w jasnym polu, kontrast fazowy i obrazy fluorescencyjne), aby uzyskać najlepszy możliwy kontrast i klarowność.
6. Wykonaj SEM na wysuszonych próbkach stałych, aby zrozumieć struktury krystaliczne. Jest to dobrze ugruntowana i standardowa procedura. ²² Wykonaj XPS w celu identyfikacji sygnatur chemicznych grup funkcyjnych (węglanów). Jest to również dobrze ugruntowana i standardowa procedura. ²³

Wyniki

S. pasteurii, będąc organizmem alkalifilnym²⁴, może przetrwać w stosunkowo trudnych warunkach. Przy zastosowaniu wspomnianego protokołu hodowli i uprawie S. pasteurii w komorze, bakterie prowadzą z czasem do wytrącenia węglanu wapnia (Rysunek 2A). Rysunek 2 (b) przedstawia obraz z mikroskopu optycznego w kontraście fazowym, ukazujący populację komórek bakteryjnych w pożywce hodowlanej. Można wyraźnie rozpoznać pojedyncze komór...

Dyskusja

Kroki krytyczne: Rękopis ten szczegółowo opisuje protokoły hodowli żywej próbki S. pasteurii. Gdy kultura jest już gotowa, należy ją odpowiednio wzbogacić. Jest to kluczowy krok kluczowy dla powodzenia eksperymentu, ponieważ brak zapewnienia odpowiedniego środowiska chemicznego prowadzi albo do bardzo długich skal czasowych opadów, albo do ich całkowitego braku. S. pasteurii jest dość wrażliwy na kilka czynników zewnętrznych i musi być hodowany z dużą starannością i precyzją, aby zapewn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Petridish	Fisher Scientific	FB0875712	Petridish jest używany jako kolby pyrexowe na płytce agarowej
	Fisher Scientific	S63268	Corning Erlenmeyer
Tris-Base	Promega	H5133	używany do wytwarzania kwasu solnego Tris-Buffer
	Sigma-Aldrich	H9892	1,0 N, bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych
Agar w proszku	Sigma-Aldrich	A1296	testowany mikrobiologicznie, testowany na kulturach komórkowych roślinnych, testowany na kulturach komórkowych, proszek
Siarczan amonu	Sigma-Aldrich	A4418	do biologii molekularnej
Ekstrakt drożdżowy w proszku	Sigma-Aldrich	51475
Cylinder miarowy	Cole-Parmer	CP08559GC	Cylinder z podziałką klasy A z Cal Cert, TC; 1,000 ml,1/opk
Waga analityczna	OHAUS	AX124E	służy do pomiaru masy odczynników
Autoklaw	Brinkmann	58619000
Taśma autoklawowa	VWR	52428864
Folia aluminiowa	Sigma-Aldrich	Z185140	używana do uszczelniania kolby przed umieszczeniem jej w autoklawie
Kolba bakteryjna	Cedarlane	11859	-80 stopni Celsjusza; C zapas S. pasteurii, nr ATCC jest wymieniony przeciwko Cat. Nie.
Jednokanałowe pipety mechaniczne Mline, o zmiennej objętości	Biohit	725010	Sprzedawane przez firmę VWR pod numerem katalogowym 14005976
Końcówka do mikropipet	Fisher Scientific	212772B	Służy do drapania płytek agarowych
Inkubator	Spoiwo	80079098	Inkubator mikrobiologiczny,
inkubator wytrząsający	VWR	14004300	Wytrząsanie stołowe VWR Signature Inkubatory
Bufor fosforanowy Solanka (PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
Urządzenie do pipetowania BD Falcon Express Pipet-Aid	BD Biosciences	357590	Sprzedawane przez VWR pod numerem katalogowym 53106220
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Używany do uszczelniania płytek agarowych
Mocznik	Sigma-Aldrich	U1250	Wzbogacenie o pożywkę
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S8875	Wzbogacenie na pożywkę
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C1016	Wzbogacenie na pożywkę

serii BF