Protokoły dla mikrobiologicznie indukowanego wytrącania kalcytu (MICP) przy użyciu bakterii Sporosarcina pasteurii są przedstawione tutaj. Wytrącony węglan wapnia scharakteryzowano za pomocą mikroskopii optycznej i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Wykazano również, że ekspozycja na MICP zwiększa wytrzymałość gąbki na ściskanie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu za pośrednictwem Sporosarcina pasteurii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badana tutaj bakteria (S. pasteurii) jest wyjątkowa w swojej zdolności, w odpowiednich warunkach, do wywoływania hydrolizy mocznika (ureolizy) w naturalnie występujących środowiskach poprzez wydzielanie enzymu ureazy. Ten proces ureolizy, poprzez łańcuch reakcji chemicznych, prowadzi do powstania osadów węglanu wapnia. Jest to znane jako mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu (MICP). Właściwe protokoły hodowli dla MICP są szczegółowo opisane tutaj. Na koniec przeprowadzono eksperymenty wizualizacyjne w różnych trybach mikroskopii, aby zrozumieć różne aspekty procesu wytrącania. Techniki takie jak mikroskopia optyczna, skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i rentgenowska spektroskopia fotoelektronowa (XPS) zostały wykorzystane do chemicznej charakterystyki produktu końcowego. Co więcej, zdolność tych osadów do zatykania porów wewnątrz naturalnego porowatego ośrodka została zademonstrowana w eksperymencie jakościowym, w którym użyto prętów gąbczastych do naśladowania sieci porów o różnych skalach długości. Gąbka zanurzona w pożywce hodowlanej zawierającej komórki bakteryjne twardnieje z powodu zatkania jej porów w wyniku ciągłego procesu wytrącania chemicznego. Ten hartowany pręt gąbczasty wykazuje lepszą wytrzymałość w porównaniu z prętem gąbczastym kontrolnym, który ulega ściśnięciu i ściśnięciu pod wpływem przyłożonego obciążenia zewnętrznego, podczas gdy utwardzony pręt jest w stanie utrzymać ten sam ciężar przy niewielkim odkształceniu.
Wprowadzenie
Sporosarcina pasteurii to bakteria Gram-dodatnia zdolna do przetrwania w wysoce zasadowym środowisku (pH~10)1 i jest jednym z gatunków bakterii, które mogą stać się czynnikiem sprawczym zjawiska zwanego mikrobiologicznie indukowanym wytrącaniem kalcytu (MICP)2-4. MICP to proces, w którym wytrącanie węglanu wapnia jest indukowane przez niektóre drobnoustroje w odpowiednich warunkach środowiskowych. S. pasteurii zyskał na znaczeniu w ostatnich latach ze względu na jego identyfikację jako możliwego czynnika wywołującego znaczne ilości MICP w pewnych warunkach. Możliwość ta wynika z faktu, że S. pasteurii ma wyjątkową zdoln....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wykonaj eksperymentalne protokoły w kolejności opisanej poniżej. Protokół hodowli bakteryjnej omówiono w sekcji 1 (patrz również rysunek 1). W sekcji 2 opisano protokół wzbogacania pożywki przy użyciu dodatków zewnętrznych. W rozdziale 3 opisano protokoły mikroskopii wielomodowej. Masa wszystkich poszczególnych części składowych może być mierzona za pomocą wagi analitycznej. Objętość każdego roztworu może być mierzona za pomocą cylindra objętościowego.
UWAGA: Odpowiednie protokoły bezpieczeństwa biologicznego muszą być przestrzegane dla sekcji 1 - 2. Aby uzyskać szczegółowe informacje, skonsultuj się z instytucjonaln....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
S. pasteurii, będąc organizmem alkalifilnym24, może przetrwać w stosunkowo trudnych warunkach. Przy zastosowaniu wspomnianego protokołu hodowli i uprawie S. pasteurii w komorze, bakterie prowadzą z czasem do wytrącenia węglanu wapnia (Rysunek 2A). Rysunek 2 (b) przedstawia obraz z mikroskopu optycznego w kontraście fazowym, ukazujący populację komórek bakteryjnych w pożywce hodowlanej. Można wyraźnie rozpoznać pojedyncze komór.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kroki krytyczne: Rękopis ten szczegółowo opisuje protokoły hodowli żywej próbki S. pasteurii. Gdy kultura jest już gotowa, należy ją odpowiednio wzbogacić. Jest to kluczowy krok kluczowy dla powodzenia eksperymentu, ponieważ brak zapewnienia odpowiedniego środowiska chemicznego prowadzi albo do bardzo długich skal czasowych opadów, albo do ich całkowitego braku. S. pasteurii jest dość wrażliwy na kilka czynników zewnętrznych i musi być hodowany z dużą starannością i precyzją, aby zapewn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Pragniemy podziękować partnerom z Inicjatywy Helmholtz-Alberta, Stowarzyszeniu Helmholtza i Uniwersytetowi Alberty za wsparcie wynikające z udziału w tej współpracy. Finansowanie badań jest zapewniane przez Fundusz Inicjatyw i Sieci Kontaktów Stowarzyszenia Helmholtza, uczestniczące Centra Helmholtza oraz przez rząd Alberty w ramach programu ecoTrust Alberta Environment.
Dr. Tanushree Ghosh jest wdzięczna za jej krytyczny wkład na wielu kluczowych etapach.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Petridish | Fisher Scientific | FB0875712 | Petridish jest używany jako kolby pyrexowe na płytce agarowej |
| Fisher Scientific | S63268 | Corning Erlenmeyer | |
| Tris-Base | Promega | H5133 | używany do wytwarzania kwasu solnego Tris-Buffer |
| Sigma-Aldrich | H9892 | 1,0 N, bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych | |
| Agar w proszku | Sigma-Aldrich | A1296 | testowany mikrobiologicznie, testowany na kulturach komórkowych roślinnych, testowany na kulturach komórkowych, proszek |
| Siarczan amonu | Sigma-Aldrich | A4418 | do biologii molekularnej |
| Ekstrakt drożdżowy w proszku | Sigma-Aldrich | 51475 | |
| Cylinder miarowy | Cole-Parmer | CP08559GC | Cylinder z podziałką klasy A z Cal Cert, TC; 1,000 ml,1/opk |
| Waga analityczna | OHAUS | AX124E | służy do pomiaru masy odczynników |
| Autoklaw | Brinkmann | 58619000 | |
| Taśma autoklawowa | VWR | 52428864 | |
| Folia aluminiowa | Sigma-Aldrich | Z185140 | używana do uszczelniania kolby przed umieszczeniem jej w autoklawie |
| Kolba bakteryjna | Cedarlane | 11859 | -80 stopni Celsjusza; C zapas S. pasteurii, nr ATCC jest wymieniony przeciwko Cat. Nie. |
| Jednokanałowe pipety mechaniczne Mline, o zmiennej objętości | Biohit | 725010 | Sprzedawane przez firmę VWR pod numerem katalogowym 14005976 |
| Końcówka do mikropipet | Fisher Scientific | 212772B | Służy do drapania płytek agarowych |
| Inkubator | Spoiwo | 80079098 | Inkubator mikrobiologiczny, |
| inkubator wytrząsający | VWR | 14004300 | Wytrząsanie stołowe VWR Signature Inkubatory |
| Bufor fosforanowy Solanka (PBS) | Sigma-Aldrich | P7059 | |
| Urządzenie do pipetowania BD Falcon Express Pipet-Aid | BD Biosciences | 357590 | Sprzedawane przez VWR pod numerem katalogowym 53106220 |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Używany do uszczelniania płytek agarowych |
| Mocznik | Sigma-Aldrich | U1250 | Wzbogacenie o pożywkę |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | S8875 | Wzbogacenie na pożywkę |
| Chlorek wapnia | Sigma-Aldrich | C1016 | Wzbogacenie na pożywkę |
Bibliografia
- Gibson, T. An investigation of the Bacillus pasteurii group. Journal of Bacteriology. 28, 491-502 (1934).
- Greenfield, L. J. Metabolism and concentration of calcium and magnesium and precipitation of calcium carbona....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
