Artykuł metodologiczny

Pole geomagnetyczne (Gmf) i ewolucja roślin: badanie wpływu odwrócenia GMF na rozwój Arabidopsis thaliana i ekspresję genów

14.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53286

⸱

30 listopada 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences and Systems Biology, University of Turin, 2Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, John Radcliffe Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę testowania hipotezy, że odwrócenie efektywnego pola geomagnetycznego (GMF) indukuje różnicową ekspresję genów i zmienia morfologię Arabidopsis thaliana. Trójosiowy ośmiokątny układ par cewek Helmholtza został wykorzystany do sztucznego generowania odwróconych warunków GMF w komorze wzrostu roślin.

Streszczenie

Jedną z najbardziej stymulujących obserwacji w ewolucji roślin jest korelacja między występowaniem odwrócenia (lub odchyleń) pola geomagnetycznego (GMF) a momentem promieniowania roślin okrytozalążkowych. Doprowadziło to do hipotezy, że zmiany w polarności GMF mogą odgrywać rolę w ewolucji roślin. W tym miejscu opisujemy metodę testowania tej hipotezy poprzez wystawienie Arabidopsis thaliana na sztucznie odwrócone warunki GMF. Użyliśmy magnetometru trójosiowego, a zebrane dane posłużyły do obliczenia wielkości GMF. Trzy zasilacze prądu stałego były podłączone do trzech par cewek Helmholtza i były sterowane przez komputer w celu zmiany warunków GMF. Rośliny uprawiane na płytkach Petriego były wystawione zarówno na normalne, jak i odwrócone warunki GMF. Przeprowadzono również eksperymenty z pozorowaną ekspozycją. Odsłonięte rośliny zostały sfotografowane podczas eksperymentu, a obrazy zostały przeanalizowane w celu obliczenia długości korzeni i powierzchni liści. Wyekstrahowano całkowite RNA Arabidopsis i przeprowadzono ilościowe analizy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) ekspresji genów CRUCIFERINY 3 (CRU3), białka transportującego miedź1 (COTP1), czynnika transkrypcyjnego reagującego na redoks1 (RRTF1), dysmutazy ponadtlenkowej Fe 1 (FSD1), katalazy3 (CAT3), peroksydazy askorbinianu tylakoidu (TAPX), cytozolowej peroksydazy askorbinianowej1 (APX1) i NADPH/białko D oksydazy impulsowej układu oddechowego (RbohD). Przeanalizowano cztery różne geny referencyjne w celu normalizacji wyników qPCR. Wybrano najlepszy z czterech genów i użyto najbardziej stabilnego genu do normalizacji. Nasze dane pokazują po raz pierwszy, że odwrócenie polaryzacji GMF za pomocą cewek trójosiowych ma znaczący wpływ na wzrost roślin i ekspresję genów. Potwierdza to hipotezę, że odwrócenie GMF przyczynia się do wywoływania zmian w rozwoju roślin, które mogą uzasadniać wyższą presję selekcyjną, ostatecznie prowadząc do ewolucji roślin.

Wprowadzenie

Pole magnetyczne Ziemi (lub równoważnie pole geomagnetyczne, GMF) jest nieuniknionym czynnikiem środowiskowym dla wszystkich organizmów żyjących na planecie, w tym roślin. GMF zawsze był naturalną cechą Ziemi, więc podczas ewolucji wszystkie żywe organizmy doświadczyły jego działania. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że GMF jest w stanie wpływać na wiele procesów biologicznych 1. GMF nie jest jednorodny i występują znaczne lokalne różnice w jego wielkości i kierunku na powierzchni Ziemi. GMF na powierzchni Ziemi wykazuje szeroki zakres wielkości, od mniej niż 30 μT do prawie 70 μT. GMF chroni Ziemię i jej biosferę przed śmiertelnymi skutkami wiatru słonecznego poprzez odchylanie większości naładowanych cząstek przez magnetosferę2.

Rośliny reagują na bodźce środowiskowe; a klasyczne reakcje na czynniki abiotyczne, takie jak światło i grawitacja, zostały dokładnie opisane poprzez zdefiniowanie tak zwanych reakcji fototropowych i grawitropowych. Bardzo niewiele lub nic nie wiadomo na temat mechanizmów percepcji i reakcji roślin na pola magnetyczne, pomimo mnóstwa prac opublikowanych na ten temat i ostatnio recenzowanych1. W przeciwieństwie do pola grawitacyjnego, GMF zmieniał się konsekwentnie podczas ewolucji roślin, stanowiąc tym samym ważny czynnik stresu abiotycznego, który został niedawno uznany za potencjalną siłę napędową, która ostatecznie przyczyni się do dywersyfikacji i specjacji roślin. Odwrócenia geomagnetyczne (lub wycieczki) to zmiany polaryzacji GMF. W historii życia Ziemi odwrócenie GMF miało miejsce kilka razy. Wystawiały one planetę na okresy zmniejszonej siły GMF podczas każdej zmiany polaryzacji. Niektórzy autorzy wysunęli hipotezę, że te okresy przejściowe o niskiej sile GMF mogły pozwolić promieniowaniu jonizującemu z wiatru słonecznego dotrzeć do powierzchni Ziemi, wywołując w ten sposób stały stres dla organizmów żywych, który mógł być wystarczająco silny, aby wywołać zmiany w genach, które ostatecznie doprowadziły do ewolucji roślin.

Szczegółowa analiza eksperymentów opisujących wpływ pól magnetycznych na rośliny pokazuje dużą liczbę sprzecznych raportów, charakteryzujących się brakiem wiarygodnych mechanizmów interakcji biofizycznych. Wiele eksperymentów jest po prostu nierealistycznych, podczas gdy innym brakuje testowalnej hipotezy i ostatecznie są nieprzekonujące 3. Na przestrzeni ostatnich lat dokonano przeglądu postępu i stanu badań nad wpływem pól magnetycznych na rośliny 2,4-11. Ostatnio dokładnie omówiono wpływ zarówno niskiego, jak i wysokiego pola magnetycznego 1, ze szczególnym naciskiem na udział zdarzeń odwrócenia GMF na ewolucję roślin 2.

Najbardziej bezpośrednim sposobem na potwierdzenie hipotezy, że odwrócenia GMF wpływają na ewolucję roślin, jest synteza odwrócenia GMF w laboratorium, poprzez testowanie reakcji roślin na normalne i odwrócone warunki pola magnetycznego. Aby przetestować tę hipotezę, zbudowaliśmy trójosiowy, ośmiokątny system kompensacji pola magnetycznego par cewek Helmholtza (cewki trójosiowe), który jest w stanie dokładnie odwrócić normalne warunki GMF.

Użyliśmy Arabidopsis thaliana jako modelowej rośliny i przetestowaliśmy wpływ odwróconego GMF na ekspresję genów niektórych ważnych genów: CRUCIFERIN 3 (CRU3), który koduje białko magazynujące nasiona 12S, które jest fosforylowane tyrozyną, a jego stan fosforylacji jest modulowany w odpowiedzi na ABA w nasionach Arabidopsis thaliana 12,13; Białko Transportu Miedzi1 (COTP1), które koduje białko nadrodzinne transportujące/detoksykujące metale ciężkie, pełniące dominującą funkcję w pozyskiwaniu Cu w glebie i rozwoju pyłku 14; oraz czynnik transkrypcyjny reagujący na redoks1 (RRTF1), który koduje członka podrodziny ERF (czynnik odpowiedzi etylenu) B-3 rodziny czynników transkrypcyjnych ERF/AP2, która zawiera jedną domenę AP2, która ułatwia synergiczną koaktywację szlaków ekspresji genów i nadaje tolerancję krzyżową na stresy abiotyczne i biotyczne 15.

Ponadto przeanalizowaliśmy również pięć genów zaangażowanych w reakcje na stres oksydacyjny: dysmutazę ponadtlenkową Fe1, (FSD1), która koduje enzymatyczny enzym, który enzymatycznie i szybko przekształca anion ponadtlenkowy (O2-) i wodę (H2O) w nadtlenek wodoru (H2O2) i tlen cząsteczkowy (O2) 16; Katalaza3 (CAT3), która koduje i enzym katalizujący rozkładH2O2do wody i tlenu 17,18; Peroksydaza askorbinianowa tylakoidowa (TAPX), która koduje chloroplastyczną peroksydazę tylakoidową, która wymiataH2O2 19; Peroksydaza askorbinianowa1 (APX1), która koduje peroksydazę cytozolową, która wymiataH2O2i stanowi jeden z potencjalnych celów modyfikacji potranslacyjnych, w których pośredniczą cząsteczki pochodzące z NO 20; oraz NADPH-białko D oksydazy wybuchowej NADPH (RbohD), które koduje enzym wytwarzającyO2- i odgrywa kluczową rolę w regulacji wzrostu, rozwoju i reakcji na stres u Arabidopsis 21.

Nasza metodologia odwracania pola dostarcza pierwszych dowodów na to, że odwrócenie GMF może wywołać znaczącą zmianę w morfologii i ekspresji genów korzeni i pędów A. thaliana. Protokół ten zapewnia innowacyjny sposób oceny wpływu odwrócenia GMF na morfologię roślin i ekspresję genów i może być wykorzystany do oceny potencjalnego wpływu odwrócenia GMF na inne aspekty zachowania roślin, a tym samym pokieruje dyskusją na temat roli odwrócenia GMF na ewolucję roślin.

Protokół

1. Ustawienie cewek trójosiowych

UWAGA: Rysunek 1 pokazuje trójosiowe cewki używane do odwrócenia GMF.

  1. Włącz magnetometr trójosiowy, którego sonda jest włożona w cewki trójosiowe.
  2. Włącz komputer i uruchom oprogramowanie magnetometru, które umożliwia zbieranie danych z magnetometru trójosiowego.
  3. Użyj wartości składowych zgłoszonych przez magnetometr, aby obliczyć wielkość GMF. Na przykład przy wartościach magnetometru: Bx = 6,39 μT, By = 36,08 μT, Bz = 20,40 μT oblicz natężenie pola 41,94 μT, korzystając z następującego równania: B = BGMF + Bdodatkowe, gdzie Bdodatkowe = (Bx2 + By2 + Bz2)1/2 (tj. 41,9 μT w przykładzie).
  4. Włącz trzy zasilacze prądu stałego (dwuzakresowe: 0-8 V/5 A i 0-20 V/2,5 A, 50 W), z których każdy jest podłączony do trzech par cewek Helmholtza i podłączony do komputera za pośrednictwem połączenia GPIB (rysunek 1B).
  5. Ustaw napięcia zasilaczy tak, aby wygenerowały żądane pole magnetyczne z odwróconym wektorem pola magnetycznego. Na przykład, przy BGMF, jak w kroku 1.3 i przy rozmiarze cewki opisanego tutaj oprzyrządowania, ustaw napięcia na Vx =0,00 V, Vy = 30,52 V, Vz = 0,00 V, aby wygenerować nową wypadkową B = BGMF + Bcewki trójosiowe = (6,38, -36,08, 20,39) μT., tj. nowe pole o tej samej wielkości co BGMF, ale skierowane w innym kierunku.
  6. Sprawdzić nowe pole za pomocą oprogramowania magnetometru, stosując procedurę opisaną w ppkt 1.3.
  7. Wystaw rośliny zarówno na normalne, jak i odwrócone warunki GMF, używając płytek Petriego, jak opisano w sekcji 2.
  8. Przeprowadzanie eksperymentów z pozorowaną ekspozycją, utrzymując wielkość pola równą | BGMF| oraz utrzymywanie składowej pionowej pola równej składowej GMF, ale zmieniając kierunek (tj. "północ, wschód lub zachód") składowej poziomej pola o równych prądach w cewkach trójosiowych w porównaniu do stanu odwrócenia pola. W tym celu należy zmienić napięcie cewek zgodnie z opisem w 1.5.
    Uwaga: Ta pozorna ekspozycja wyklucza potencjalne subtelne efekty nagrzewania lub wibracji pochodzące zarówno z samych cewek, jak i z elektroniki używanej do sterowania cewkami.
  9. Przeprowadzaj eksperymenty z podwójnie ślepą próbą, stosując warunki terenowe zaślepione od personelu wykonującego pozostałą część eksperymentów i/lub interpretującego dane.

2. Przygotowanie materiałów roślinnych i warunki do wzrostu roślin

  1. Użyć nasion Arabidopsis thaliana, ekotyp Columbia 0 (Kol 0), następnie umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml i sterylizować powierzchnię przez traktowanie 5% (w/v) roztworem podchlorynu wapnia i 0,02% (v/v) Triton X-100 w 80% etanolu (EtOH), przez 10-12 minut w temperaturze 25-28 °C, z ciągłym wstrząsaniem. Następnie spłucz dwukrotnie 80% EtOH, przemyj 100% EtOH i na koniec spłucz sterylną wodą destylowaną.
  2. Przygotuj 1 l modyfikowanej pożywki Murashige i Skoog 22 (MS), dodając: 2,297 g MS (0,5 x MS Mieszanina soli podstawowej), 10 g sacharozy, wody dejonizowanej do 1 l, pH 5,8-6,0 dostosowanego za pomocą KOH. Dodać 16 g agaru i autoklawu przez 20 minut w temperaturze 120 °C.
  3. Przed zestaleniem wlej 80 ml pożywki do każdej kwadratowej płytki Petriego (120 x 120 mm2) przed zestaleniem. Zasiej trzydzieści sterylnych nasion na talerzu, a następnie uszczelnij płytki woskowym filmem.
  4. Wernalizować płytki poziomo w ciemności w temperaturze 4 °C przez 2 dni, aby wzmocnić i zsynchronizować kiełkowanie, a następnie wystawić płytki Petriego na działanie normalnego lub odwróconego GMF.
  5. Wystawić nasiona w kontrolowanym środowisku klimatycznym w temperaturze 22 °C w pozycji pionowej w równoległych eksperymentach zarówno wewnątrz cewek trójosiowych, jak i na zewnątrz cewek trójosiowych w harmonogramie fotoperiodycznym 8 godzin ciemności i 16 godzin światła, przy użyciu lamp sodowych (220 x 10-6 E m-2 s-1). Użyj niebieskiej folii żelatynowej jako reflektora, aby zredukować czerwoną składową lamp.
  6. Wystawiaj rośliny na 10 dni przed ekstrakcją RNA zarówno na normalne (kontrolne), jak i odwracające (traktowanie) warunki GMF.
  7. Po naświetleniu zrób zdjęcia szalek Petriego.
  8. Użyj oprogramowania ImageJ, aby obliczyć długość korzeni i powierzchnię liści.
    1. Krótko mówiąc, zmierz bok płytki Petriego, a następnie otwórz obraz płytki Petriego i za pomocą opcji "prostej" linii narysuj linię, która dokładnie przecina bok płytki.
    2. W menu "analizuj" wybierz "ustaw skalę" i wstaw rzeczywistą odległość w polu "znana odległość" (np. 120 mm), następnie wprowadź jednostkę długości (mm); na koniec kliknij opcję "globalna", aby udostępnić ustawienia dla wszystkich pomiarów.
    3. Aby uzyskać długość korzenia, uważnie śledź kształt korzenia za pomocą narzędzia odręcznego. Zmierz długość, korzystając z opcji "zmierz" w menu "analizuj". Kontynuuj pomiar wszystkich korzeni na obrazie i zapisz plik do dalszych analiz statystycznych.
    4. Dla obszaru liścia z menu "obraz" użyj opcji dostosuj, a następnie "próg koloru". Wybierz pojedynczy liść i w menu "analizuj" wybierz "analizuj cząstki". Zapisz poszczególne pomiary do analiz statystycznych.

3. Ekstrakcja całkowitego RNA Arabidopsis, warunki reakcji Quantitative Real Time-PCR (qPCR) i startery dla Arabidopsis

  1. Zbierz osobno 30 pędów i 30 korzeni i natychmiast zamroź w ciekłym azocie. Następnie zmielić w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka.
  2. Wyizoluj całkowite RNA za pomocą zestawu do oczyszczania i zestawu do leczenia DNazy bez RNaz, korzystając z instrukcji producenta.
  3. Sprawdź jakość i ilość próbki za pomocą zestawu nano RNA i kapilarnej elektroforezy żelowej zgodnie z instrukcjami producenta. Potwierdzić oznaczanie ilościowe RNA spektrofotometrycznie.
  4. Użyj 2 μg całkowitego RNA i losowych starterów za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA, aby uzyskać pierwszą nić cDNA zgodnie z zaleceniami producenta.
  5. Wykonuj wszystkie eksperymenty w systemie czasu rzeczywistego przy użyciu SYBR green I z ROX jako wewnętrznym standardem ładowania.
  6. Przeprowadzić reakcję z 25 μl mieszaniny składającej się z 12,5 μl 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,5 μl cDNA i starterów 100 nM. Należy stosować startery wymienione w Tabeli 1. Uwzględnij w kontrolach kontrole inne niż RT (przy użyciu całkowitego RNA bez odwrotnej transkrypcji do monitorowania zanieczyszczenia genomowego DNA) i kontrole bez matrycy (woda zamiast matrycy).
  7. Obliczyć wydajność podkładu dla wszystkich par podkładów przy użyciu metody krzywej standardowej 23.
  8. Należy stosować następujące warunki PCR: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 minut w temperaturze 95 °C, 40 cykli po 15 s w temperaturze 95 °C, 30 sekund w temperaturze 58 °C i 30 sekund w temperaturze 72 °C; UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, CAT3, TAPX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min w 95 °C, 40 cykli po 15 s w 95 °C, 20 s w 57 °C i 30 s w 72 °C.
  9. Odczyt fluorescencji po każdej fazie wyżarzania i wydłużania. Dla wszystkich przebiegów należy przeprowadzić analizę krzywej topnienia w zakresie od 55 do 95 °C, uwzględniając segment dysocjacji w profilu termicznym. Użyj ekranu krzywej dysocjacji, do którego można uzyskać dostęp poprzez zakładkę wyników, aby wyświetlić profil dysocjacji (wykres fluorescencji w funkcji temperatury). Upewnij się, że zestaw danych zebrany podczas segmentu dysocjacji eksperymentu został wybrany do analizy przy użyciu ekranu Analiza/Konfiguracja.
  10. Określić liniowy zakres stężenia matrycy do wartości progowej cyklu (wartość Ct), wykonując dziesięciokrotną serię rozcieńczeń (1- do 10,3-krotnie) przy użyciu cDNA z trzech niezależnych ekstrakcji RNA analizowanych w trzech kontrpróbach technicznych 24,25.
  11. Analizuj wszystkie wykresy amplifikacji za pomocą oprogramowania do PCR w czasie rzeczywistym, aby uzyskać wartości Ct. Skalibruj i znormalizuj względne poziomy RNA z poziomem najlepszych genów porządkowych w następujący sposób: 3.11.1) Uzyskaj dostęp do ekranu Wykresy amplifikacji przez zakładkę Wyniki, wybierz rampę lub plateau, dla których dane mają być analizowane za pomocą ekranu Wybór/Ustawienia analizy, a następnie wybierz dRn (znormalizowana fluorescencja skorygowana o linię bazową) z menu Fluorescencja na panelu poleceń. Uzyskaj dostęp do ekranu Wartości próbek płyt za pośrednictwem zakładki Wyniki, aby wyświetlić wartości Ct dla pobranych próbek.
  12. Użyj czterech różnych genów referencyjnych [np. cytoplazmatycznej dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPC2), proteazy 6 specyficznej dla ubikwityny (UBP6), aktyny1 (ACT1) i czynnika elongacji 1B alfa-podjednostki 2 (eEF1Balpha2)], aby znormalizować wyniki PCR w czasie rzeczywistym. Wybierz gen o najwyższej pozycji w rankingu za pomocą oprogramowania analitycznego 26; i użyj najbardziej stabilnego genu do normalizacji.
    1. Krótko mówiąc, uporządkuj dane wejściowe w arkuszu Excela z pierwszą kolumną zawierającą nazwy genów i pierwszym wierszem zawierającym nazwy próbek. Następnie wybierz oprogramowanie analityczne z paska menu. Użyj okna dialogowego, aby wybrać dane wejściowe.
    2. Następnie sprawdź pola Nazwy próbek, Nazwy genów i Tylko proste dane wyjściowe. Kliknij przycisk Przejdź, aby przeprowadzić analizę. Wybierz gen o najwyższej pozycji w rankingu (który ma najmniejszą wartość stabilności) jako gen kandydujący o najbardziej stabilnej ekspresji.
  13. Wykreśl dane, pokazując wyrażenie różnicowej zmiany krotności zarówno w pędach, jak i korzeniach.

4. Analizy statystyczne

  1. Wyraż dane jako wartości średnie ± błąd standardowy. Porównaj grupę kontrolną i leczoną, przeprowadzając analizę wariancji (ANOVA) i test Tukeya z testem skorygowanego prawdopodobieństwa Bonferroniego i Dunna-Sidaka (ufność 0,95%).

Wyniki

Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie metody oceny, czy odwrócenie pola geomagnetycznego (GMF) może wpływać na rozwój roślin i ekspresję genów ekotypu Col 0 Arabidopsis thaliana. Do odwrócenia GMF, przy zastosowaniu odpowiednich napięć zasilających (Rysunek 1B), uzyskanych zgodnie z opisem w kroku 1.5 protokołu, wykorzystano cewki trójosiowe pokazane na Rysunku 1A. Wymiary cewek trójosiowych wynoszą ~2 x 2 x 2 m3, co zapewniło wystarczającą przestrzeń w warunkach odwróconego GMF do umieszczenia kilku szalek Petriego. Kontrolę uprawiano w tych samych warunkach środowiskowych i przy normalnych wartościach GMF. Po 10 dniach ekspozycji na normalne i odwrócone warunki GMF fenotyp roślin wykazał wyraźne zmiany morfologiczne. Jak pokazano na Rysunku 2, rośliny kontrolne (t.j. uprawiane w normalnych warunkach GMF) wykazały długość korzeni o istotnie (Dunn-Sidak and Bonferroni Adjusted Prob <0.001; Student’s t = 10.68, df = 31) wyższych wartościach (29,41 mm; SEM = 1,04; N = 32) w stosunku do roślin poddanych działaniu odwróconego GMF (17,53 mm; SEM = 0,58; N = 36). W roślinach z odwróconym GMF zmieniona była również morfologia pędów, co objawiało się ograniczonym rozwojem powierzchni liści. Rośliny wystawione na normalne warunki wykazały średnią powierzchnię liścia wynoszącą 4,95 mm2 (SEM 0,025, N = 54), natomiast rośliny poddane działaniu odwróconego GMF wykazały istotnie (Dunn-Sidak and Bonferroni Adjusted Prob = <0.001; student’s t = 31.32, df = 53) niższe wartości powierzchni liści (3,71 mm2; SEM = 0,032; N = 54). Zatem ekspozycja Arabidopsis na warunki odwróconego GMF spowodowała redukcję zarówno długości korzenia, jak i powierzchni liści.

Ekspansja liści i wzrost korzeni zależą zarówno od podziałów, jak i od wydłużania się komórek 27. Z tego względu rozwój rośliny, jej produktywność i ogólna kondycja zależą od optymalnej architektury systemu pędów i korzeni 28. Zmniejszona długość korzeni i wielkość liści roślin poddanych warunkom odwróconego GMF wskazują na obecność systemu sensorycznego zdolnego nie tylko do wykrywania zmian natężenia pola magnetycznego, ale także do reagowania na zmiany „kierunku” pola magnetycznego w stosunku do grawitacji. Hipoteza, według której odwrócenie GMF może wpływać na wzrost roślin, znajduje silne potwierdzenie w naszych eksperymentach, które wykazują, że warunki odwrócenia GMF mogą znacząco wpływać na rozwój roślin.

Zmianom morfologicznym towarzyszyły również zmiany w ekspresji genów. Wśród genów referencyjnych najstabilniejszym genem był elongationfactor1B alpha-subunit 2. Pierwsza grupa genów (CRU3, COTP1, RRTF1) wykazała gwałtowną zmianę ekspresji (Rysunek 3). Ekspresja wszystkich trzech genów w pędach była znacząco zwiększona (P <0,05) około 2,5-krotnie u roślin eksponowanych na odwrócone warunki GMF. Ekspresja CRU3 w korzeniach była podwyższona u roślin eksponowanych na normalne warunki GMF, ale była znacząco (P <0,05) obniżona w warunkach odwróconego GMF. Przeciwną zależność zaobserwowano dla COTP1 oraz RRTF1, których ekspresja była obniżona w warunkach normalnych i podwyższona w obecności odwrócenia GMF (Rysunek 3).

Kruciferyna (globulina 12 S) jest najliczniejszym białkiem zapasowym w nasionach A. thaliana oraz innych roślin kapustnych i jest syntetyzowana jako prekursor w szorstkiej siateczce endoplazmatycznej. Następnie jest ona transportowana do wakuol magazynujących białka 13. Kiełkowanie siewek wymaga rozkładu kruciferyny, która służy jako początkowe źródło azotu. Obniżenie regulacji degradacji kruciferyny ogranicza rozwój embrionów poprzez upośledzenie rozwoju struktur komórkowych lub komponentów komórkowych 29,30. Nasze wyniki pokazują, że zwiększenie ekspresji CRU3 koreluje z mniejszą ekspansją liści i zredukowaną długością korzenia, co wskazuje, że gen ten jest wrażliwy na odwrócenie GMF i że jego nadekspresja może przyczyniać się do zahamowania rozwoju rośliny. Ponadto odwrócenie GMF indukuje znaczące obniżenie regulacji CRU3 w korzeniach, co koreluje z zredukowaną długością korzenia. Miedź jest niezbędnym kofaktorem dla kluczowych procesów w roślinach, ale wykazuje szkodliwe działanie w nadmiarze; zatem nadekspresja transporterów miedzi upośledza wzrost rośliny. Efektem odwrócenia GMF była znacząca nadekspresja COTP1 zarówno w pędach, jak i korzeniach, co wyjaśnia zredukowany wzrost rośliny. Stres jonowy upośledza metabolizm chloroplastów, który jest ściśle powiązany ze stanem redoks komórki. U Arabidopsis czynnik transkrypcyjny RRTF1 jest ważny dla ekspresji genów związanych ze zdolnością do adaptacji do zmian redoks 31. Dlatego, gdy rośliny są narażone na zewnętrzne bodźce zdolne do zmiany ich programów fizjologicznych i rozwojowych, oczekiwana jest nadekspresja tego ważnego czynnika transkrypcyjnego. Odwrócenie GMF wywołało znaczącą nadekspresję RRTF1 zarówno w pędach, jak i korzeniach, co wskazuje na silniejsze reakcje roślin na stres oksydacyjny w warunkach odwróconego GMF.

Interesujące wyniki uzyskano poprzez analizę pięciu genów zaangażowanych w stres oksydacyjny. Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie geny wyizolowane i analizowane w pędach nie wykazały istotnych różnic (P >0,05) w przypadku roślin hodowanych w normalnych lub odwróconych warunkach GMF (Rysunek 4 i Rysunek 5). Jednak w korzeniach roślin poddanych odwróconym warunkom GMF zawsze obserwowano istotną regulację w dół. W szczególności CAT3 wykazał najwyższy stopień regulacji w dół (Rysunek 5), a następnie, w kolejności malejącej, APX1, FSD1, RBOHD i TAPX (Rysunek 4).

Krzyżowa tolerancja na stresy abiotyczne i biotyczne jest zapewniona przez aktywację różnych genów zaangażowanych w kilka szlaków biochemicznych. Czynnik transkrypcyjny RRTF1 ułatwia synergistyczną koaktywację ekspresji genów tych szlaków 15,31 i może być potencjalnie zaangażowany w stres oksydacyjny 32. W związku z tym, w przypadku zmniejszenia usuwania tlenu, oczekiwana jest nadekspresja RRTF1. Spadek aktywności enzymów usuwających tlen w korzeniach koreluje z nadekspresją RRTF1, który działa w odpowiedzi na zwiększony stres oksydacyjny. Gwałtowny spadek ekspresji CAT3, APX1 i TAPX w korzeniach wskazuje na zmniejszoną zdolność komórek korzenia do usuwania H2O2, czemu towarzyszy obniżona zdolność do dysmutacji anionu ponadtlenkowego wynikająca ze spadku ekspresji FSD1. Odpowiedzi na stres oksydacyjny są silniejsze w korzeniach, które zdają się być głównym miejscem percepcji odwróconego GMF.

Komora wzrostu roślin z kontrolą parametrów środowiskowych, sprzęt do monitorowania elektrycznego pokazujący napięcie i prąd.
Rysunek 1. System kompensacji pola geomagnetycznego. (A) cewki trójosiowe (składające się z pary cewek ośmiokątnych dla każdej z trzech osi prostopadłych) używane do odwrócenia wektora pola geomagnetycznego. (B) Sterowany komputerowo zasilacz jest podłączony do każdej pary cewek Helmholtza. (Wartości napięć na tych rysunkach są umowne) Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Eksperyment nad fototropizmem roślin porównujący układ kontrolny i odwrócony, ilustrujący wzorce wzrostu.
Rycina 2. Wpływ odwrócenia pola geomagnetycznego na morfologię Arabidopsis. Po dziesięciu dniach ekspozycji rośliny kontrolne (t.j. te poddane normalnym warunkom GMF) wykazują znacznie większą długość korzenia i bardziej rozwinięte listki w porównaniu z roślinami poddanymi odwróconym warunkom GMF. Pasek skali = 18 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy ekspresji genów; CRU3, COTP1, RRTF1; pędy, korzenie; analiza grupy kontrolnej i odwróconego GMF.
Rycina 3. Wpływ odwrócenia pola geomagnetycznego na ekspresję genów Arabidopsis. Po dziesięciu dniach ekspozycji wyizolowano całkowite RNA z roślin kontrolnych i traktowanych, a następnie poddano je analizie Real-Time PCR w celu oceny ekspresji. Efektem odwrócenia GMF była drastyczna zmiana ekspresji wszystkich badanych genów. CRU3, Cruciferin 3; COTP1, Copper Transport Protein1; RRTF1, Redox Responsive Transcription Factor1. Słupki wskazują błąd standardowy; gwiazdki oznaczają istotne (P <0.05) różnice między roślinami eksponowanymi na odwrócone i normalne warunki GMF. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy krotnej zmiany ekspresji genów; TAPX, APX1, FSD1, RBOHD; pędy, korzenie; badanie efektu GMF.
Rycina 4. Wpływ odwrócenia ziemskiego pola magnetycznego na ekspresję genów związanych z przeciwutleniaczami u Arabidopsis. Po dziesięciu dniach ekspozycji wyizolowano całkowite RNA z roślin kontrolnych i traktowanych, a następnie wykorzystano je do analizy ekspresji genów za pomocą Real-Time PCR. Odwrócenie GMF nie wywołało istotnych zmian w ekspresji genów w pędach; jednak w korzeniach roślin hodowanych w warunkach odwróconego GMF zaobserwowano drastyczny spadek ekspresji genów. TAPX, peroksydaza askorbinianowa tylakoidów; APX1, peroksydaza askorbinianowa 1; FSD1, dysmutaza ponadtlenkowa żelazowa 1; RbohD, białko NADPH/oksydaza wybuchu oddechowego D. Słupki wskazują błąd standardowy; gwiazdki oznaczają istotne (P <0.05) różnice między roślinami eksponowanymi na odwrócone i normalne warunki GMF. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza ekspresji genów, wykres słupkowy; krotność zmiany CAT3 w pędach/korzeniach w warunkach GMF i odwróconego GMF.
Rysunek 5. Wpływ odwrócenia pola geomagnetycznego na ekspresję genu katalazy 3 (CAT3) u Arabidopsis . Po dziesięciu dniach ekspozycji wyizolowano całkowite RNA roślin kontrolnych i traktowanych, a następnie wykorzystano je do analizy ekspresji genów za pomocą Real-Time PCR. Efektem odwrócenia GMF był brak istotnych zmian w ekspresji genów w pędach; jednakże zaobserwowano drastyczną regulację w dół ekspresji genów w korzeniach roślin hodowanych w warunkach odwróconego GMF. Słupki wskazują błąd standardowy; gwiazdki oznaczają istotne (P <0.05) różnice między roślinami eksponowanymi na odwrócone i normalne warunki GMF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Niedawno wykazaliśmy, że istnieje niesamowita korelacja między odwróceniem GMF a czasem, w którym nastąpiło przekierowanie większości rodzinnych linii okrytozalążkowych 2. Jednak pomimo stymulujących hipotez i mnóstwa badań nad wpływem różnych intensywności GMF, nigdy nie wykazano założenia, że odwrócenie GMF może samo w sobie wywołać znaczące zmiany w ekspresji i morfologii genów roślin. Tutaj po raz pierwszy pokazujemy metodę, która wykorzystuje trójosiową ośmiokątną cewkę Helmholtza do odwrócenia GMF w naszym laboratorium oraz że odwrócenie otaczającego pola magnetycznego może powodować zmiany fenotypowe i modulację ekspresji genów u roślin.

W celu uzyskania odwrócenia (lub modyfikacji) GMF w objętości wystarczającej do eksperymentów wzrostu roślin (2 x 2 x 2 m3), zbudowaliśmy ośmiokątny system cewek Helmholtza. System ten nie jest dostępny na rynku (zwykle cewki Helmholtza mają kształt pierścienia i są mniejsze), a koszty budowy były znaczne. Co ważne, system ten zapewnia solidną modyfikację pola, z wyjątkową stabilnością w czasie i jednorodnością zmodyfikowanych pól magnetycznych.

System został zaprojektowany i zbudowany w celu zmniejszenia wartości GMF do tysięcznej części normalnych warunków lub odwrócenia dowolnego z trzech wymiarów pola magnetycznego. Jednak konstrukcja cewek nie pozwala na generowanie dużego natężenia pola magnetycznego. Dlatego ten instrument w obecnej formie nie nadaje się do eksperymentów mających na celu ocenę wpływu wysokiego natężenia pola magnetycznego na rośliny lub inne organizmy.

W laboratorium zmiany GMF podobne do opisanych w tej metodzie uzyskano różnymi metodami, w tym ekranowaniem poprzez otoczenie strefy doświadczalnej ferromagnetycznymi płytkami metalowymi o wysokiej przepuszczalności magnetycznej, które odchylają pola magnetyczne i koncentrują je w samym metalu. Zaletą stosowania cewek Helmholtza jest to, że system pozwala roślinom na bardziej naturalne warunki (światło, cyrkulacja powietrza itp.), dzięki czemu idealnie nadaje się nie tylko do badań in vitro (jak w przypadku stosowania szalek Petriego), ale także do eksperymentów in vivo dotyczących wzrostu i rozwoju roślin. Wymiary naszego systemu tworzą przestrzeń, która pozwala na tłumienie do <1/1000 naturalnej GMF w sferycznej objętości 25 x 25 x 25 cm3 (patrz rysunek 1A), co pozwala na umieszczenie kilku szalek Petriego lub kilku małych doniczek do wzrostu roślin.

Przedstawiona tutaj metoda została zastosowana do badań biologii roślin; jednak system pozwala na szeroki zakres eksperymentów, w tym wirusologię i mikrobiologię, a także badania na nicieniach (np. Caenorhabditis elegans), stawonogach i małych zwierzętach (w tym myszach i szczurach). W związku z tym testy hipotezy, że odwrócenie GMF jest w stanie wywołać zmiany morfologiczne i transkrypcyjne, mogą zostać rozszerzone na wiele innych żywych systemów, być może ostatecznie nawet na komórki ludzkie.

GMF stale się zmienia i ulega wahaniom. Dlatego w naszych eksperymentach jednym z głównych wyzwań jest zapewnienie stałej kompensacji GMF w celu uzyskania pożądanych nowych wartości GMF. Można to osiągnąć tylko poprzez ciągłą kontrolę wartości pól magnetycznych poprzez odczyt wartości magnetometru i kompensację napięcia. W związku z tym system może kompensować wolno zmieniającą się część GMF, ale nie robi nic w przypadku wyższych wahań częstotliwości.

Podsumowując, zastosowanie cewek trójosiowych do odwrócenia wektora GMF miało zasadnicze znaczenie dla wykazania, że to odwrócenie wektora GMF jest w stanie wywołać zmiany morfologiczne roślin i zróżnicowaną ekspresję genów. Wyniki uzyskane za pomocą przedstawionej metody dostarczają przekonujących dowodów na poparcie hipotezy, że odwrócenie GMF mogło być jedną z sił napędowych ewolucji roślin w geologicznych skalach czasowych 2.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant dla MEM z Wydziału Nauk Przyrodniczych i Biologii Systemów Uniwersytetu w Turynie, Włochy. Autorzy dziękują G. Gnavi za pomoc techniczną podczas niektórych eksperymentów. CTR jest finansowany przez Wellcome Trust i Royal Society (numer grantu 098436/Z/12/Z).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Magnetometr trójosiowyBartington Mag-03MCtrójosiowy magnetometr fluxgate
Zasilacz magnetometruBartington Mag-03PSUtrójosiowy magnetometr z bramką strumienia
Oprogramowanie magnetometruBartington Mag03DAMtrójosiowy magnetometr fluxgate
Zasilanie prądem stałym Agilent TechnologiesE3642A
Podchloryn wapnia Sigma211389
Triton X-100 SigmaX100 
Alkohol etylowy Sigma2860
GroLux Lampy sodowe Zestaw OSRAM Sylvania600W
RNeasy Plant RNA Qiagen74903
DNaza bez RNaz Qiagen79254
Bioanalizator Agilent 2100Agilent TechnologiesG2938B
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientificniedostępny
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności Applied Biosystems4368813
Mx3000PAgilent Technologies401512
2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix Fermentas International, IncK0221
ParafilmSigmaP7793-1EA
Murashige i Skoog Basal Medium SigmaM5519 
Szalka Petriego kwadrat (120 x120 mm2)SigmaZ692344 

Bibliografia

  1. Maffei, M. E. Magnetic field effects on plant growth, development, and evolution. Front. Plant Sci. 5, (2014).
  2. Occhipinti, A., De Santis, A., Maffei, M. E. Magnetoreception: an unavoidable step for plant evolution. Trends Plant Sci. 19 (1), 1-4 (2014).
  3. Harris, S. R., et al. Effect of magnetic fields on cryptochrome-dependent responses in Arabidopsis thaliana. J. Royal Soc. Interf. 6 (41), 1193-1205 (2009).
  4. Phirke, P. S., Kubde, A. B., Umbarkar, S. P. The influence of magnetic field on plant growth. Seed Sci. Technol. 24 (2), 375-392 (1996).
  5. Abe, K., Fujii, N., Mogi, I., Motokawa, M., Takahashi, H. Effect of a high magnetic field on plant. Biol. Sci. Space. 11, 240-247 (1997).
  6. Volpe, P. Interactions of zero-frequency and oscillating magnetic fields with biostructures and biosystems. Photochem. Photobiol. Sci. 2 (6), 637-648 (2003).
  7. Belyavskaya, N. A. Biological effects due to weak magnetic field on plants. Adv. Space. Res. 34 (7), 1566-1574 (2004).
  8. Weber Bittl, R., S, Transient radical pairs studied by time-resolved EPR. Biochim. Biophys. Acta- Bioenerg. 1707 (1), 117-126 (2005).
  9. Pazur Galland, P., A, Magnetoreception in plants. J. Plant Res. 118 (6), 371-389 (2005).
  10. Minorsky, P. V. Do geomagnetic variations affect plant function. J. Atm. Solar-Terrestr. Phys. 69 (14), 1770-1774 (2007).
  11. Burda Vanderstraeten, J., H, Does magnetoreception mediate biological effects of power-frequency magnetic fields. Sci. Tot. Environ. 417, 299-304 (2012).
  12. Job, C., Rajjou, L., Lovigny, Y., Belghazi, M., Job, D. Patterns of protein oxidation in Arabidopsis seeds and during germination. Plant Physiol. 138 (2), 790-802 (2005).
  13. Wan, L. L., Ross, A. R. S., Yang, J. Y., Hegedus, D. D., Kermode, A. R. Phosphorylation of the 12 S globulin cruciferin in wild-type and abi1-1 mutant Arabidopsis thaliana (thalecress) seeds.. Biochem J. 404, 247-256 (2007).
  14. Sancenon, V., Puig, S., Mira, H., Thiele, D. J., Penarrubia, L. Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 51 (4), 577-587 (2003).
  15. Foyer, C. H., Karpinska, B., Krupinska, K. The functions of Whirly1 and Redox-Responsive Transcription Factor 1 in cross tolerance responses in plants: A hypothesis. Philos.Trans.Royal Soc.B-Biol.Sci. 369 (1640), 20130226(2014).
  16. Myouga, F., et al. A heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (11), 3148-3162 (2008).
  17. Mhamdi, A., Queval, G., Chaouch, S., Vanderauwera, S., Van Breusegem, F., Noctor, G. Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models. J. Exper. Bot. 61 (15), 4197-4220 (2010).
  18. Bassham Contento, A. L., C, D. Increase in catalase-3 activity as a response to use of alternative catabolic substrates during sucrose starvation. Plant Physiol. Biochem. 48 (4), 232-238 (2010).
  19. Kangasjarvi, S., et al. Diverse roles for chloroplast stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidases in plant stress responses. Biochem. J. 412, 275-285 (2008).
  20. Begara-Morales, J. C., et al. Dual regulation of cytosolic ascorbate peroxidase (APX) by tyrosine nitration and S-nitrosylation. J. Exper. Bot. 65 (2), 527-538 (2014).
  21. Li, N., et al. AtrbohD and AtrbohF negatively regulate lateral root development by changing the localized accumulation of superoxide in primary roots of Arabidopsis. Planta. 241 (3), 591-602 (2014).
  22. Skoog Murashige, T., F, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
  23. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nuc. Acids Res. 29 (9), (2001).
  24. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  25. Phillips, M. A., D'Auria, J. C., Luck, K., Gershenzon, J. Evaluation of candidate reference genes for real-time quantitative PCR of plant samples using purified cDNA as template. Plant Mol. Biol. Rep. 27 (3), 407-416 (2009).
  26. Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).
  27. Tsukaya, H. Developmental genetics of leaf morphogenesis in dicotyledonous plants. J. Plant Res. 108 (1092), 407-416 (1995).
  28. Szymanowska-Pulka, J. Form matters: morphological aspects of lateral root development. Ann. Bot. 112 (9), 1643-1654 (2013).
  29. Black Bewley, J. D., Seeds, M. Physiology of development and germination. , Plenum Press. New York. (1994).
  30. Kato-Noguchi, H., Ota, K., Kujime, H., Ogawa, M. Effects of momilactone on the protein expression in Arabidopsis germination. Weed Biol. Manage. 13 (1), (2013).
  31. Khandelwal, A., Elvitigala, T., Ghosh, B., Quatrano, R. S. Arabidopsis transcriptome reveals control circuits regulating redox homeostasis and the role of an AP2 transcription factor. Plant Physiol. 148 (4), 2050-2058 (2008).
  32. Haddad, J. J. Oxygen-sensing mechanisms and the regulation of redox-responsive transcription factors in development and pathophysiology. Respirat. Res. 3 (1), (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Odwr cenie pola geomagnetycznegocewki Helmholtzaanaliza ekspresji gen wpomiar wzrostu ro linilo ciowa PCR w czasie rzeczywistymanaliza d ugo ci korzenipomiar powierzchni li ciekspozycja na pole magnetycznenormalizacja wzgl dem genu referencyjnego

Powiązane artykuły