Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Summary

Oferujemy nowatorską strategię izolowania przedziałów replikacyjnych wirusa (RC) od komórek ludzkich zakażonych adenowirusem (Ad). Podejście to reprezentuje system bezkomórkowy, który może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych regulujących replikację i ekspresję genomu wirusa, a także regulację interakcji wirus-gospodarz ustalonych w RC.

Abstract

Podczas infekcji komórek ludzkich adenowirusem (Ad), jądro komórki gospodarza ulega radykalnej reorganizacji, co prowadzi do powstania mikrośrodowisk jądrowych poprzez rekrutację białek wirusowych i komórkowych do miejsc zajmowanych przez genom wirusa. Miejsca te, zwane przedziałami replikacyjnymi (RC), można uznać za domeny jądrowe indukowane przez wirusa, w których genom wirusa jest zlokalizowany, a białka wirusowe i komórkowe, które uczestniczą w replikacji, transkrypcji i przetwarzaniu potranskrypcyjnym, są rekrutowane. Co więcej, białka komórkowe biorące udział w odpowiedzi przeciwwirusowej, takie jak białka supresorowe nowotworu, składniki odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR) i wrodzone czynniki odpowiedzi immunologicznej, są również dokooptowane do RC. Chociaż wydaje się, że RC odgrywają kluczową rolę w promowaniu skutecznego i produktywnego cyklu replikacji, nie przeprowadzono szczegółowej analizy ich składu i powiązanych działań. Aby ułatwić badanie adenowirusowych RC i potencjalnie tych z innych wirusów DNA, które replikują się w jądrze komórkowym, dostosowaliśmy prostą procedurę opartą na gradientach prędkości do wyizolowania Ad RC i stworzyliśmy system bezkomórkowy zdolny do prowadzenia badań morfologicznych, funkcjonalnych i składowych tych indukowanych przez wirusa struktur subjądrowych, a także do badania ich wpływu na interakcje gospodarz-komórka.

Introduction

Adenowirusy zawierają dwuniciowy genom DNA, który replikuje się w zainfekowanym jądrze komórkowym. Kiedy wirusowe DNA dostanie się do jądra, lokalizuje się w sąsiedztwie ciał jądrowych PML¹. Po wczesnej ekspresji genów wirusa, architektura jądrowa ulega radykalnej reorganizacji, indukując tworzenie mikrośrodowisk wirusa, zwanych przedziałami replikacji wirusa (RC)². Ponieważ adenowirus (Ad) RC jest miejscem, w którym zachodzi replikacja genomu wirusa i ekspresja późnych genów wirusa, zapewniają one środowisko do rekrutacji wszystkich niezbędnych czynników wirusowych i komórkowych, które uczestniczą w tych procesach. Co ciekawe, różne białka komórkowe odpowiedzialne za komórkową odpowiedź przeciwwirusową, takie jak odpowiedź na uszkodzenie DNA, wrodzona odpowiedź immunologiczna i supresja guza, są dokooptowane do tych miejsc wirusowych². W związku z tym Ad RC można uznać za ośrodki regulacyjne, które promują wydajną replikację wirusa, jednocześnie regulując komórkową odpowiedź przeciwwirusową, co wskazuje, że struktury te są kluczem do zrozumienia interakcji między komórkami wirusa-gospodarza. Niemniej jednak molekularne mechanizmy powstawania RC, ich skład i związane z nimi działania są słabo poznane.

Adenowirusowy RC, jak również RC z innych wirusów DNA, które replikują się w jądrze, nie są związane z błonami, w przeciwieństwie do cytoplazmatycznego RC³. Co więcej, te indukowane przez wirusa struktury prawdopodobnie składają się wyłącznie z białek i kwasów nukleinowych. RC utworzone w komórkach zakażonych wirusami RNA (zwykle nazywanych fabrykami wirusów) zostały wyizolowane, wykorzystując ich lokalizację cytoplazmatyczną i status związany z błoną, co ułatwiło ich szczegółową charakterystykę morfologiczną, funkcjonalną i biochemiczną⁴.

O ile nam wiadomo, wirusowe RC jądrowe nie zostały wyizolowane, być może ze względu na złożoność architektury jądrowej i brak wewnątrzjądrowych membran, które ułatwiałyby ich izolację. Ich badania opierały się na mikroskopii immunofluorescencyjnej, FISH i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Jednak pomimo komplikacji związanych z izolacją struktur subjądrowych, inne domeny jądrowe, takie jak jąderka i ciała Cajala, zostały wyizolowane przed ^5,6. Ponieważ jąderka i RC składają się z białek i kwasów nukleinowych i mają średnicę od 0,5 do 5 μm, postawiliśmy hipotezę, że RC powinien być również podatny na izolację. Dlatego, aby dokładniej scharakteryzować skład molekularny i funkcje związane z RC, opracowaliśmy nowatorską metodę izolowania frakcji subjądrowych wzbogaconych o RC. W tym celu przygotowaliśmy frakcje subjądrowe przy użyciu gradientów prędkości i poduszek sacharozowych, podobnie jak w procedurach stosowanych do izolowania jąderek⁷ lub innych domen jądrowych⁶ i stworzyliśmy system bezkomórkowy, który umożliwia badanie składu molekularnego i związanych z nim aktywności RC. Technika ta powinna zatem przyczynić się do lepszego zrozumienia interakcji między wirusem a komórkami gospodarza i stanowi potężne narzędzie, które powinno również ułatwić szczegółową analizę RC z innych wirusów, które replikują się w jądrze i indukują tworzenie przedziałów replikacyjnych o rozmiarach podobnych do tych, które powstają w komórkach zakażonych adenowirusem, takich jak herpeswirusy, wirusy brodawczaka lub poliomawirusy.

Protocol

1. Hodowla komórkowa HFF i ad-infekcja

1. Rozmnażaj wirusa Ad5 WT w monowarstwach komórek HEK-293 i mianuj jako jednostki tworzące fluorescencje (FFU) na komórkach HFF, jak opisano wcześniej⁸.
2. Hoduj ludzkie fibroblasty napletka (HFF) w 10 ml DMEM/10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w sterylnej hodowli na 100 mm szalkach w temperaturze 37 ºC i 5% CO₂ w wilgotnym inkubatorze. Określ liczbę komórek za pomocą komory Neubauera, licząc komórki w czterech zestawach 16-kwadratowych. Liczbę komórek na ml uzyskuje się, obliczając średnią liczbę komórek w czterech zestawach 16-kwadratowych i mnożąc tę liczbę przez 10⁴. Za każdym razem, gdy jest to możliwe po infekcji, o którym mowa w kroku 1.3, należy użyć komórek HFF 1 x 10⁷
.
3. Próbne zakażenie lub zakażenie komórek HFF adenowirusem typu 5 (Ad5) typu dzikiego (WT) (H5pg4100⁸) w 100-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowych przy użyciu 1 ml Ad5 w DMEM na szalkę przy MOI wynoszącym 30 jednostek formujących ognisko lub FFU na komórkę. Inkubować przez 2 godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 ºC i 5% CO_{2 ,} ostrożnie kołysząc szalkami co 15 minut, aby zapewnić jednorodne rozmieszczenie inokulum wirusa w komórkach. Po tym czasie usunąć pożywkę i dodać świeży DMEM uzupełniony 10% FBS i inkubować przez 16, 24 lub 36 godzin w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 ^ºC i 5% CO₂ . Przejdź do kroku 2.1.

2. Przygotowanie frakcji subjądrowych wzbogaconych o Adenovirus RC

1. Zebrać zakażone Ad5 lub pozorowane zakażone komórki HFF za pomocą skrobaka do komórek i zebrać komórki w sterylnych probówkach wirówkowych. Określ numer komórki jak w kroku 1.2. Użyj 1 x 10⁷ komórek za każdym razem po infekcji określonym w kroku 1.3.
2. Odwirować komórki w temperaturze 220 x g, 4 °C przez 5 min.
3. Ponownie zawiesić osad ogniwa w lodowatym PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ i 1,8 mM KH₂PO₄). Umyj granulki komórkowe 3 razy, używając 5 ml lodowatego PBS na pranie. W tym celu odwirować komórki w temperaturze 220 x g, w temperaturze 4 °C przez 5 minut, zdekantować i wyrzucić supernatant (SN), a następnie ponownie zawiesić osad komórek przez delikatne pipetowanie.
4. Aby przerwać błonę plazmatyczną, należy ponownie zawiesić osad komórkowy w 700 μl lodowatego buforu hipotonicznego (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,5 mM DTT, 20 μg/ml fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), mieszaniny inhibitorów cysteiny, seryny, treoniny i proteazy aspartylowej, w tym 10 μg/ml bydlęcego inhibitora trypsyny trzustkowej, 10 μg/ml pepstatyny A i 10 μg/ml N-acetylo-L-leucylo-L-leucylo-L-argininal) i pozostawić komórki pęczniejące na lodzie przez 3 godziny.
5. Lizować komórki za pomocą homogenizatora z luźno dopasowanym tłuczkiem teflonowym typu A. Wykonaj 80 uderzeń i monitoruj próbki co 20 pociągnięć za pomocą mikroskopii jasnego pola, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały poddane lizie, ale jądra nie zostały uszkodzone lub pęknięte.
6. Odwirować homogenat komórkowy w temperaturze 300 x g, 4 °C przez 5 minut. Przechowywać SN jako frakcję cytoplazmatyczną w temperaturze -20 °C w probówce wirówkowej.
7. Aby usunąć resztki komórkowe z jąder, należy ponownie zawiesić osad w 750 μl roztworu 1 (S1) (0,25 M sacharozy, 10 mM MgCl₂ 20 μg/ml PMSF, mieszaniny cysteiny, seryny, treoniny i inhibitorów proteazy aspartylowej, w tym 10 μg/ml bydlęcego inhibitora trypsyny trzustkowej, 10 μg/ml pepstatyny A i 10 μg/ml N-acetylo-L-leucylo-L-leucylo-L-argininal) i nałożyć warstwę na równą objętość roztworu 2 (S2) (0,35 M sacharozy, 0,5 mM MgCl_2, 20 μg/ml PMSF, mieszaninę inhibitorów cysteiny, seryny, treoniny i proteazy aspartylowej, w tym 10 μg/ml bydlęcego inhibitora trypsyny trzustkowej, 10 μg/ml pepstatyny A i 10 μg/ml N-acetylo-L-leucylo-L-leucylo-argininal). Wirować w temperaturze 1 400 x g, 4 ºC przez 5 min.
8. Wyrzucić SN za pomocą mikropipety. Unikaj naruszania pelletu.
9. Zawiesić osad zawierający izolowane jądra w 750 μl S2.
10. Aby wyizolować frakcje subjądrowe wzbogacone adenowirusem RC (RCf), należy sonicyjnie zawiesić jądra za pomocą kąpieli ultradźwiękowej, używając dwóch 5-minutowych impulsów lub do momentu, gdy wszystkie jądra zostaną zizowane, jak zaobserwowano za pomocą mikroskopii jasnego pola. W razie potrzeby należy użyć lodu w kąpieli ultradźwiękowej, aby utrzymać próbki w temperaturze 4 °C lub niższej.
11. Warstwy sonikowanych jąder na równej objętości roztworu 3 (S3) (0,88 M sacharozy, 0,5 mM MgCl₂) i odwirować przy 3 000 x g, 4 ºC przez 10 minut. Przechowywać 1,5 ml supernatantu jako frakcję nukleoplazmatyczną (Npl) w temperaturze -70 °C. Zawiesić osad w 700 μl S2 i przechowywać jako RCf w temperaturze -70 °C.

3. Analizy Western Blot RCf

UWAGA: Do analizy Western Blot frakcji Npl i RCf należy odłożyć 640 μl dla Npl i 300 μl dla RCf z całkowitej objętości uzyskanej w kroku 2.11.

1. Zmieszać 15 μl każdej frakcji subjądrowej w buforze Laemmli 2x (4% SDS, 20% glicerol, 10% 2-merkaptoetanol, 0,004% błękitu bromofenolowego, 0,125 M Tris HCl pH 6,8) i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Załadować próbki do 10% żelu denaturującego do elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z 10% dodecylosiarczanem siarczanu sodu (SDS-PAGE) i oddzielić białka przez 1,5 godziny, przy 20 miliamperach (mA).
2. Przenieś białka przez elektroblotowanie przez 1,5 godziny w temperaturze 400 mA na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF).
3. Zablokuj membranę na 2 godziny w temperaturze pokojowej, używając 3% odtłuszczonego mleka w proszku w PBS.
4. Inkubować O/N w temperaturze 4 ºC z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko wirusowemu białku wiążącemu DNA E2A (B6-8⁹) w rozcieńczeniu 1:500 w PBS/0,3% odtłuszczonym mleku w proszku.
5. Umyj membranę 3 razy za pomocą PBS/0,1% Tween 20 przez 10 min.
6. Inkubować błonę z mysim przeciwciałem drugorzędowym anty IgG sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) w rozcieńczeniu 1:10 000 w PBS przez 2 godziny w RT.
7. Umyj membranę 3 razy za pomocą PBS/0,1% Tween 20 przez 10 minut.
8. Wywołaj membranę przy użyciu ulepszonej chemiluminescencji i filmów rentgenowskich.

4. Wykrywanie wirusowego DNA w RCf

UWAGA: Do izolacji DNA zarówno z frakcji Npl, jak i RCf, użyj 210 μl dla Npl i 100 μl dla RCf całkowitej objętości uzyskanej w kroku 2.11.

1. Inkubować frakcje subjądrowe przez 1 godzinę w temperaturze 55 ºC z 1 mg/ml proteinazy K i 0,5% Tween 20.
2. Dezaktywować proteinazę K przez inkubację próbek przez 10 minut w temperaturze 95 °C.
3. Odwirować próbki przy 20 000 x g, w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
4. Zbierz numer seryjny. Wytrącić DNA w 1/10 objętości 3M octanu sodu i jednej objętości izopropanolu, O/N w temperaturze 4 °C.
5. Odwirować próbki przy masie 20 000 x g, w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
6. Wyrzucić SN za pomocą mikropipety. Przemyć granulat 70% etanolem i odwirować w temperaturze 20 000 x g, 4 °C przez 5 minut.
7. Ponownie zawiesić DNA w 10 μl 10 mM Tris-HCl pH 7,4
8. Określić ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru, mierząc gęstość optyczną (OD) przy 260 nm.
9. Aby amplifikować DNA wirusa, należy użyć 100 ng DNA z każdej frakcji subjądrowej w standardowej reakcji PCR z użyciem polimerazy DNA Taq w 25 μl objętości reakcji ze starterami, które umożliwiają amplifikację regionu w jednostce transkrypcji Major Late, od nukleotydu 7273 do nukleotydu 7353 (81 pz) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Rv: GGATGCGACGACACTGACTTCA). Stosować następujące warunki cyklu: początkowa denaturacja przez 3 minuty w temperaturze 95 ºC, a następnie 20 cykli amplifikacji (1 min w temperaturze 95 °C, wyżarzanie przez 1 minutę w temperaturze 62 ºC i przedłużenie przez 30 sekund w temperaturze 72 ºC) i końcowy etap przedłużania przez 3 minuty w temperaturze 72 ºC.
10. Uruchom produkt PCR w 2% żelach agarozowych, pod napięciem 90 V. Wybarwić bromkiem etydyny w końcowym stężeniu 0,5 μg/ml i zobrazować DNA, aby potwierdzić wzbogacenie wirusowego DNA w RCf. Z bromkiem etydyny należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością i zawsze należy nosić rękawiczki, ponieważ związek ten jest silnym mutagenem. Bromek etydyny należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji.

5. Późne wykrywanie wirusowego mRNA w RCf

UWAGA: Do izolacji RNA zarówno z frakcji Npl, jak i RCf, użyj 640 μl dla Npl i 300 μl dla RCf z całkowitej objętości uzyskanej w kroku 2.11.

1. Wyizolować RNA z frakcji subjądrowych za pomocą Trizolu zgodnie z instrukcjami producenta. Ponownie zawiesić RNA w 50 μl wody uzdatnionej DEPC (ditylpirowęglanem).
2. Określić ilościowo RNA za pomocą spektrofotometru w celu zmierzenia OD przy 260 nm (otrzymuje się około 3 μg). Przechowywać RNA w podwielokrotnościach o stężeniu 50 ng/μl w temperaturze -70 °C.
3. Sprawdzić oczyszczone RNA pod kątem braku zanieczyszczenia DNA, przeprowadzając kontrolną reakcję PCR przy braku odwrotnej transkryptazy (RT), używając 5 ng całkowitego RNA i w warunkach cyklu opisanych w kroku 4.9.
   1. Jeśli zanieczyszczenie DNA nie jest obecne, nie należy wytwarzać amplikonu. Jeśli występuje zanieczyszczenie DNA, należy inkubować próbki z 10 U DNazą I, 10 U inhibitora Rnazy, 0,1 M Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M KCl i 15 mM MgCl₂ przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przystąpić do ponownej izolacji RNA, jak w kroku 5.1.
4. Aby przeanalizować mRNA wirusa związane z RCf, amplifikuj 100 ng RNA z każdej frakcji subjądrowej za pomocą RT-PCR przy użyciu starterów przeznaczonych do wykrywania adenowirusowego późnego mRNA z różnych rodzin genów (Tabela 1).
   1. Do odwrotnej transkrypcji (RT) należy użyć 100 ng RNA z każdej frakcji subjądrowej w standardowej reakcji RT z użyciem enzymu M-MuLV RT w 20 μl objętości reakcji przez 1 godzinę w temperaturze 42 ºC i 10 minut w temperaturze 70 ºC.
   2. Do amplifikacji należy użyć 1 μl cDNA w reakcjach PCR, jak w kroku 4.9. Stosować następujące warunki cyklu: początkowa denaturacja przez 3 minuty w temperaturze 95 °C, a następnie 25 cykli amplifikacji (1 min w temperaturze 95 °C, wyżarzanie przez 1 minutę w temperaturze określonej w tabeli 1 i przedłużenie przez 30 sekund w temperaturze 72 °C) i końcowy etap przedłużania przez 3 minuty w temperaturze 72 °C.
5. Uruchom produkty RT-PCR w 2% żelach agarozowych, przy napięciu 90 V. Zabarwić żele bromkiem etydyny o końcowym stężeniu 0,5 μg/ml i zwizualizować, aby potwierdzić późne asocjację mRNA wirusa z RCf. Postępuj z bromkiem etydyny, jak wskazano w kroku 4.10.

6. Immunofluorescencyjna wizualizacja RCf

UWAGA: Przeprowadź tę procedurę w komorze z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek jakimikolwiek cząstkami pyłu, i przefiltruj wszystkie roztwory przed użyciem.

1. Umieścić 5 μl frakcji RCf otrzymanej w kroku 2.10 bezpośrednio na szkiełku pokrytym silanem.
2. Pozostaw miejsce do wyschnięcia na około 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Ponownie nawodnić się, powoli i pośrednio pipetując 500 μl PBS w kropli obok plamki RCf i pozwalając mu płynąć, przechylając szkiełko. Odcedź nadmiar PBS z boku.
4. Blokować, pokrywając próbkę 500 μl PBS/5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
5. Przemyć szkiełko 3 razy, delikatnie i pośrednio pipetując 500 μl PBS na próbkę. Przechyl suwak, aby odsączyć nadmiar PBS.
6. Inkubować próbkę z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko wirusowemu białku wiążącemu DNA E2A (B6-8⁹) w rozcieńczeniu 1:500 w PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przykryj nakrapianą próbkę 20 μl roztworu przeciwciała i inkubuj w wilgotnej komorze, aby uniknąć wysuszenia.
7. Przemyć próbkę 3 razy za pomocą PBS/0,02% Tween 20, delikatnie i pośrednio pipetując 500 μl PBS na próbkę. Przechyl suwak, aby spuścić nadmiar roztworu myjącego.
8. Inkubować próbki z mysim przeciwciałem drugorzędowym anty IgG sprzężonym z fluoroforem, który jest wzbudzany przy 488 nm w rozcieńczeniu 1:2,000 w PBS, przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Przykryj plamistą próbkę 20 μl roztworu przeciwciała i inkubuj w wilgotnej komorze, aby uniknąć wysuszenia.
9. Przemyć próbkę 3 razy za pomocą PBS/0,02% Tween 20, delikatnie i pośrednio pipetując 500 μl PBS na próbkę. Przechyl suwak, aby spuścić nadmiar roztworu myjącego.
10. Przykryć nakrapianą próbkę na szkiełku nakrywkowym szkiełkiem nakrywkowym, używając 2 μl PBS/10% glicerolu jako podłoża mocującego. Uszczelnij bezbarwnym lakierem do paznokci i przechowuj w temperaturze -20 ºC.
11. Analizuj próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, z obiektywem 63x i aperturą numeryczną 1,4 (NA) przy długości fali 488 nm.

Results

Ponieważ przedziały replikacji wirusa (RC) są subjądrowymi strukturami indukowanymi przez wirusa, składającymi się z białek i kwasów nukleinowych, podobnie jak inne domeny jądrowe, okazały się one podatne na izolację za pomocą gradientów prędkości opartych na cechach biochemicznych. Krytyczne etapy w protokole frakcjonowania przedstawiono na rysunku 1. Na każdym etapie próbki muszą być monitorowane za pomocą mikroskopii jasnego pola, aby zapewnić integralność różnych frakcji subkomórkowych. Na przykład p...

Discussion

Aby wyjaśnić mechanizmy molekularne, które regulują aktywność komórkową przez infekcję wirusową, zrozumienie składu i aktywności związanej z RC byłoby kluczowe. Dlatego, aby przeprowadzić szczegółową analizę RC, stworzyliśmy system bezkomórkowy, który wykorzystuje rozmiar i skład biochemiczny tych struktur indukowanych przez wirusa, aby wyizolować frakcje subjądrowe wzbogacone RC za pomocą prostej procedury, która opiera się na gradientach prędkości z poduszkami sacharozy. Krytyczne etapy procedury, które wymagają standa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	12100-046	Ciepły w 37 º C kąpiel wodna przed użyciem
Płodowa surowica bydlęca	Gibco	12484-028
Sacharoza, Ultra Pure	Research Organics	0928S	Przygotować 2,55 M roztwór podstawowy i przechowywać w temperaturze 4 º
Homogenizator C Dounce	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Wanna ultradźwiękowa	Branson	Z769533  SIGMA	Włącz 15 minut przed użyciem.
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG1 Wtórne, koniugat Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-21121	Stosować w rozcieńczeniu 1:2,000 w szkiełkach PBS
Silane-Prep	Sigma	S4651-72EA	Otwórz w komorze z przepływem laminarnym
SuperSignal West Pico Podłoże chemiluminescencyjne	Pierce ThermoScientific	34080