Hodowla pionowych kropelek ex vivo jest alternatywą dla obecnych technik eksperymentalnych in vitro i in vivo. Protokół ten jest łatwy do wykonania i wymaga mniejszych ilości odczynnika, a jednocześnie umożliwia manipulowanie i badanie unaczynienia, morfogenezy i organogenezy płodu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie ex vivo pionowych kultur kropelkowych całych narządów płodu do badania procesów rozwojowych podczas organogenezy myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie organogenezy w macicy jest technicznie trudnym procesem u ssaków łożyskowych ze względu na niedostępność odczynników do zarodków, które rozwijają się w macicy. Nowo opracowana metoda hodowli kropelkowej ex vivo w pozycji pionowej stanowi atrakcyjną alternatywę dla badań prowadzonych w macicy. Hodowla kropelkowa ex vivo zapewnia możliwość badania i manipulowania interakcjami komórkowymi i różnymi szlakami sygnałowymi poprzez zastosowanie różnych związków blokujących i aktywujących; Dodatkowo można badać wpływ różnych odczynników farmakologicznych na rozwój określonych narządów bez niepożądanych skutków ubocznych ogólnoustrojowego dostarczania leków w macicy. W porównaniu z innymi systemami in vitro, hodowla kropelkowa nie tylko pozwala na badanie trójwymiarowej morfogenezy i interakcji komórka-komórka, których nie można odtworzyć w liniach komórkowych ssaków, ale także wymaga znacznie mniej odczynników niż inne protokoły ex vivo i in vitro. W artykule przedstawiono prawidłowe techniki preparacji narządów płodu myszy i hodowli pionowych kropel, a następnie immunofluorescencji całego narządu w celu wykazania skuteczności metody. Metoda hodowli kropelkowej ex vivo pozwala na wytworzenie architektury narządów porównywalnej z tym, co obserwuje się in vivo i może być wykorzystana do badania procesów trudnych do zbadania ze względu na śmiertelność zarodków w modelach in vivo. Jako modelowy system aplikacji, małocząsteczkowy inhibitor zostanie wykorzystany do zbadania roli unaczynienia w morfogenezie jąder. Ta metoda hodowli kropelkowej ex vivo może zostać rozszerzona na inne układy narządów płodu, takie jak płuca i potencjalnie inne, chociaż każdy narząd musi zostać dokładnie przebadany w celu określenia wszelkich specyficznych dla narządu modyfikacji protokołu. Ten system hodowli narządów zapewnia elastyczność w eksperymentowaniu z narządami płodu, a wyniki uzyskane przy użyciu tej techniki pomogą naukowcom uzyskać wgląd w rozwój płodu.
Wprowadzenie
Regeneracja organów in vivo u ludzi jest bardzo ograniczona; dlatego inżynieria tkankowa, czyli rozwój tkanek i organów z pojedynczych komórek oddanych przez gospodarza, staje się atrakcyjną potencjalną terapią dla wymiany narządów. Jednak, aby ta strategia terapeutyczna była skuteczna, czynniki i interakcje komórkowe zaangażowane w morfogenezę narządu muszą być dokładnie zbadane i dobrze zrozumiane. Ze względu na brak możliwości badania rozwoju konkretnych narządów przy użyciu tradycyjnych metod, naukowcy zwrócili się ku alternatywnym hodowlom całych zarodków lub całych narządów. Kalaskar i wsp.1 wykazały, że hodowla całej embriogenezy ex vivo daje porównywalne wyniki (w 58% hodowanych zarodków) do rozwoju in utero, co sugeruje, że metody hodowli ex vivo są wykonalną alternatywą dla badań organogenezy.
Zindywidualizowany system hodowli narządów, taki jak ten system hodowli kropelkowej ex vivo, pozwala na analizę całego narządu niezależnie od efektów ogólnoustrojowych, jednocześnie umożliwiając manipulowanie specyficznym szlakiem sygnałowym lub interakcjami komórkowymi poprzez dodawanie odczynników farmakologicznych lub przeciwciał. Tradycyjnie, badania nad rozwojem narządów płodu ograniczały się do technologii transgenicznych i nokautujących myszy, a także do odczynników farmakologicznych podawanych matce. Istnieją jednak kwestie techniczne związane z tymi technikami i zabiegami in vivo; Większość obaw dotyczy skutków jednoczesnego wpływania na różne narządy, co często prowadzi do śmiertelności embrionalnej. Dodatkowym problemem związanym z badaniami manipulującymi rozwojem płodu w sposób farmakologiczny jest matczyny wpływ leków na rozwój embrionalny w macicy (np. matczyny metabolizm leku przed dotarciem do zarodka) oraz to, czy takie odczynniki mogą przenikać przez barierę łożyskową.
Cała technika hodowli organów opisana tutaj została zaadaptowana z protokołu opisanego po raz pierwszy przez Maatouka i wsp. 2, w których całe gonady płodowe są inkubowane w pionowych kulturach kropelkowych ex vivo. Jedną z istotnych zalet hodowli gonad płodowych jest to, że inhibitory drobnocząsteczkowe mogą łatwo dostać się do całego narządu poprzez prostą dyfuzję. DeFalco i in. wykazali, że wykorzystanie tej metody hodowli kropelkowej ex vivo w połączeniu z inhibitorami małocząsteczkowymi może być wykorzystane do badania procesów sygnałowych i interakcji zachodzących podczas rozwoju gonad3; Procesy te byłyby trudne do zbadania in vivo ze względu na wyzwania techniczne (np. przenikanie leków przez łożysko lub śmiertelność oddziaływania na wiele narządów przy użyciu metod genetycznych lub farmakologicznych).
Hodowla kropelkowa to nie tylko poprawa w pewnych aspektach w porównaniu z eksperymentami in utero, ale także poprawa w stosunku do systemów in vitro i ex vivo. Wykorzystanie linii komórkowych do badania morfogenezy jest niezwykle trudne, ponieważ brakuje im różnorodnych typów komórek, brakuje krytycznych składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które umożliwiają tworzenie architektury narządów, i mogą wykazywać artefakty w kaskadach sygnałowych. Chociaż inżynieria tkankowa poczyniła znaczne postępy w tworzeniu rusztowań symulujących ECM, brak wiedzy na temat tego, jakie sygnały są wymagane przez każdy typ komórki podczas organogenezy, utrudnia zbudowanie systemu narządów in vitro. Inne systemy ex vivo zostały wcześniej stworzone do badania organogenezy, a dokładniej morfogenezy, i odniosły duży sukces w obrazowaniu na żywo narządów płodu w agarze4, transwellach5, filtrach6 i innych matrycach rusztowań7,8. Zaletą systemu hodowli kropelkowej jest to, że umożliwia badanie morfogenezy, zapewniając możliwość wykorzystania mniejszej ilości odczynników, które często są drogie, ale także nadając narządowi napięcie powierzchniowe, które jest ważne dla wzrostu i zdolności sygnalizacyjnych9.
U myszy początkowa morfogeneza jądra zachodzi między etapami embrionalnymi (E) E11.5 i E13.5; etapy te stanowią optymalne okno czasowe do badania czynników wpływających na różnicowanie płciowe. Do krytycznych procesów zachodzących podczas tworzenia jąder należy generowanie architektury rdzenia jądrowego i tworzenie sieci naczyniowej specyficznej dla jądra. Wykorzystując ten system hodowli kropelkowej całego narządu ex vivo, można zmienić unaczynienie specyficzne dla mężczyzn i zahamować morfogenezę jąder poprzez zastosowanie małocząsteczkowego inhibitora, który blokuje aktywność receptorów czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF); Przebudowa naczyń krwionośnych za pośrednictwem VEGF ma kluczowe znaczenie dla rozwoju jąder10-12. Technika ta może być z powodzeniem stosowana do innych narządów i może być ukierunkowana na określone okna czasowe rozwoju. Obrazowanie całych narządów pozwala na wizualizację ważnych struktur oraz zmian strukturalnych i komórkowych wynikających z podawania różnych inhibitorów. Co ważne, system ten jest korzystny, ponieważ badacz może ominąć potencjalne zakłócające skutki podawania leków przez matkę lub zakłócenia ogólnoustrojowe podczas ukierunkowanych strategii genowych in vivo. W ten sposób ten cały system hodowli kropelkowej ex vivo może znacznie poprawić zdolność rozumienia interakcji i sygnalizacji, które zachodzą specyficznie w poszczególnych narządach podczas rozwoju płodu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie myszy użyte w tych badaniach były myszami CD-1 uzyskanymi z Charles River Laboratories. Wcześniejsze eksperymenty z hodowlami przeprowadzono również na innych szczepach, takich jak C57BL/6J (dane nie pokazane), ale można użyć dowolnego szczepu. Ciężarne dorosłe samice miały około 2-3 miesięcy i zostały poddane eutanazji poprzez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy i obustronną torakotomię przed usunięciem zarodka. Myszy były trzymane zgodnie z wytycznymi NIH, a protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Centrum Medycznym Szpitala Dziecięcego w Cincinnati.
1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw
- Przygotuj 70% roztwór etanolu. Autoklaw: woda dejonizowana (do sporządzania komór nawilżanych oraz do sporządzania/rozcieńczania roztworów). Wysterylizuj narzędzia preparacyjne (kleszcze, nożyczki i strzykawki igłowe 27 G), spryskując je 70% etanolem.
- Przygotować 10 razy sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą wapń i magnez (80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, 6,75 ml 1 M CaCl2, 3,75 ml 1 M MgCl2). Mieszać do rozpuszczenia w 1 l sterylnej wody w autoklawie, a następnie przefiltrować bibułą filtracyjną. Rozcieńczyć 10-krotnie wodą, aby uzyskać 1X PBS.
- Podgrzewać inaktywowaną płodową surowicę bydlęcą (FBS) w temperaturze 55 °C przez 30 minut i sterylizować filtrem za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
- Przygotować 38 ml 1X kompletnej pożywki hodowlanej (zwanej kompletnym DMEM, cDMEM), składającej się z Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% przefiltrowanego FBS inaktywowanego termicznie i 1/100 rozcieńczenia bulionu penicylina-streptomycyna. Zwykle należy go używać na świeżo, ale można go przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
- Rozpuść inhibitor kinazy tyrozynowej VEGFR II (TKI II) w DMSO dla stężenia podstawowego 5 mg/ml i rozcieńczyć go cDMEM, aby uzyskać roztwór roboczy. Końcowe stężenie dla tego badania wynosi 1,875 μg/ml w cDMEM. Zgodnie z zaleceniami firmy, roztwory podstawowe są stabilne do 6 miesięcy w temperaturze -20 °C. Jeśli chodzi o roztwory robocze, przygotuj świeże i użyj tego samego dnia.
Uwaga: Stężenie tego leku w roztworze roboczym powinno być dwukrotnie wyższe niż pożądane stężenie końcowe (ponieważ zostanie on dwukrotnie rozcieńczony w kropli). W tym samym czasie należy przygotować tę samą objętość cDMEM zawierającą tę samą objętość DMSO do leczenia "kontrolnego". - Odczynniki do trawienia ogona (50 mM NaOH i 1 M Tris-HCl [pH 8,0]) przygotować oddzielnie w wodzie destylowanej.
- Zrób zapas 25 μM starterów XY PCR (XY Forward 5'-TGA AGC, TTT TGG, CTT TGA G-3' i XY Reverse 5'-CCG CTG, CCA, AAT, TTTG, G-3') razem w wodzie wolnej od nukleaz.
- Przygotuj 50 razy więcej niż tae bufor (242 g zasady Trizma, 57,1 ml lodowatego kwasu octowego, 100 ml 0,5 M EDTA, pH 8,5 i dodaj wodę do 1 l końcowej objętości). Przygotuj 1X bufor do biegania TAE (20 ml 50X TAE rozcieńczony wodą do 1 l całkowitej objętości).
- Aby uzyskać 2,5% roztwór agarozy (0,625 g agarozy, 0,5 ml buforu 50X TAE, 24,5 ml wody), podgrzej roztwór agarozy w kuchence mikrofalowej do wrzenia, a następnie pozostaw do ostygnięcia do około 55-65 °C (w dotyku). Po ostygnięciu dodać 2 μl 1% roztworu bromku etydyny i wlać żel.
OSTROŻNOŚĆ! Bromek etydyny jest mutagenem i teratogenem; Podczas obsługi należy używać rękawic nitrylowych i przestrzegać odpowiedniego protokołu bezpieczeństwa. Alternatywnie można zastosować inne potencjalnie mniej toksyczne środki rozpuszczające żele lub barwniki. - Przygotuj roztwór blokujący (PBS z 0,1% Triton X-100, 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS] i 3% albuminą surowicy bydlęcej [BSA]) do immunofluorescencji.
- Przygotuj roztwór myjący (PBS z 0,1% Triton X-100, 1% FBS i 3% BSA) do immunofluorescencji.
- Przygotuj PBTx (PBS z 0,1% Triton X-100) do immunofluorescencji.
- Przygotuj komory inkubacyjne do hodowli. Napełnij duże (100 mm średnicy) szalki Petriego 35 ml autoklawowanej wody. Miejsce w pobliżu, w którym zostanie przeprowadzona sekcja i posiewy.
2. Izolacja jąder płodu od Mus musculus
- Każdego ranka sprawdzaj, czy u samicy myszy nie ma zatyczek dopochwowych. Południe w dniu, w którym wykryto czop dopochwowy, uważa się za E0,5. Poddaj eutanazji ciężarną samicę myszy w E11.5 w sposób zgodny z zatwierdzonymi protokołami dla zwierząt.
- Spryskaj brzuch myszy 70% etanolem.
- Otwórz skórę brzucha i otrzewnej z nacięciem w kształcie litery V za pomocą cienkich nożyczek i odciągnij płat tkanki, aby odsłonić narządy wewnętrzne.
- Zlokalizuj jajniki na obu końcach rogu macicy. Za pomocą nożyczek przeciąć jajnik i tkankę łączną, aby oddzielić macicę zawierającą zarodki od ciała matki.
- Otwórz ścianę macicy, delikatnie przecinając stronę przeciwną do łożyska, odsłaniając woreczki żółtkowe. Uważaj, aby nie przebić woreczka żółtkowego, aby uniknąć uszkodzenia lub utraty zarodków.
- Przeciąć w pobliżu łożyska, aby usunąć woreczki żółtkowe zawierające zarodki i umieścić je w naczyniu zawierającym PBS z wapniem i magnezem. Obecność jonów wapnia i magnezu pomoże wspomóc cząsteczki adhezyjne komórek w celu utrzymania architektury tkanek i zapobieżenia przywieraniu tkanki do narzędzi preparacyjnych.
- Za pomocą kleszczy usuń woreczek żółtkowy i owodnię z zarodka, ostrożnie nakłuwając woreczek żółtkowy, aby utworzyć otwór, w którym zarodek może się wysunąć. Gdy zarodek znajdzie się poza woreczkiem żółtkowym, przetnij pępowinę.
- Od tego momentu należy używać mikroskopu umieszczonego w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych. Usuń głowę zarodka i wyrzuć, ściskając kleszczami po obu stronach szyi.
- Usuń ogon i umieść go w nowej probówce do mikrowirówki w celu analizy XY PCR w celu określenia płci zarodka.
Uwaga: Chociaż optymalna jest hodowla gonad tak szybko, jak to możliwe po zbiorach, możliwe jest również usunięcie DNA ogona i przeprowadzenie genotypowania XX/XY przed hodowlą, tak aby płeć każdego zarodka była znana i konieczna była tylko pożądana płeć. Podczas wykonywania genotypowania zarodki mogą być przechowywane oddzielnie (aby można było je śledzić) w temperaturze 4 °C lub na lodzie do czasu, aż będą gotowe do hodowli. Jednym zastrzeżeniem jest to, że ten okres na zewnątrz w warunkach życia płodowego lub hodowli może potencjalnie wpływać na żywotność hodowli lub późniejszy rozwój podczas hodowli. - Przymocuj zarodek w pozycji leżącej na plecach do dna naczynia hodowlanego, przytrzymując pachy zarodka jedną parą kleszczy (zwykle kleszczy trzymanych w słabej ręce). Utrzymuj te kleszcze na miejscu, aby utrzymać zarodek nieruchomo podczas całego procesu preparacji.
- Za pomocą drugiej pary kleszczy usuń skórę pokrywającą brzuch i delikatnie usuń wątrobę, jelita i inne narządy, aby odsłonić tylną ścianę ciała.
- Ponieważ gonady będą znajdować się na tylnej ścianie ciała po obu stronach aorty grzbietowej, dużego naczynia krwionośnego biegnącego wzdłuż linii środkowej ciała, zgarnij pod grzbiet moczowo-płciowy za pomocą zamkniętych kleszczy i usuń grzbiet moczowo-płciowy, otwierając kleszcze i podnosząc do góry. Ponieważ gonady będą luźno przymocowane do ściany, należy uważać, aby nie podciągnąć się zbyt szybko bez usunięcia tych połączeń, w przeciwnym razie gonady mogą się rozciągnąć, powodując uszkodzenie narządów.
- Przenieś grzbiet moczowo-płciowy do cDMEM w naczyniu, aby zaaklimatyzować tkankę do podłoża.
- Oddziel kompleks gonad-mesonephros od reszty grzbietu moczowo-płciowego za pomocą igieł 27 G. Użyj jednej igły do cięcia, dociskając, a drugiej użyj do prawidłowego prowadzenia tkanki, aby umożliwić optymalną separację. Unikaj używania ruchu piłowania na dnie naczynia, ponieważ ostre igły stworzą odłamki plastiku, które mogą przykleić się do tkanki. Upewnij się, że mesonephros jest całkowicie przyczepiony do gonady.
3. Hodowla gonad za pomocą inhibitora drobnocząsteczkowego
- Ustaw dwie pipety o pojemności 20 μl na 15 μl każda. Odetnij około 1-2 mm od jednej z końcówek pipet barierowych za pomocą czystej, wysterylizowanej żyletki do przenoszenia gonad i dodawania kontrolnego cDMEM, podczas gdy druga pipeta będzie używana wyłącznie do cDMEM leczonego lekiem.
- Ułóż gonady tak, aby ich długa oś była równoległa do końcówki pipety, aby można je było łatwo pipetować za pomocą końcówki odcinającej. Uważaj, aby gonady nie przykleiły się do wewnętrznej strony końcówki pipety.
- Oznaczyć jedną stronę jako kroplę kontrolną, a drugą jako kroplę zawierającą lek. Tylko dwie kropelki mogą zmieścić się na pokrywie naczynia o średnicy 35 mm. Upewnij się, że etykiety na pokrywkach są zgodne z etykietami na probówkach do mikrowirówek zawierających tkankę ogonową.
- Odpipetować 15 μl cDMEM zawierającego pojedynczą gonadę do kropelki w pokrywie małego (35 mm) naczynia hodowlanego (używać tylko pokrywek, ponieważ dno jest zbyt wysokie, aby zmieścić się w wilgotnej komorze szalki Petriego). Umieść dwie oddzielne kropelki zawierające gonady po obu stronach naczynia, dobrze oddzielone od siebie. Sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że gonady zostały przeniesione do kropel.
- Do kropli wyznaczonej jako kontrola dodać dodatkowe 15 μl cDMEM zawierającego DMSO (wykonane w kroku 1.5), aby uzyskać kroplę o całkowitej objętości 30 μl. Używaj tylko pipety "kontrolnej", która nie będzie miała kontaktu z lekiem.
- Do drugiej kropli (próbki poddanej działaniu leku) dodać 15 μl cDMEM zawierającego TKI-II, aby uzyskać kroplę o całkowitej objętości 30 μl. Używaj wyłącznie pipety przeznaczonej do próbek poddanych działaniu leków.
- Za pomocą pipety rozprowadź kropelki w rozszerzający się okrągły wzór, aż osiągną średnicę około 15-18 mm, a gonada znajdzie się mniej więcej pośrodku. Ustaw gonadę tak, aby leżała na boku, a gonada i mesonephros były łatwe do odróżnienia. Ustaw płuca tak, aby oba płaty leżały płasko.
- Chociaż średnica kropel może się nieznacznie różnić, upewnij się, że gonady nie unoszą się na wodzie i są utrzymywane na miejscu przez napięcie powierzchniowe. Upewnij się, że kropelki nie stykają się ze sobą ani z boku pokrywy. Bez napięcia powierzchniowego narządy będą rosły na pokrywie podczas hodowli i spłaszczały się, zniekształcając w ten sposób morfologię narządów.
- Ostrożnie umieść pokrywkę naczynia hodowlanego zawierającą kropelki pionowo na powierzchni wody w dużym (100 mm) naczyniu nawilżacza. Upewnij się, że pod dnem pokrywy nie ma pęcherzyków uwięzionych i że leży ona płasko na powierzchni wody. Nie odwracaj pokrywki i uważaj, aby woda nie dotknęła górnej części pokrywki, w której znajdują się kropelki.
- Aby stworzyć małą, nawilżoną komorę, natychmiast przykryj pokrywką większego naczynia nawilżacza, aby zamknąć kultury gonad. Działaj tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować parowanie mediów. Upewnij się, że mniejsze naczynie ma miejsce między nim a pokrywką większego naczynia, aby mogło się swobodnie poruszać; W przeciwnym razie kondensacja może spowodować uszczelnienie i zablokować wymianę powietrza do tkanki.
- Po umieszczeniu dwóch małych pokrywek w komorze, natychmiast umieść komorę w inkubatorze. Inkubować kultury kropelkowe przez 48 godzin w wilgotnym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
4. Reakcja łańcuchowa polimerazy do określania płci zarodków
- Dodać ogony zarodkowe na dno probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
- Do każdej probówki dodać 200 μl 50 mM NaOH.
- Umieścić w temperaturze 95 °C na 15 minut lub do całkowitego rozpuszczenia tkanki.
- Dodać 50 μl 1M Tris-HCl i lekko i krótko mieszać.
- W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przygotuj świeżą mieszankę wzorcową PCR, mnożąc każdą objętość przez całkowitą liczbę próbek: 0,5 μl 25 μM roztworu startera, 2,5 μl 10X buforu Taq, 0,5 μl 10 mM dNTP (nukleotydów), 19,3 μl wody wolnej od nukleaz, 0,2 μl polimerazy DNA Taq. Dobrze wymieszaj.
- Dodać 23 μl głównej mieszanki PCR do probówek PCR zawierających 3 μl lizatu strawionych ogonków.
- Przesuń probówki, aby je wymieszać, a następnie wykonaj krótki obrót, aby przenieść próbki na dno probówki.
- Uruchom program XY (Short) PCR (Tabela 1).
- Załaduj próbki (z 5x barwnikiem) i drabinkę do 2,5% żelu agarozowego w buforze 1X TAE.
- Uruchom elektroforezę w żelu agarozowym do momentu, gdy pasma XX i XY będą mogły zostać rozwiązane.
- Zobrazuj żel za pomocą światła UV i uchwyć obraz.
- Przeanalizuj prążki specyficzne dla chromosomu X i specyficzne dla chromosomu Y (chromosom X = 331 par zasad [bp] i XY = 302 pz)13; Próbki XY (męskie) będą miały dwa pasma 331 i 302 pz, podczas gdy próbki XX (żeńskie) pojawią się jako pojedyncze pasmo 331 pz.
5. Immunofluorescencja całego narządu Mount
Dzień 1:
- Usuń gonady z kultury za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl z końcówką odcinającą. W razie potrzeby można je umieścić w naczyniu z PBS w celu zmycia pożywki i odczynników. Umieścić w PBS w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml. Mniejszy rozmiar probówki pozwoli zaoszczędzić odczynniki i ułatwi śledzenie próbek w probówce.
- Należy pamiętać, że próbki kontrolne i poddane działaniu substancji, a także próbki XX i XY, należy przechowywać w oddzielnych probówkach i wyjmować je z hodowli za pomocą oddzielnych zestawów pipet, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia lekiem.
- Umyj gonady dwukrotnie za pomocą PBS. Od tego momentu protokół ten może wykorzystywać 1X PBS pozbawiony wapnia i magnezu. Aby je umyć, pozwól gonadom opaść na dno rurki (grawitacyjnie), a następnie usuń płyn znajdujący się powyżej. Należy uważać, aby nie stracić gonad przez pipetowanie zbyt blisko nich.
- Usuń jak najwięcej PBS z probówki. Dodać 250 μl 4% paraformaldehydu do PBS zawierającego 0,1% Triton X-100 i pozostawić do inkubacji O/N w temperaturze 4 °C na kołysce. Alternatywnie, to utrwalenie można wykonać przez 2 godziny w temperaturze 4 °C na kołysce. OSTROŻNOŚĆ! Paraformaldehyd jest substancją toksyczną, dlatego podczas obchodzenia się z nim należy przestrzegać protokołu bezpieczeństwa.
Dzień 2:
- Przepłukać gonady dwukrotnie w 250 μl PBTx w temperaturze pokojowej.
- Przemyj gonady 3 razy za pomocą 250 μl PBTx przez 10 minut każdy w temperaturze RT na bujaku.
- Zablokuj gonady na co najmniej 1 godzinę w 250 μl roztworu blokującego w temperaturze pokojowej na kołysce.
- Wybarwić gonady O/N w temperaturze 4 °C na kołysce w 250 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym.
Dzień 3:
- Opłucz gonady dwukrotnie w 250 μl roztworu myjącego.
- Umyj gonady 3 razy 250 μl roztworu myjącego przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej na bujaku.
- Zablokuj gonady przez 1 godzinę w 250 μl roztworu blokującego w temperaturze pokojowej na kołysce.
- Przykryj probówkę mikrowirówki folią aluminiową, aby chronić fluorescencyjne przeciwciała wtórne przed światłem.
- Inkubować gonady przez 2-4 godziny w temperaturze pokojowej na kołysku w 250 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym zawierającym Hoechst 33342. Alternatywnie, należy przeprowadzić inkubację przeciwciał drugorzędowych i Hoechst 33342 O/N w temperaturze 4 °C na wahaczu.
- Opłucz gonady dwukrotnie w 250 μl PBTx.
- Umyj gonady 3 razy w 250 μl PBTx przez 10 minut każdy w temperaturze RT na bujaku.
- Za pomocą odciętej końcówki pipety przenieś gonady na szkiełko z minimalną ilością płynu. Usuń nadmiar płynu za pomocą pipety, ale upewnij się, że tkanka nie wyschnie.
- Ustaw gonady w pożądany sposób za pomocą kleszczy i szybko dodaj kroplę podłoża montażowego, aby zamontować gonady na szkiełku. Upewnij się, że nośnik montażowy całkowicie pokrywa wszystkie próbki; Bardzo ważne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia próbek.
- Użyj szkiełek nakrywkowych (styl nr 1,5) o odpowiednim rozmiarze, aby delikatnie pokryć próbki. Pozwól, aby media montażowe rozprowadziły się tak, aby zetknęły się z całą powierzchnią szkiełka nakrywkowego. W razie potrzeby bardzo lekko dociśnij rogi szkiełka nakrywkowego, aby nie było dużych pęcherzyków powietrza.
- Uszczelnij szkiełka przezroczystym lakierem do paznokci wokół krawędzi, aby zmniejszyć parowanie mediów montażowych. Zamontowane szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Kultura kropelkowa ex vivo umożliwia manipulację całymi narządami, takimi jak gonady, w celu badania oddziaływań i dynamiki komórkowej. Rycina 1 przedstawia krok po kroku sposób przygotowania kropelkowej kultury gonad embrionów w stadium E11.5. Pierwsze etapy protokołu hodowli obejmują początkowe usunięcie macicy zawierającej embriony z organizmu myszy matki (Rycina 1A i 1B). Po usunięciu macicy, ścianę macicy przecina się, a embriony uwalnia z pęcherzyka żółtkowego do PBS w cel...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badanie to demonstruje metodę kropelkową ex vivo całego narządu, która ma wiele potencjalnych zastosowań w badaniu rozwoju płodu. Technika ta może być stosowana w przypadku wielu narządów i pozwala badaczowi zająć się kwestiami biologicznymi, które są trudne do zbadania przy użyciu metod in vivo ze względu na niedostępność zarodków i potencjalną śmiertelność zarodków. Ta metoda hodowli ma dodatkowe zalety w porównaniu z innymi podejściami in vitro , takimi jak linie komórkowe ssaków: można wyko...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy byli wspierani przez: CancerFree KIDS Research Grant, March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; oraz fundusze rozwojowe CCHMC. Autorzy dziękują również laboratorium Capel za wstępną optymalizację tej techniki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Okulary nakrywkowe: kwadraty (22 mm x 22 mm, nr 1,5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Lakier do paznokci Sally Hansen Xtreme Wear, niewidoczny | Sally Hansen | ||
| 8-paskowe 0,2 ml probówki PCR i Płaskie czapki odklejane | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Kleszcze | FST | 91150-20 | |
| Drobne nożyczki | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1,7 ml probówki do mikrowirówek | Denville | C2170 | |
| Posi-Click Probówki do mikrowirówek 0,6 ml | Denville | C2176 | |
| 10 μ l Precyzyjne końcówki barierowe SHARP | Denville | P1096FR | |
| 20 i mu; l Precyzyjne końcówki barierowe SHARP | Denville | P1121 | |
| 200 μ l Precyzyjne końcówki szlabanu SHARP | Denville | P1122 | |
| 1,000 μ l Precyzyjne końcówki barierowe SHARP | Denville | P1126 | |
| Strzykawka 1 ml z igłami o rozmiarze 27 BD | PrecisionGlide | 309623 | |
| Strzykawka 10 ml | BD | 305559 | |
| 0,2 i mu; Filtr strzykawkowy M PES | VWR | 28145-501 | |
| Klasa 3 Jakościowa bibuła filtracyjna Standard Grade, okrąg, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35 mm Easy Grip Style Naczynie do hodowli komórkowych | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petriego, sterylne (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S Inkubator CO2 | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-wirówka | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler z panelem sterowania | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 | stereoskop Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet z oprogramowaniem AlphaEase | Alpha Innotech Corporation | Wycofane z produkcji | |
| Absolutny 200-procentowy etanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Fosforan sodu (dwuzasadowy MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Fosforan potasu (monozasadowy MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Chlorek sodu (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Chlorek potasu (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Chlorek magnezu (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Chlorek wapnia (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Technologie życia wodnego bez nukleaz Ambion | AM9938 | ||
| Podkład XY PCR | IDT | N/A | |
| Lodowaty kwas octowy | Fisher | A38-500 | |
| Kwas tetraoctowy etylenodiaminy (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% roztwór bromku etydyny | Fisher | BP1302-10 | Toksyczna |
| agaroza | GeneMate | E-3120-500 | |
| Wodorotlenek sodu (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2,5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Polimeraza Taq z 10x buforem | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyd | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Chlorowodór ( HCl) | Fisher | A144212 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA), proszek, frakcja V, izolacja szoku cieplnego | Bioexpress | 0332-100g | |
| Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS), potrójnie filtrowana 100 nm | Fisher | 03-600-511 | Inaktywacja termiczna przed użyciem |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Stosować w 1:100 |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO), Hybri-max, sterylnie filtrowany | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Inhibitor kinazy tyrozynowej II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Przeciwciało | Millipore | AB5535 | Stosować przy rozcieńczeniu: 1:4,000 |
| Szczurze przeciwciało anty-mysie PECAM1 (CD31) | BD Pharmingen | 553370 | Stosować w rozcieńczeniu: 1:250 |
| Królik Rozszczepiony kaspaza-3 (Asp175) | Sygnalizacja komórkowa | przeciwciała 9661S | Stosowanie w rozcieńczeniu: 1:250 |
| Szczurze przeciwciało E-kadheryny / CDH1 (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Stosować przy rozcieńczeniu: 1:500 |
| Hoechst 3342, trichlorowodorek, trójwodzian | Invitrogen (sondy molekularne) | H1399 | Stosować przy 2 ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Stosować przy rozcieńczeniu: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Stosować w Rozcieńczenie: 1:500 |
| Przeciwciało drugorzędowe anty-królika IgG (H+L) osła, koniugat Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A31572 | Stosowanie przy rozcieńczeniu: 1:500 |
| Przeciwciało drugorzędowe anty-królika IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21206 | Stosować przy rozcieńczeniu: 1:500 |
| Przeciwciało drugorzędowe anty-Rat IgG (H+L) osła, koniugat Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21208 | Stosować przy rozcieńczeniu: 1:500 |
| Przeciwciało drugorzędowe anty-królika IgG (H+L) osła, koniugat Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A31573 | Stosować w rozcieńczeniu: 1:500 |
Bibliografia
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803(2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
- DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
- Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817(2014).
- Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641(2014).
- Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979(2012).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).
- Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
- Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
- Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
- Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
- Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
- Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
- Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
- Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
- Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
- Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
- Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
