Artykuł metodologiczny

Szybki fenotypowy system punktacji neurologicznej do oceny postępu choroby w mysim modelu SOD1-G93A ALS

DOI:

10.3791/53257

⸱

6 października 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1ALS Therapy Development Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wideo opisuje czułą, niezawodną i szybką metodę oceny deficytów nerwowo-mięśniowych w transgenicznym mysim modelu stwardnienia zanikowego bocznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgeniczna mysz SOD1-G93A jest najczęściej używanym zwierzęcym modelem stwardnienia zanikowego bocznego (ALS). W ALS TDI opracowaliśmy fenotypowy protokół przesiewowy, zademonstrowany na filmie wideo, który wiarygodnie ocenia funkcję nerwowo-mięśniową myszy SOD1-G93A w szybki sposób. Protokół ten obejmuje prosty neurologiczny system punktacji (NeuroScore) przeznaczony do oceny funkcji kończyn tylnych. NeuroScore koncentruje się na funkcji kończyn tylnych, ponieważ deficyty kończyn tylnych są najwcześniejszym zgłaszanym neurologicznym objawem choroby u myszy SOD1-G93A. Protokół opracowany przez ALS TDI zapewnia bezstronną ocenę wystąpienia niedowładu (lekkiego lub częściowego paraliżu), progresji i ciężkości paraliżu i jest wystarczająco czuły, aby zidentyfikować zmiany w progresji choroby wywołane przez leki. W tym raporcie połączenie szczegółowego manuskryptu z filmem minimalizuje niejasności punktacji i zmienność między eksperymentatorami, umożliwiając w ten sposób przyjęcie protokołu przez inne laboratoria i umożliwiając porównania między badaniami odbywającymi się w różnych warunkach. Wierzymy, że ten protokół wideo może służyć jako doskonałe narzędzie szkoleniowe dla obecnych i przyszłych badaczy ALS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu swojego rozwoju w połowie lat 90-tych, transgeniczny model myszy SOD1-G93A jest najczęściej używanym zwierzęcym modelem stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) 1. Ten transgeniczny model myszy został genetycznie zmodyfikowany w celu nadekspresji zmutowanej formy ludzkiego genu dysmutazy ponadtlenkowej Cu / Zn 1 (SOD1), który zawiera mutację glicyny do alaniny związaną z ALS w aminokwasie 93 (G93A). Mutacja G93A jest jedną z wielu mutacji w genie SOD1, które łącznie stanowią około jednej piątej rodzinnych przypadków ALS 2.

Model SOD1-G93A stał się koniem pociągowym w badaniach nad rozwojem leków na ALS, ponieważ oprócz oczywistego genetycznego powiązania z ALS, podsumowuje wiele patologicznych cech ALS u ludzi, takich jak utrata neuronów ruchowych, postępujące osłabienie i atrofia mięśni, z ostatecznym paraliżem i śmiercią 3. Chociaż, jak to często bywa w przypadku transgenicznych modeli zwierzęcych, istnieje nieodłączna zmienność biologiczna związana z myszami SOD1-G93A. Scott i wsp. ustalili, że kohorty co najmniej 24 myszy dopasowanych do miotu, zrównoważonych płciowo są potrzebne w projektach badań skuteczności leków w celu przezwyciężenia szumu wytwarzanego przez zmienność biologiczną 4. Duża liczba zwierząt wymagana w tych badaniach w połączeniu z agresywnym postępem choroby i potrzebą codziennego monitorowania uniemożliwia stosowanie skomplikowanych, czasochłonnych i potencjalnie stresujących technik pomiaru siły i funkcji nerwowo-mięśniowych (np. elektromiografia, siła chwytu, wirnik itp.). Zamiast tego podkreśla potrzebę narzędzia do badań przesiewowych in vivo, które w wiarygodny sposób ocenia funkcję nerwowo-mięśniową myszy SOD1-G93A w szybki sposób.

W ALS TDI opracowano protokół, który pozwala na wiarygodną ocenę funkcji nerwowo-mięśniowej myszy SOD1-G93A średnio w czasie krótszym niż 30 sekund na mysz. Protokół ten obejmuje codzienną ocenę funkcji kończyn tylnych przy użyciu prostego systemu punktacji neurologicznej (NeuroScore), który został opisany w niniejszym raporcie w prasie i na wideo. NeuroScore koncentruje się na funkcji kończyn tylnych, ponieważ deficyty kończyn tylnych są najwcześniejszym zgłaszanym neurologicznym objawem choroby u myszy SOD1-G93A 5,6. Co więcej, protokół opracowany przez ALS TDI zapewnia bezstronną ocenę wystąpienia niedowładu (lekkiego lub częściowego paraliżu), progresji i ciężkości paraliżu i jest wystarczająco czuły, aby zidentyfikować zmiany w progresji choroby wywołane przez leki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z protokołami opisanymi przez National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Animals i zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt ALS TDI (IACUC).

1. Zwierzęta, budynki mieszkalne i projektowanie badań

Uwaga: Kolonia myszy SOD1-G93A została wyprowadzona ze szczepu B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur o wysokiej kopii, pierwotnie wyprodukowanego przez Gurney et al. 7. Kolonia jest obecnie utrzymywana poprzez krzyżowanie transgenicznych samców C57BL/6-SJL z samicami C57BL/6-SJL F1 typu dzikiego. Zwierzęta F1 są generowane przez krzyżowanie samców SJL z samicami B6. Myszy są wysyłane do ALS TDI co tydzień w wieku 35–45 dni.

  1. Pozwól myszom na co najmniej tydzień na aklimatyzację w obiekcie dla zwierząt (12-godzinny cykl światła/ciemności w temperaturze 18-23 °C i wilgotności 40-60%) przed przypisaniem do badania.
  2. Samce myszy domowych SOD1-G93A po jednej myszy na klatkę, ponieważ samce trzymane w grupie mają tendencję do walki. Trzymaj samice myszy SOD1-G93A do dwóch na klatkę. Zapewnij wzbogacenie środowiska w postaci plastikowych chat. Dostarczaj jedzenie i wodę ad libitum, chyba że myszy biorą udział w badaniu wymagającym podawania leku w wodzie pitnej/pożywieniu. W takich przypadkach racjonuj i rejestruj jedzenie i wodę.
  3. Rozpocznij badanie skuteczności leku około 50 dnia życia i włącz 64 myszy dopasowane do miotu o zrównoważonej płci (32 na kohortę). Na koniec upewnij się, że badacze prowadzący badania są ślepi na warunki eksperymentalne.
    Uwaga: Zaleca się, aby typowe badanie skuteczności leku rozpoczęło się w wieku 50 lat, jednak w zależności od rodzaju interwencji terapeutycznej preferowane może być rozpoczęcie badania wcześniej lub później.
    Uwaga: Badanie z udziałem 32 myszy na kohortę ma na celu wykrycie efektów leków specyficznych dla płci. Jeśli nie są wymagane porównania specyficzne dla płci, 24 myszy na kohortę powinny wystarczyć do wykrycia ogólnego działania leku.

2. Masa ciała

  1. Rejestruj masę ciała wszystkich myszy w badaniach codziennie z dokładnością do jednej dziesiątej grama. Uwaga: Masa ciała jest czułym wskaźnikiem postępu choroby i wszelkich złych spraw, które mogą wynikać z przewlekłego leczenia farmakologicznego.
  2. Waga ciała myszy zmienia się znacznie w ciągu dnia, jest wyższa rano, dlatego rejestruj je mniej więcej o tej samej porze każdego dnia.

3. System punktacji neurologicznej (NeuroScore)

  1. Oceń wyniki neurologiczne (NS) dla każdej myszy dziennie, obserwując mysz w następujących trzech warunkach wykonywanych sekwencyjnie: a) mysz jest zawieszona za ogon, b) mysz może chodzić, a po wystąpieniu niedowładu c) mysz kładzie się na boku.
    1. W teście zawieszenia ogona trzymaj mysz około 1.5 cala od podstawy ogona nad drucianą górną częścią klatki domowej przez 1-2 sekundy, z dala od miski z jedzeniem, obserwując tylne kończyny. Powtórz test zawieszenia 3 razy i zapisz najbardziej spójny wynik.
    2. W teście chodzenia umieść mysz na czystej powierzchni, która zapewnia przyczepność i odległość spaceru 25 cm (np. ręcznik papierowy przyklejony taśmą, aby zapobiec poślizgnięciu się). Pozwól myszy przejść łącznie 75 cm (3 razy więcej niż długość ręcznika papierowego), obserwując jej chód.
    3. W teście "odruchu prostego" umieść mysz po jej lewej lub prawej stronie i za pomocą stopera zmierz czas potrzebny na samodzielne wyprostowanie się z obu stron. Uwaga: Wymagana jest tylko jedna próba tego testu.
  2. Określ NS każdej kończyny tylnej (lewej lub prawej) niezależnie w skali od 0 do 4. Uwaga: Na przykład wynik 0, 1 wskazuje, że lewa tylna kończyna NS wynosi 0, podczas gdy prawa tylna kończyna NS wynosi 1.
  3. Przypisz wyniki neurologiczne (0-4) odpowiadające następującemu zestawowi obserwacji (podsumowanie zamieszczone w Tabeli 1):
    1. Przypisz NS 0 (przedobjawowy), jeśli zaobserwowane są następujące objawy: Gdy mysz jest zawieszona za ogon, tylna kończyna wykazuje normalne rozchylenie, tj. jest całkowicie wysunięta od bocznej linii środkowej i pozostaje w tej pozycji przez 2 sekundy lub dłużej. Kiedy mysz może chodzić, obserwuje się normalny chód.
    2. Przypisz NS 1 (pierwsze objawy), jeśli zaobserwowane są następujące objawy: Gdy mysz jest zawieszona za ogon, tylna kończyna wykazuje nieprawidłowe rozchylenie, tj. jest zapadnięta lub częściowo zapadnięta w kierunku bocznej linii środkowej LUB drży podczas zawieszenia ogona LUB jest schowana/zaciśnięta. Kiedy mysz może chodzić, obserwuje się normalny LUB nieco powolny chód.
    3. Przypisz NS 2 (Początek niedowładu), jeśli zaobserwowane są następujące objawy: Gdy mysz jest zawieszona za ogon, tylna kończyna jest częściowo LUB całkowicie zapadnięta, nie rozciągając się zbytnio. (Nadal może występować ruch stawów). Kiedy mysz może chodzić, tylna kończyna jest używana do ruchu do przodu, jednak palce u nóg zwijają się w dół co najmniej dwa razy podczas marszu 90 cm LUB dowolna część stopy ciągnie się po dnie klatki/stole. Gdy mysz zostanie umieszczona po lewej i prawej stronie, jest w stanie wyprostować się w ciągu 10 sekund z OBU stron.
    4. Przypisz NS 3 (paraliż), jeśli zaobserwowane są następujące warunki: Gdy mysz jest zawieszona za ogon, występuje sztywny paraliż kończyny tylnej LUB minimalny ruch stawu. Kiedy mysz może chodzić, następuje ruch do przodu, jednak tylna kończyna NIE jest używana do ruchu do przodu. Gdy mysz zostanie umieszczona po lewej i prawej stronie, jest w stanie wyprostować się w ciągu 10 sekund z OBU stron. Uwaga: Rzadko, po wystąpieniu paraliżu, wilgoć z moczu może pojawić się na kończynach tylnych. Nieleczona wilgoć z moczu może spowodować "oparzenia" moczu i zmiany skórne. Usuń wilgoć z moczu, przycinając włosy, Nałóż ciepłą wodę, aby usunąć mocz i delikatnie osusz. W przypadku wystąpienia zmian skórnych należy zastosować maść z antybiotykiem.
    5. Przypisz NS 4 (Humanitarny punkt końcowy), jeśli zaobserwowane są następujące warunki: Kiedy mysz jest zawieszona za ogon, dochodzi do sztywnego paraliżu kończyn tylnych. Kiedy mysz może chodzić, nie ma ruchu do przodu. Gdy mysz jest umieszczona po lewej i prawej stronie, NIE jest w stanie wyprostować się w ciągu 10 sekund z ŻADNEJ strony. tj. brak odruchu prostowania.

4. Wprowadzanie i analiza danych

  1. W trakcie badania skuteczności leku należy wprowadzić dane zebrane dla każdej myszy do systemu zarządzania informacjami laboratoryjnymi (LIMS) lub do dostępnego na rynku arkusza kalkulacyjnego.
    Uwaga: Opracowane przez ALS TDI oprogramowanie LIMS jest centralnym repozytorium wszystkich danych zebranych z badań wewnętrznych, dzięki czemu dane te są wygodnie dostępne w czasie dla badaczy ALS TDI. LIMS śledzi każdą pojedynczą mysz, z jej unikalnym identyfikatorem, z powrotem do jej rodowodu, masy ciała lub wyniku neurologicznego we wszystkich dniach badania i uwzględnia wszelkie inne obserwacje odnotowane podczas jej życia. LIMS finalnie generuje arkusz kalkulacyjny, który jest wykorzystywany do kolejnych analiz.
  2. Po zakończeniu badania skuteczności leku, tj. gdy wszystkie myszy osiągną humanitarny punkt końcowy, użyj oprogramowania arkusza kalkulacyjnego (patrz tabela materiałów), aby obliczyć łączną wartość NS dla każdej myszy, dla każdego dnia, uśredniając NS lewej i prawej kończyny tylnej. Następnie oblicz medianę wieku dla każdej myszy NS dla każdej myszy i liczbę dni, które każda mysz spędza w określonej NS.
  3. Analizuj ogólne zmiany w NS w czasie, importując dane z arkusza kalkulacyjnego do oprogramowania statystycznego (patrz Tabela materiałów). Dopasuj te dane za pomocą modelu porządkowej regresji logistycznej, który szacuje oczekiwany NS, z medianą wieku w NS i leczeniem farmakologicznym jako efektami regresji. Korzystając z testu logarytmicznego chi kwadrat, oszacuj prawdopodobieństwo wystąpienia efektu i określ, czy wpływ leczenia lekiem na progresję NS jest statystycznie istotny (patrz Plik kodu uzupełniającego, aby uzyskać instrukcje krok po kroku).
    Uwaga: Wartość p <0,05 jest uważana za statystycznie istotną.
    Uwaga: Ta metoda analizy statystycznej uwzględnia porządkowy charakter danych NS i zmienny charakter trajektorii NS dla poszczególnych myszy. Jest to preferowane, ponieważ indywidualne trajektorie NS mogą się znacznie różnić, co skutkuje średnimi grupowymi związanymi z czasem NS, które nie odzwierciedlają wystarczająco odpowiedzi NS. Ponadto w niektórych przypadkach NS może ulegać wahaniom, szczególnie w zakresie od zera do jednego.
  4. Na koniec użyj oprogramowania do tworzenia wykresów (patrz Spis materiałów), aby wygenerować wykresy "Ordinal Expected NS vs Mediana Age at NS" dla zwierząt leczonych narkotykami i kontrolnych (Rysunek 2; patrz Plik kodu uzupełniającego, aby uzyskać instrukcje krok po kroku). Użyj tych wykresów, aby wygodnie oszacować przesunięcia między grupami leczonymi farmakologicznie a grupą kontrolną poprzez interpolację z osi y mediany wieku wystąpienia choroby (tj. NS 2) na osi x.
    Uwaga: Różnica w medianie wieku między obiema grupami reprezentuje zmianę wywołaną przez lek i jest traktowana jako praktyczna miara wielkości efektu.
    Uwaga: Przesunięcia w prawo w oczekiwanej krzywej NS w stosunku do mediany wieku wskazują na spowolniony objawowy postęp choroby. I odwrotnie, przesunięcia w lewo w oczekiwanej krzywej NS w stosunku do mediany wieku wskazują na przyspieszoną objawową progresję choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oceniono dane neurologiczne dla 90 samców i 94 samic nieleczonych myszy SOD1-G93A badanych w ALS TDI w 2014 roku. Wyniki pokazują, że samce myszy mają zazwyczaj bardziej agresywny postęp choroby niż samice, o czym świadczy większa część ich długości życia przy NS 1 w porównaniu z samicami. NS 2 i NS 3 występują praktycznie z równą częstością u wszystkich płci. NS 0 został wykluczony z analizy, ponieważ jest uważany za "normalny" fenotyp. NS 4 został również wykluczony, ponieważ z definicji może wystąpić tylko raz w życiu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym raporcie opisujemy szybki i prosty protokół wideo, który, jeśli jest odpowiednio zastosowany, jest w stanie wiarygodnie ocenić postęp choroby u myszy SOD1-G93A i zidentyfikować zmiany wywołane lekiem. Chociaż różne grupy opracowały fenotypowe systemy punktacji dla myszy SOD1-G93A 8-10, często nie dostarczają one wystarczających szczegółów na temat procedury i są nieodpowiednie do replikacji. W związku z tym systemy scoringowe są rzadko stosowane poza konkretną grupą, która je rozwija. W tym raporcie połą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Beth Levine za krytyczną recenzję rękopisu, Valerie Tassinari za opracowanie protokołu genotypowania, oraz Mattowi Feroli i Carlosowi Mayi za wyjątkową opiekę nad zwierzętami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczep B6SJLTgN(SOD1G93A)1GurLaboratorium Jacksona, Bar Harbor, ME002726Szczep myszy wykorzystany w tym badaniu
BreedersBiomedical Research Models, Inc., Worcester, MAUtrzymanie kolonii
Scale Navigator OHAUS, Parsippany, NJModel N14120Służy do ważenia myszy
Nutra-GelHBio-Serv, Flemington, NJKarma mokra dostarczane chorym myszom
Napromieniowana dieta dla zwierząt laboratoryjnychHarlan, Indianapolis, IN2918-111914MDieta Chow
Lab-grade Sani-chipsHarlan Teklad, Indianapolis, IN7090Pościel
JMPH SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, Karolina Północna  v10.0.2Oprogramowanie statystyczne
Microsoft ExcelMicrosoft, One Microsoft Way, Redmond, WAExcel 2013 (v 15.0)Oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych
GraphPad Prism 5GraphPad software Inc., La Jolla, CAv5.4Oprogramowanie do tworzenia wykresów
Mouse HutsBio-Serv, Flemington, NJK3272Do wzbogacania środowiska
#S4798

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
  2. Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
  3. Gurney, M. E. The use of transgenic mouse models of amyotrophic lateral sclerosis in preclinical drug studies. J Neurol Sci. 152, Suppl. 1 (6415), (1997).
  4. Scott, S., et al. Design, power, and interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
  5. Hegedus, J., Putman, C. T., Gordon, T. Time course of preferential motor unit loss in the SOD1 G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol. Dis. 28 (2), 154-164 (2007).
  6. Gordon, T., Ly, V., Hegedus, J., Tyreman, N. Early detection of denervated muscle fibers in hindlimb muscles after sciatic nerve transection in wild type mice and in the G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurol. Res. 31 (1), 28-42 (2009).
  7. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
  8. Kim, K., Moore, D. H., Makriyannis, A., Abood, M. E. AM1241, a cannabinoid CB2 receptor selective compound, delays disease progression in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur. J. Pharmacol. 542 (1-3), 1-3 (2006).
  9. Weydt, P., Hong, S. Y., Kliot, M., Moller, T. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
  10. Azari, M. F., et al. Behavioural and anatomical effects of systemically administered leukemia inhibitory factor in the SOD1(G93A G1H) mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain Res. 982 (1), 92-97 (2003).
  11. Guan, Y., et al. Thiazolidinediones expand body fluid volume through PPARgamma stimulation of ENaC-mediated renal salt absorption. Nat. Med. 11 (8), 861-866 (2005).
  12. Savcheniuk, O. A., et al. The effect of probiotic therapy on development of experimental obesity in rats caused by monosodium glutamate. Fiziol. Zh. 60 (2), 63-69 (2014).
  13. Smittkamp, S. E., Brown, J. W., Stanford, J. A. Time-course and characterization of orolingual motor deficits in B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J mice. Neuroscience. 151 (2), 613-621 (2008).
  14. C, M., Gurney, M. E. A low expressor line of transgenic mice carrying a mutant human Cu,Zn superoxide dismutase (SOD1) gene develops pathological changes that most closely resemble those in human amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol. 93 (6), 537-550 (1997).
  15. Wegorzewska, I., Baloh, R. H. TDP-43-based animal models of neurodegeneration: new insights into ALS pathology and pathophysiology. Neurodegener. Dis. 8 (4), 262-274 (2011).
  16. Hatzipetros, T., et al. C57BL/6J congenic Prp-TDP43A315T mice develop progressive neurodegeneration in the myenteric plexus of the colon without exhibiting key features of ALS. Brain Res. 1584, 59-72 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ocena funkcji ko czyn tylnychtest zawieszenia ogonaanaliza chodutest odruchu pisaniaporz dkowa regresja logistycznaocena progresji chorobyprzesiew interwencji terapeutycznychpunkty przej cia fenotypowego

Powiązane artykuły