Porównanie powinowactwa białek wiążących GTPazę przy użyciu testów konkurencji

Summary

Ten protokół porównuje względne pokrewieństwo partnerów wiążących dla GTPaz rodziny Rho, w tym Rac1. In vivo białka wiążące Rac1 konkurują o pojedynczy interfejs wiążący, którego konformacja jest podyktowana przez związany nukleotyd. Nukleotyd jest zarówno ważny, jak i trudny do kontrolowania eksperymentalnie ze względu na wysoką szybkość hydrolizy.

Abstract

W tym protokole demonstrujemy metodę porównywania konkurencji między białkami wiążącymi GTPazę. Takie podejście jest ważne dla określenia zdolności wiązania GTPaz z dwóch powodów: fakt, że wszystkie interakcje obejmują tę samą powierzchnię GTPaz oznacza, że zdarzenia wiązania muszą być rozpatrywane w kontekście konkurentów, a fakt, że związany nukleotyd musi być również kontrolowany, oznacza, że konwencjonalne podejścia, takie jak immunoprecypitacja, są nieodpowiednie dla biochemii GTPazy. Test opiera się na użyciu oczyszczonych białek. Oczyszczony Rac1 unieruchomiony na kulkach jest używany jako białko przynęty i może być załadowany GDP, niehydrolizowaną wersją GTP lub pozostawioną wolną od nukleotydów, dzięki czemu można kontrolować etap sygnalizacji, który ma być badany. Białka wiążące, które mają być badane, są oczyszczane z komórek ssaków, aby umożliwić prawidłowe fałdowanie, za pomocą znacznika GFP. Zastosowanie tego samego znacznika na obu białkach jest ważne, ponieważ nie tylko umożliwia szybkie oczyszczanie i elucję, ale także umożliwia wykrycie obu konkurentów z tym samym przeciwciałem podczas elucji. Oznacza to, że można dokładnie określić względne ilości dwóch związanych białek.

Introduction

Cytoszkielet aktynowy, który decyduje o kształcie, polarności i właściwościach migracyjnych komórek ssaków, jest regulowany przez rodzinę Rho małych GTPaz. GTPazy z rodziny Rho obejmują RhoA, który stymuluje skurcz cytoszkieletu, Rac1, który stymuluje rozgałęzianie się aktyny i wypukłość błony, oraz Cdc42, który ma podobny wpływ na polimeryzację aktyny do Rac1 i powoduje powstawanie filopodiów ^1,2. Aktywność sygnalizacyjna GTPazy jest określana przez wiązanie nukleotydu, który kontroluje kurczenie się i rozluźnianie pętli przełącznika I i przełącznika II, które pośredniczą w interakcjach białko-białko zarówno z regulatorami, jak i efektorami. GTPazy związane z 5'-trifosforanem guanozyny (GTP) aktywują dalsze efektory, podczas gdy forma związana z 5'-difosforanem guanozyny (GDP) jest nieaktywna. W komórce cykle hydrolizy GTP i wymiany nukleotydów umożliwiają szybką wymianę sygnałów GTPazy, które są niezbędne do dynamiki cytoszkieletu. Obrót nukleotydów jest regulowany przez trzy mechanizmy. Czynniki wymiany nukleotydów guaniny (GEF) stabilizują wolną od nukleotydów GTPazę, katalizując wymianę GDP na GTP, a tym samym stymulując aktywność sygnalizacyjną GTPazy ^3,4. Białka aktywujące GTPazę (GAP) katalizują hydrolizę GTP do GDP, hamując w ten sposób aktywność sygnalizacyjną GTPazy ⁵. Cząsteczki sekwestrujące, takie jak regulator kondensacji chromatyny 2 (RCC2) i inhibitory dysocjacji nukleotydów guaninowych (GDI), zasłaniają pętle przełączające, aw przypadku GDI usuwają GTPazę z błony poprzez interakcję z ogonem prenylu ^6,7. Każda z trzech klas cząsteczek regulatorowych oddziałuje z pętlami przełączającymi, podobnie jak efektory i niektóre regulatory transportu, takie jak koronina-1C ⁷. Celem tego protokołu jest pomiar konkurencji o miejsce wiązania przełącznika I/II między domniemanymi regulatorami a dalszymi cząsteczkami sygnałowymi. Należy zauważyć, że testy konkurencji testują wiązanie ze wspólnym miejscem wiązania, tak że protokół ten nie nadaje się do testowania interakcji z innymi miejscami, takich jak wiązanie GDI z ogonem prenylu.

Subtelność różnic w konformacji między formami aktywnymi i nieaktywnymi, w połączeniu z labilną naturą związanego nukleotydu, utrudniła badanie zdarzeń związanych z wiązaniem GTPazy. Rola związanego nukleotydu oznacza, że konwencjonalne testy wiązania, takie jak immunoprecypitacja lub powierzchniowy rezonans plazmonowy, nie nadają się do badań, ponieważ nukleotydu nie można kontrolować. Przeszkoda ta jest spotęgowana przez nakładanie się miejsc wiązania GEF, GAP, efektorów, cząsteczek sekwestrujących i cząsteczek transportujących, co utrudnia interpretację danych wiążących dla pojedynczej interakcji w kontekście konkurencji, która wystąpi w komórce. Immunoprecypitacja, w szczególności, jest zagrożona przez konkurencję między partnerami wiążącymi, ponieważ w pewnych warunkach komórkowych jeden partner wiążący może zostać zidentyfikowany kosztem wszystkich innych, podczas gdy w innych warunkach inny partner może dominować. Dynamiczna natura sygnalizacji GTPazy jest niezbędna do funkcjonowania GTPazy i musi być brana pod uwagę podczas analizy relacji między oddziaływaniami wiążącymi różnych regulatorów. Rzeczywiście, niedawno opisaliśmy ścieżkę, która w dużej mierze opierała się na konkurencyjnym wiązaniu. Zidentyfikowaliśmy koroninę-1C jako cząsteczkę transportową, która wiąże się z pętlami przełączającymi GDP-Rac1 ⁷. Na obszarach o niskiej aktywności GEF dominowałby nielegalny handel, usuwając Rac1 z tych regionów. Jednakże, gdy Rac1 jest dostarczany do regionów komórki, w których aktywność GEF jest wysoka, GEF konkuruje z koroniną-1C, tym samym zarówno aktywując Rac1, jak i zapobiegając usuwaniu Rac1 z tego obszaru za pośrednictwem koroniny-1C. Model idzie dalej, ponieważ działanie GEF powoduje wymianę PKB na GTP, przesuwając równowagę jeszcze bardziej od koroniny-1C. W związku z tym aktywność Rac1 można wyjaśnić wyłącznie w kategoriach konkurencji i względnego pokrewieństwa.

W tym protokole opisujemy metodę porównywania względnych powinowactw różnych partnerów wiążących dla małych GTPaz, używając Rac1 jako przykładu. Stosując podejście oparte na oczyszczonym białku, możliwe jest złożenie łańcucha zdarzeń sygnalizacyjnych przez porównanie par w eksperymencie, w którym związany nukleotyd może być ściśle kontrolowany.

Protocol

1. Oczyszczanie GTPazy oznaczonej GST

1. Hodowla szczepu E. coli, takiego jak BL21 przekształconego za pomocą pGEX-Rac1 O/N w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 220 obr./min, w 500 ml pożywki autoindukcyjnej (25 mM Na₂HPO₄, 25 mM KH₂PO₄, 50 mM NH₄Cl, 5 mM Na₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 0,5% glicerol, 0,05% glukozy, 0,2% laktozy, 5 g tryptonu, 2,5 g ekstraktu drożdżowego, 100 μg/ml ampicyliny).
2. Zebrać bakterie przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g, 4 °C.
3. Zawiesić osad bakteryjny w 20 ml odczynnika do ekstrakcji białek, 1x inhibitora proteazy i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej z inwersją.
4. Klarować lizat przez odwirowanie w stężeniu 40 000 x g przez 30 minut.
5. Dodać 2 ml kulek magnetycznych glutationu, przemytych solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS: 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
6. Inkubować przez 2 godziny, mieszając przez odwrócenie w temperaturze 4 °C.
7. Umyj kulki naładowane białkiem cztery razy za pomocą 10 ml PBS, używając magnetycznego sortownika cząstek, aby wytrącić kulki na każdym etapie.
8. Zawiesić kulki białkowe w 2 ml PBS i przechowywać w temperaturze -80 °C w 100 μl porcji, aż będą potrzebne.

2. Ekspresja białek wiążących GTPazę

1. Dzień przed eksperymentem, transfekcyjne plazmidy kodujące wersje każdego białka wiążącego GTPazę znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w oddzielnej kolbie o długości 75^cm2 z HEK293T w następujący sposób. W celu walidacji obciążenia nukleotydami, transfekcję TrioD1 znakowaną GFP należy umieścić w trzeciej kolbie o długości^{75 cm2} z HEK293T.
   1. Rozcieńczyć polietylenoaminę do 1 mg/ml w 100 μl sterylnego 150 mM NaCl.
   2. Dodać 27 μl rozcieńczonego polietylenu do 223 μl zredukowanej pożywki surowicy.
   3. Dodać 12 μg plazmidowego DNA do 250 μl zredukowanej pożywki surowicy.
   4. Inkubować każdą probówkę przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
   5. Połącz mieszaniny polietylenoaminy i DNA w jednej probówce i wiruj przez 2 minuty.
   6. Inkubować przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Zastąp pożywkę wzrostową (zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy, bez antybiotyków) na 90% zlewającą się HEK293T 5 ml świeżej pożywki wzrostowej.
   8. Dodać połączoną mieszaninę polietylenu i DNA do kolby i inkubować O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .

3. Oczyszczanie białek wiążących GTPazę

1. Przepłukać kolby z transfekowanymi komórkami w PBS i opróżnić kolbę przez 5 minut, zasysając wolny płyn.
2. Zeskrob komórki z 500 μl buforu do lizy (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x inhibitor proteazy) do probówki do mikrofuge.
3. Lizować komórki przez mieszanie przez odwrócenie w temperaturze 4 °C przez 30 min.
4. Podczas lizy umyć dwie partie kulek GFP-Trap o pojemności 40 μl trzykrotnie świeżym buforem do lizy, kulkami osadowymi w ilości 2 700 x g przez 2 minuty między myciami.
5. Klarować lizaty przez odwirowanie przy 21 000 x g przez 10 min.
6. Przenieść oczyszczony lizat każdego z konkurencyjnych białek do oddzielnych przemytych kulek pułapki GFP i pozwolić białkom fuzyjnym GFP związać się przez 2 godziny, mieszając przez odwrócenie w temperaturze 4 °C. Lizat z komórek GFP-TrioD1 należy przechowywać na lodzie.
7. Załadowane kulki GFP-Trap umyć dwukrotnie w 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (w/v) Nonidet P-40 i dwukrotnie w 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl₂, kulkach sedymentacyjnych przy 2 700 x g przez 2 minuty między praniami.
8. Elute białka fuzyjne GFP poprzez dodanie 40 μl 0,2 M glicyny (pH 2,5) i pipetowanie w górę iw dół przez 30 sekund. Natychmiast zderzyć osad przy 21 000 x g przez 60 s i przenieść ciecz do nowej probówki do mikrofuzy zawierającej 4 μl 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Zrób to szybko, aby ograniczyć uszkodzenia oczyszczonego białka.
9. Przeanalizować 1 μl każdego oczyszczonego białka za pomocą Western blot i sondować przeciwciałem anty-GFP, aby ustalić względną wydajność za pomocą ilościowego systemu blottingu zgodnie z protokołem producenta. Alternatywnie, można określić stężenia białek za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA), ale wprowadza to błędy, jeśli białka nie reagują z testem w identyczny sposób lub występują białka zanieczyszczające.
10. Wyrównać stężenie białka molowego przez dodanie 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl₂.

4. Obciążenie nukleotydowe GTPazy

1. Rozmrozić jedną porcję koralików magnetycznych GST-Rac1 przygotowanych w kroku 1.
2. Weź 90 μl kulek GST-Rac1 i przemyj trzykrotnie 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA, używając magnetycznego sortera cząstek, aby wytrącić kulki na każdym etapie.
3. Odessać bufor z kulek i dodać 100 μl 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA.
4. W zależności od tego, czy w eksperymencie konkursowym wymagane jest obciążenie GDP, GTP czy brak nukleotydów, dodaj 12 μl 100 mM GDP, 12 μl 10 mM 5'-[γ-tio]trifosforanu guanozyny (GTPγS) lub bez nukleotydu do 60 μl kulek GST-Rac1.
5. W przypadku kontroli obciążenia nukleotydami podziel pozostałe kulki na trzy podwielokrotności 10 μl i dodaj 2 μl 100 mM GDP, 2 μl 10 mM GTPγS lub bez nukleotydu do każdej probówki.
6. Inkubować mieszanki kulkowe przez 30 minut w temperaturze 30 °C z mieszaniem.
7. Ustabilizować Rac1 związany z nukleotydami przez dodanie 1 M MgCl₂: 3 μl do mieszaniny doświadczalnej (krok 4.4), 0,5 μl do każdej z mieszanin kontrolnych (krok 4.5).

5. Wiążące zawody.

1. Ustaw 6 probówek do mikrofuge, z których każda zawiera:
   200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl₂
   10 μl eksperymentalnych kulek Rac1 załadowanych nukleotydami (od kroku 4.7)
   5 μl białka wiążącego Rac1 A (stałe białko wiążące)
2. Do każdej probówki dodać 0, 1, 2,5, 5, 10 lub 20 μl białka B wiążącego Rac1 (białko o zmiennym wiązaniu). Objętości te zakładają w przybliżeniu równe stężenia stałych i zmiennych białek wiążących i mogą wymagać dostosowania.
   1. Dostosuj objętości białek wiążących A i B, jeśli występują duże różnice w powinowactwie wiązania dwóch białek i powinno to być określone empirycznie za pomocą powtórzeń doświadczalnych. Uzupełnić całkowitą objętość mieszaniny wiążącej do 235 μl przez dodanie 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl₂.
3. Zainstaluj probówkę do mikrofuge zawierającą:
   200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl₂
   10 μl eksperymentalnych kulek Rac1 załadowanych nukleotydami (od kroku 4.7)
   10 μl białka A wiążącego Rac1 (białko o stałym pasie)
4. Ustaw probówki kontrolne GDP, GTPγS i bez nukleotydów:
   200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl₂
   10 μl kontrolnych kulek Rac1 załadowanych w kroku 4.5 z GDP, GTPγS lub bez nukleotydu i ustabilizowanych w kroku 4.7.
   180 μl lizatu HEK293T GFP-TrioD1, przygotowanego jak w kroku 3.6
   4 μl 1 M MgCl₂
5. Inkubować mieszaninę przez 2 godziny, mieszając przez odwrócenie w temperaturze 4 °C.
6. Umyj koraliki trzykrotnie 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl₂.
7. Elute białka związane w 20 μl redukującego buforu próbki (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% glicerol, 0,02 mg/ml błękitu bromofenolowego, 5% β-merkaptoetanolu).

6. Analiza konkurencji

1. Rozpuść 10 μl związanego białka (krok 5.6) za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i Western blot.
2. Inkubować błonę w temperaturze 4 °C O/N w przeciwciałie anty-GFP rozcieńczonym 1/1000 w buforze blokującym rozcieńczonym do 1x w PBS, 0,1% Tween-20, aby wykryć oba znakowane białka wiążące GTPazę.
3. Umyj membranę trzy razy przez 10 minut za pomocą PBS, 0,1% Tween-20.
4. Inkubować błonę przez 30 minut w RT w sprzężonym z DyLight 800 drugorzędowym przeciwciałie anty-króliczym, rozcieńczonym 1/10 000 w buforze blokującym rozcieńczonym do 1x w PBS, 0,1% Tween-20.
5. Umyj membranę trzy razy przez 10 minut za pomocą PBS, 0,1% Tween-20.
6. Zeskanuj membranę za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni, korzystając z oprogramowania do pomiaru intensywności pasma zgodnie z protokołem producenta.
7. Wykreślić intensywność pasma każdego białka w stosunku do objętości zmiennego konkurenta (białka B).
8. Podzielić objętość zmiennego konkurenta w punkcie, w którym linie się przecinają, przez objętość stałego konkurenta (białko A, 5 μl), aby określić stosunek konkurenta, przy którym osiągana jest równowaga.
9. W celu walidacji stanu obciążenia nukleotydami, błony sondy dla kinazy 1 aktywowanej p21 (PAK1) (efektor) i GFP-TrioD1 (GEF), jak opisano w krokach 6.1-6.6.

Results

Ten protokół jest przeznaczony do obliczania względnego pokrewieństwa partnerów wiążących dla Rac1, bez potrzeby znajomości dokładnej koncentracji konkurentów (Rysunek 1). Oznaczanie stężenia białek wprowadza błędy i przy rozważaniach konkurencji między cząsteczkami w szlaku sygnałowym nie jest potrzebne. Jednak ważne jest, aby wiedzieć, że dwaj konkurenci mają takie samo stężenie molowe w roztworach podstawowych, aby umożliwić obliczenie prostych proporcji podczas dodawania różnych objętości do testu. 40 μl kulek GFP-Trap ma zdolność wiązania ~ 300 pmol, więc zlewająca się kolba o długości 75 cm² z wysoce eksprymującymi komórkami nasyci kulki, w wyniku czego preparaty dwóch różnych białek wiążących będą podobne przed dostosowaniem (Figura 2A). Jeśli jedno z białek ulega słabej ekspresji, problem ten można przezwyciężyć, oczyszczając to białko z więcej niż jednej kolby komórek.

Wiązanie większości efektorów i regulatorów GTPazy zależy od obciążenia nukleotydami GTPazy przynęty, dlatego ważne jest, aby sprawdzić, czy ładowanie się powiodło. Obciążenie można zweryfikować poprzez wytrącanie znanych białek wiążących z lizatów komórkowych. Białka efektorowe, takie jak PAK1, wiążą się z GTP-Rac1 i mogą być łatwo wytrącone z lizatów i wykryte przez Western blotting ⁸ (Figura 2B). GEF wiążą się preferencyjnie z GTPazą wolną od nukleotydów, aby ustabilizować stan przejściowy. Ponieważ GEF-y są mało obfite, zwykle nieaktywne i często słabo się plamią, lepiej jest nadekspresja GEF lub fragmentu GEF w celu przetestowania GTPazy wolnej od nukleotydów. Często używamy pierwszej homologii Dbl Trio, wyrażonej jako fuzja GFP (GFP-TrioD1 ⁹) (Rysunek 2B), ale każdy GEF będzie działał. Białka, które wiążą się z GTPazą obciążoną GDP, są rzadsze. Niedawno informowaliśmy, że RCC2 jest jednym z takich białek ⁷, a obciążenie GDP można po prostu zweryfikować jako wiążące się ani z GEF, ani z efektorem.

Wynikiem eksperymentu będzie Western blot przedstawiający dwóch partnerów wiążących oznaczonych przez GFP związanych z GTPazą. Używając pojedynczego przeciwciała do wykrywania obu białek, można określić stężenia, przy których wiążą się podobne ilości obu konkurentów, a tym samym wywnioskować względne powinowactwo. W tym przykładzie wykazano konkurencję między domeną śmigła białka transportującego Rac1, koroniny-1C (białko wiążące Rac1) i białko sekwestrujące Rac1, RCC2 (białko wiążące Rac1), (Figura 3A). Stosując stałą objętość śmigła koroniny-1C (5 μl) i dodając rosnące objętości RCC2, możemy zobaczyć na podstawie plamy GFP, że równowaga jest osiągana przy 1,25-2,5 μl RCC2 (gwiazdka), co pokazuje, że RCC2 ma silniejsze powinowactwo do Rac1 niż koronina-1C. Mierząc intensywność pasm za pomocą ilościowego Western blot i wykreślając średnie wartości dla każdego zawodnika, punkt równowagi można dokładnie obliczyć, identyfikując objętości, w których przecinają się krzywe (rysunek 3B).

Jedną z możliwych przeszkód dla udanego testu konkurencji jest to, że partnerzy wiążący wiążą się ze sobą, jak również wiążą się z Rac1. Na rysunku 3A+B pokazujemy konkurencję między RCC2 a domeną śmigła koroniny-1C, a nie koroniny-1C o pełnej długości. Powodem stosowania skróconej koroniny jest to, że koronina-1C wiąże również RCC2 poprzez domenę ogonową. Gdy koronina-1C o pełnej długości jest miareczkowana w stosunku do RCC2, wykrywa się wiązanie obu białek z powodu tworzenia kompleksu trójskładnikowego, a nie konkurencji (Figura 3C). Jeśli występuje konkurencja, wiązanie jednego białka wzrośnie, podczas gdy drugie zmniejszy się, a całkowita związana fuzja GFP pozostanie stała. W przypadkach, gdy tworzy się kompleks trójskładnikowy, konieczne jest skrócenie jednego z białek wiążących GTPazę, aby konkurenci nie wchodzili już w interakcje.

Rysunek 1. Przepływ pracy. Schematyczne przedstawienie przepływu pracy w celu określenia powinowactwa białek wiążących GTPazę za pomocą testów konkurencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Walidacja oczyszczonych białek. (A) Oczyszczone białka wiążące Rac1 znakowane GFP analizowane za pomocą Western blot, sondowanie anty-GFP w celu określenia względnej wydajności dwóch białek. Ten rodzaj wyrównania podczas eksperymentu pozwala na dostosowanie stężenia dwóch białek tak, aby pasowały do siebie w eksperymencie wiązania. (B) GDP, GTPγS i brak GST-Rac1 obciążony nukleotydami inkubowano z lizatem z HEK293T ekspresji GFP-TrioD1 i związanymi białkami wykrytymi przez wykreślenie endogennego PAK1 lub nadekspresji GFP-TrioD1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Analiza Western blot względnego wiązania białek. Przykładowe wyniki testów wiążących konkurencję. (A) Rac1 załadowany GDP zmieszano z 5 μl GFP-coronin-1C domeny śmigła i stopniowo miareczkowano zwiększające się objętości GFP-RCC2. Dzięki Western blotting związanym białkom dla GFP unika się problemów z różnicowym wykrywaniem dwóch białek, a sygnał GFP informuje o stosunku molowym między dwoma białkami fuzyjnymi. Gwiazdki wskazują współczynniki konkurencji po obu stronach punktu równowagi. (B) Intensywność prążków związanych białek fuzyjnych GFP z trzech niezależnych eksperymentów mierzono za pomocą ilościowego Western blot, przy użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fluoroforem i średnich wykreślonych w celu obliczenia ilości RCC2 potrzebnej do osiągnięcia równowagi. (C) Przykładowy wynik eksperymentu, w którym białka wiążące Rac1 wiążą się ze sobą i tworzą kompleks trójskładnikowy, zamiast konkurować. Rac1 obciążony GDP zmieszano z 5 μl GFP-RCC2 i miareczkowano zwiększające się objętości GFP-coronin-1C o pełnej długości. Wzrost związanego GFP-koroniny-1C bez utraty związanego GFP-RCC2 wskazuje na tworzenie kompleksu trójskładnikowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Protokół ten opisuje metodę porównywania względnego powinowactwa par małych białek wiążących GTPazę. Kluczowymi etapami są przygotowanie oczyszczonych białek wiążących GTPazę i ładowanie GTPazy nukleotydami. Zastosowanie białek wiążących GTPazę z tym samym znacznikiem GFP pozwala na dokładne określenie stężeń, przy których wiążą się podobne ilości każdego konkurenta. Zastosowanie rekombinowanej GTPazy obciążonej nukleotydami umożliwia zbadanie właściwości wiązania GTPazy w określonych warunkach aktywności. Ten etap jest również najbardziej wrażliwy, ponieważ nukleotydy będą zarówno hydrolizować, jak i odłączać się od GTPazy, jeśli warunki magnezu nie są precyzyjnie utrzymane.

W komórce duża liczba białek wiążących GTPazę w połączeniu z szybkim obrotem nukleotydów utrudnia interpretację takich szlaków. Prostota tej metody, polegająca na porównywaniu tylko par białek wiążących i stosowaniu starannie kontrolowanych warunków ładowania nukleotydów, pozwala na wyjaśnienie szlaków sygnałowych. Jednak największa siła protokołu jest jednocześnie największą słabością, ponieważ jest nim uproszczenie sytuacji in vivo . Testy konkurencji mogą być wykorzystane do zbudowania solidnej hipotezy, ale powinna ona być następnie przetestowana na komórkach za pomocą eksperymentów knockdown.

Istnieją trzy cechy, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze białek wiążących GTPazę znakowanych GFP, które mają być użyte w eksperymencie. Po pierwsze, białka fuzyjne muszą ulegać prawidłowej ekspresji w komórkach ssaków, takich jak HEK293T, ponieważ testy konkurencji wymagają rozsądnej ilości białka. Po drugie, musi istnieć możliwość oczyszczenia rekombinowanego białka bez znaczącej degradacji, a w przypadku gdy nie jest to możliwe, należy rozważyć klonowanie fragmentu wiążącego GTPazę. Po trzecie, dwa białka wiążące GTPazę muszą rozdzielić się od siebie na SDS-PAGE, aby umożliwić analizę w sekcji 6.

Istnieje kilka potencjalnych zastrzeżeń do eksperymentu, które należy wziąć pod uwagę i ewentualnie rozwiązać:

Możliwa denaturacja oczyszczonych białek wiążących GTPazę podczas etapu elucji kwasowej lub przeszkoda steryczna przez znacznik GFP. W naszych rękach nie stanowiły one problemu, ale muszą zostać przetestowane. Oczyszczone białka można badać w testach funkcjonalnych ¹⁰. Obecnie istnieją komercyjne zestawy do testowania aktywności GEF lub GAP bez konieczności stosowania nukleotydów znakowanych izotopowo. Białka sekwestracyjne, ze swojej natury, chronią GTPazy przed aktywnością GEF lub GAP, więc mogą być stosowane jako inhibitory konkurencyjne w komercyjnych testach GEF lub GAP, tak jak zrobiliśmy to w naszej ostatniej publikacji ⁷. Istotną cechą białek, które transportują GTPazę, jest zdolność do wiązania GTPazy, co można łatwo przetestować w teście ściąganym. Alternatywnym podejściem do badania integralności białka, które ma zastosowanie do wszystkich białek wiążących, jest miareczkowanie białka eluowanego z kulek pułapki GFP glicyną z tym samym białkiem usuniętym z kulek pułapki GFP przez rozszczepienie enzymatyczne. Eksperyment byłby analizowany poprzez sondowanie zarówno białka znakowanego GFP, jak i rozszczepionego przeciwciałem przeciwko samemu białku. Jeśli białko nie jest uszkodzone przez elucję, równowaga powinna być osiągnięta w stosunku 1:1. Podejście to wskazywałoby również, czy sama obecność znacznika GFP upośledza właściwości wiązania białka kandydującego, chociaż wymaga to wytworzenia konstruktu z enzymatycznym miejscem rozszczepienia między znacznikiem a białkiem wiążącym. Niezależnie od tego, czy białko jest zagrożone przez znacznik, czy przez etap elucji, problem można rozwiązać, modyfikując protokół w celu zastosowania alternatywnej metody oczyszczania. Zamiast GFP, białka wiążące mogą być znakowane His, oczyszczane za pomocą Ni-NTA i analizowane przy użyciu przeciwciała przeciwko znacznikowi His. Ważną cechą jest to, że oba białka wiążące muszą mieć wspólny znacznik, chociaż w razie potrzeby do białka można dodać dwa znaczniki, jeden do oczyszczania, a drugi do wykrywania.

Protokół został zaprojektowany do badania konkurencji między interakcjami z domenami przełącznika I/II. Chociaż większość interakcji GTPazy jest zapośredniczona przez ten motyw, istnieją pewne wyjątki, w szczególności interakcje GDI, które wiążą się z ogonem prenylowym, a także zasłaniają domeny przełączania. Zasadniczo protokół można dostosować do stosowania GTPazy oczyszczonej z komórek ssaków, tak aby GTPaza była prenylowana, jednak obecność wielu miejsc wiązania lub efekty allosteryczne komplikują interpretację danych wiążących konkurencję. Dalsze problemy związane z taką modyfikacją polegają na tym, że GDI oczyszczają się z komórek ssaków za pomocą GTPazy, co pogarsza czystość wyizolowanych białek, a hydrofobowy charakter grup prenylowych oznacza, że prenylowane GTPazy są związane z GDI lub błoną lipidową i takie czynniki musiałyby być brane pod uwagę w eksperymencie.

Ilość GST-Rac1 używana w teście. Stałe białko wiążące GTPazę musi mieć większe stężenie niż Rac1, w przeciwnym razie po dodaniu konkurenta po prostu zwiąże się z wolnym Rac1. Będzie natychmiast oczywiste, czy tak się stało, ponieważ wiązanie konkurenta, bez utraty stałego białka, zostanie wykryte w taki sam sposób, jak wtedy, gdy dwa konkurujące białka wiążą się ze sobą, jak pokazano na rysunku 3B. Jako dodatkową kontrolę (Krok 5.3) należy włączyć reakcję wiązania zawierającą dwukrotnie większą ilość białka wiążącego o stałym poziomie i brak białka wiążącego o zmiennej wartości (Krok 5.3). Jeśli Rac1 w eksperymencie miareczkowania jest nasycony, podwojenie ilości stałego białka wiążącego nie będzie miało wpływu na wyjście. Objętości sugerowane w protokole powinny być odpowiednie, ale ilość Rac1 można łatwo zmniejszyć. Jeśli zaobserwuje się wiązanie konkurenta bez utraty stałego partnera wiążącego, należy spróbować zmniejszyć ilość Rac1 przed próbą mapowania miejsc wiązania, aby uniknąć tworzenia się kompleksu trójskładnikowego.

Niespecyficzne oddziaływanie białek wiążących GTPazę z GST lub kulką, a także specyficznie z Rac1. Problem ten objawiałby się szczątkowym wiązaniem stałego białka wiążącego GTPazę, nawet jeśli zmienne białko wiążące GTPazę osiągnęło plateau przy wysokim stężeniu. Identyfikacja tego problemu będzie wspomagana przez przeprowadzenie wzajemnych eksperymentów, w których stałe i zmienne białka wiążące GTPazę są zamieniane. Eksperymenty wzajemne również znacznie poprawią dokładność oszacowania punktu równowagi, dlatego zawsze powinny być uwzględniane. W przypadku wiązania niespecyficznego, względne stężenia, przy których osiągana jest równowaga, można nadal obliczyć, porównując intensywność pasma między maksimami i minimami dla każdego białka lub mierząc zakres niespecyficznego wiązania przy użyciu kulek GST jako przynęty, a nie GST-Rac1.

W celu uzupełnienia testu konkurencji opisanego w niniejszym protokole należy zastosować testy pull-down wykorzystujące różne warunki obciążenia nukleotydami. Określenie preferencji nukleotydowych partnerów jest ważne zarówno dla zrozumienia wydarzeń związanych z konkurencją, jak i zrozumienia szlaku sygnałowego, w który zaangażowane jest białko wiążące GTPazę. Na rysunku 2B analizujemy wiązanie białek z ustaloną preferencją dla GTPazy załadowanej GTP lub wolnej od nukleotydów jako sposobu walidacji obciążenia nukleotydów. Rozsądne jest jednak zbadanie wpływu obciążenia nukleotydami na każdego z konkurentów. Jeśli hipotetyczni konkurenci wykazują różne preferencje, konkurencja będzie miała mniejszy wkład w szlak sygnałowy, a obrót nukleotydów prawdopodobnie będzie mechanizmem kierującym wymianą białek wiążących.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugbuster	Novagen	70584-3
COMPLETE inhibitor proteazy	Roche	05 056 489 001
Koraliki magnetyczne glutationu	Pierce	88821
Polietylenina, rozgałęziona, średnia Mw ~25,000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Bull Bull	Serum Life Technologies	10270-1-6
L-Glutamine	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	Wysoce niestabilny. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 natychmiast po rekonstrukcji
GTPγ S	Sigma Aldrich	G8634	Wysoce niestabilny. Porcję i przechowywać w temperaturze -80 natychmiast po ponownym roztworzeniu
Bufor blokujący	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Przeciwciało anty-GFP	Żywe kolory	632592	Stosować w rozcieńczeniu 1/1000
DyLight 800 sprzężone kozie przeciwciało anty-królicze	Fisher Scientific	10733944
Przeciwciało anty-PAK1	Sygnalizacja komórkowa	2602S	Użyj przy rozcieńczeniu 1/1000
System obrazowania w podczerwieni Odyssey SA	Li-cor	9260-11PC