Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opisywanie zależnej od czynnika transkrypcyjnego regulacji transkryptomu mikroRNA

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53300

⸱

15 czerwca 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology, Davidoff Cancer Center, Rabin Medical Center, 2The Center of Nanoscience and Nanotechnology, Tel Aviv University, 3Experimental Therapeutics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj proponujemy strategię badania wpływu interesującego czynnika transkrypcyjnego na transkryptom mikroRNA, korzystając z publicznie dostępnych danych, zasobów obliczeniowych i danych o wysokiej przepustowości z macierzy mikroRNA po transfekcji komórek z małą spinką do włosów (sh)RNA ukierunkowaną na interesujący czynnik transkrypcyjny.

Streszczenie

Podczas gdy regulacja transkrypcji genów kodujących białka była szeroko badana, niewiele wiadomo na temat tego, jak czynniki transkrypcyjne są zaangażowane w transkrypcję niekodujących RNA, szczególnie mikroRNA. W tym miejscu proponujemy strategię badania potencjalnej roli czynnika transkrypcyjnego w regulacji transkrypcji mikroRNA przy użyciu publicznie dostępnych danych, zasobów obliczeniowych i danych o wysokiej przepustowości. Używamy sygnatury epigenetycznej H3K4me3 do identyfikacji promotorów mikroRNA i danych sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) z projektu ENCODE w celu identyfikacji promotorów mikroRNA, które są wzbogacone o miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych. Poprzez transfekcję komórek będących przedmiotem zainteresowania shRNA ukierunkowanych na czynnik transkrypcyjny będący przedmiotem zainteresowania i poddanie komórek macierzy mikroRNA, badamy wpływ tego czynnika transkrypcyjnego na transkryptom mikroRNA. Jako przykład obrazowy posłużymy się naszym badaniem wpływu STAT3 na transkryptom mikroRNA komórek przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL).

Wprowadzenie

MicroRNA to endogenne małe niekodujące regulatorowe RNA, które zazwyczaj funkcjonują jako negatywne regulatory ekspresji mRNA na poziomie posttranskrypcyjnym. W ludzkim genomie znajduje się około 1000 niekodujących mikroRNA o długości od 20 do 25 nukleotydów 1,2. MikroRNA regulują ekspresję genów poprzez kanoniczne parowanie zasad między sekwencją nasienną mikroRNA a jego komplementarną sekwencją dopasowania nasion, która zwykle znajduje się w regionie 3' nieulegającym translacji (UTR) docelowych mRNA. Łącznie mikroRNA regulują ponad 30% genów kodujących białka 3, ale niewiele wiadomo na temat transkrypcji mikroRNA z DNA. Sugeruje się, że regulacja transkrypcji mikroRNA jest podobna do regulacji mRNA 4,5. W szczególności, podobnie jak w przypadku aktywności w promowaniu transkrypcji genów kodujących białka, uważa się, że czynniki transkrypcyjne aktywują transkrypcję mikroRNA 6. Interakcja czynnika transkrypcyjnego z mikroRNA została opisana jako czynnik modulujący ekspresję genów 7 i może również tworzyć pętle sprzężenia zwrotnego i sprzężenia zwrotnego. Na przykład Yamakuchi i wsp. opisali pętlę sprzężenia zwrotnego, w której p53 indukuje ekspresję mikroRNA34a, co z kolei hamuje translację represora p53 SIRT, zwiększając w ten sposób aktywność p53 8.

Podczas gdy konkretne przykłady ekspresji mikroRNA zależnej od czynnika transkrypcyjnego zostały już przedstawione, brakuje akceptowanej metody, która dostarczałaby informacji o tym, jak interesujący czynnik transkrypcyjny reguluje ekspresję transkryptomu mikroRNA. Celem proponowanego w niniejszym dokumencie protokołu jest zapewnienie dogłębnego opisu zależnej od czynnika transkrypcyjnego regulacji transkryptomu mikroRNA. Łącząc publicznie dostępne dane, narzędzia bioinformatyczne i wykorzystując technologię mikromacierzy, naukowcy, którzy postępują zgodnie z tym algorytmem, będą w stanie uchwycić w skali genomicznej, w jaki sposób dowolny czynnik transkrypcyjny w dowolnym typie komórki reguluje ekspresję transkryptomu mikroRNA i zbadać domniemany wkład czynnika transkrypcyjnego-mRNA w regulację ekspresji mikroRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Identyfikacja miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego w promotorze genów mikroRNA przy użyciu metody eksploracji danych

  1. Przeglądarka genomu Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz (UCSC) umożliwia wyodrębnienie danych sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) wygenerowanych w ramach projektu Encyklopedia elementów DNA (ENCODE).
    1. Otwórz przeglądarkę tabel w przeglądarce genomu UCSC.
    2. Użyj następujących specyfikacji, aby wyodrębnić tabelę: Klad: (Ssaki), genom: (Człowiek), Montaż: (Luty 2009 (GRch37 / hg18)), grupa: (regulacja), ścieżka (TxnFactorChIP), tabela: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), region: (Genom), format wyjściowy (wszystkie geny z wybranej tabeli).
    3. Zapisz dane wyjściowe z wersji 1.1.2 jako plik .txt i w arkuszu kalkulacyjnym.
    4. Sortuj i filtruj według interesującego Cię czynnika transkrypcyjnego (np. STAT2).
  2. Skorzystaj z listy promotorów mikroRNA opartej na sygnaturze epigenetycznej H3K4me3 dostępnej w Baeer i wsp.9. Skopiuj tę listę do pliku .txt.
  3. Aby dopasować się do współrzędnych w ludzkim genomie, zmapuj dane z 1.1 i 1.2 (np. STAT3 wiążące się z domniemanymi promotorami mikroRNA) i określ medianę powinowactwa wiązania za pomocą kodu napisanego w języku Csharp, jak opisano w uzupełniającym pliku kodowania 1.

2. Użyj shRNA, aby obniżyć ekspresję interesującego czynnika transkrypcyjnego

  1. Płytka 1,5 x 106 komórek z 293 ludzkiej linii komórek embrionalnych nerki w 10 cm płytce przy około 50% zbieganiu (DMEM z 10% FBS).
  2. Komórki transfekcyjne z 293 ludzkiej linii komórek zarodkowych nerki z 5 μg lentiwirusa zielonej fluorescencji (GFP) zawierającego shRNA skierowanego do interesującego czynnika transkrypcyjnego oraz z 5 μg wektorów pakowania za pomocą odczynnika do transfekcji dla komórek adherentnych zgodnie z protokołem producenta.
  3. Jako kontrolę, transfekować komórki z 293 ludzkiej linii komórek embrionalnych nerki za pomocą zaszyfrowanego shRNA i wektorów opakowania zgodnie z protokołem producenta.
  4. Przechowywać mieszankę transfekcyjną na komórkach przez 16 godzin (w temperaturze 37 °C, inkubator CO2), a następnie zmienić pożywkę na 10 ml świeżej 10% pożywki DMEM z 10% FBS.
  5. Odczekać 48 godzin po transfekcji, odwirować kulturę komórkową (300 x g, 5 min) i zebrać zakaźny supernatant. Przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy 0,45 μm (25-milimetrowa membrana z octanu celulozy bez środków powierzchniowo czynnych) w celu usunięcia wszelkich pływających komórek.
  6. Zagęścić supernatant i zebrać lentiwirusa za pomocą ultraodśrodkowego urządzenia filtrującego o wartości progowej 100 kDa. Wirować w temperaturze 950 x g przez 30 - 60 minut, aż objętość zostanie zagęszczona do mniej niż 250 μl. Skoncentrowany wirus należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Transfekcja komórek lentiwirusem. Wyjmij zamrożonego lentiwirusa z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmroź do temperatury pokojowej. Przenieś 100 μl supernatantu wirusowego do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
    1. Zwiększyć objętość w probówce do 1 ml za pomocą zredukowanej pożywki surowicy. Dodać bromek heksadimetryny do 1 ml zawiesiny wirusa o końcowym stężeniu 10 ng/ml, delikatnie wymieszać i odstawić mieszaninę na 5 minut.
  8. Odwirować 5 x 106 komórek na każdą transdukcję i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml pożywki zawierającej wirusa. Pozostaw komórki w inkubatorze na 4 - 24 godziny, a następnie dodaj 0,5 ml pożywki z 20% FBS do końcowego stężenia 10% FBS.
  9. Odczekaj od 48 do 72 godzin i wybarwij komórki jodkiem propidyny (PI) i białkiem zielonego fluorescencyjnego (GFP) zgodnie z instrukcjami producenta. Chroń ogniwa przed światłem i użyj sortera FACS do pomiaru szybkości komórek GFP+ / PI-. Ponieważ PI barwi tylko martwą komórkę, wskaźnik ten jest oszacowaniem wydajności transfekcji w żywych komórkach.
  10. Posortuj dodatnią populację komórek do ekspresji GFP (GFP+) za pomocą sortera FACS, jak opisano wcześniej 10.
  11. Użyj Western immune blotting, jak opisano wcześniej 10, aby określić poziomy czynnika transkrypcyjnego będącego przedmiotem zainteresowania przed i po zakażeniu komórek będących przedmiotem zainteresowania (na przykład komórek CLL) wyznaczonymi shRNA.

3. Określ poziom ekspresji transkryptomu mikroRNA w komórkach transfekowanych czynnikiem transkrypcyjnym-shRNA

  1. Wyizoluj RNA za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta.
  2. Oznacz RNA i zhybrydyzuj go do mikromacierzymikroRNA 11.
  3. Określ różnicowo wyrażone mikroRNA w komórkach transfekowanych czynnikiem transkrypcyjnym-shRNA lub z pustymi kontrolami wektorowymi5.
  4. Walidacja wyników mikromacierzy dla mikroRNA o najbardziej zróżnicowanej ekspresji za pomocą PCR 5 w czasie rzeczywistym.

4. Określ nakładanie się podejścia bioinformatycznego i shRNA w opisie transkryptomu zależnego od czynnika transkrypcyjnego

  1. Aby określić oczekiwane i obserwowane proporcje genów mikroRNA, które zawierają miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego w swoich promotorach i zostały obniżone w komórkach transfekowanych czynnikiem transfekcyjnym shRNA, wykonaj następujące czynności:
    1. Uzyskaj stosunek genów, które zawierają interesujący ich czynnik transkrypcyjny w ich promotorze / całkowitym mikroRNA z listy wygenerowanej w 1.3. Ta lista jest oczekiwanym stosunkiem (np. geny mikroRNA z miejscami wiązania STAT3 / całkowita liczba badanych genów mikroRNA = 0,25).
    2. Określ liczbę genów, które zostały obniżone w komórkach transfekowanych czynnikiem transfekcyjnym czynnika transkrypcyjnego shRNA z listy wygenerowanej w 3.3 ORAZ ma czynnik transkrypcyjny interesujących miejsc wiązania z listy wygenerowanej w 1.3. Ta liczba/całkowita liczba genów regulowanych w dół jest obserwowanym stosunkiem (np. geny mikroRNA z miejscami wiązania STAT3/całkowita liczba mikroRNA regulowanych w dół = 0,6).
  2. Użyj statystyk χ2, aby porównać obserwowane i oczekiwane stosunki, które zostały wygenerowane powyżej i określić, czy lista genów, które zostały obniżone w komórkach transfekowanych czynnikiem transkrypcyjnym shRNA, jest wzbogacona o miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego w ich promotorze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

STAT3 jest czynnikiem transkrypcyjnym, który zazwyczaj indukuje transkrypcję genów o działaniu antyapoptotycznym i proliferacyjnym 12. Obecnie nie wiadomo, czy STAT3 wpływa również na transkryptom niekodującego RNA. We wszystkich komórkach CLL STAT3 jest konstytutywnie fosforylowany w obrębie reszt seryny 707 10,13. Fosfoserynowy STAT3 przemieszcza się do jądra komórkowego, wiąże się z DNA i aktywuje geny, które w innych typach komórek są aktywowane przez tyrozynowy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mechanizm leżący u podstaw zależnej od polimerazy RNA II transkrypcji genów kodujących białka został szeroko zbadany. Podczas gdy elementy te stanowią zaledwie 1–2% ludzkiego genomu, dowody uzyskane w ramach projektu ENCODE sugerują, że ponad 80% ludzkiego genomu może podlegać transkrypcji 17 , a to, co reguluje transkrypcję niekodujących elementów DNA, pozostaje w dużej mierze nieznane 6.

Kilka badań, które wykazały, że Pol II jest również odpowiedzialny za transkrypcję ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant od CLL Global Research Foundation. University of Texas MD Anderson Cancer Center jest częściowo wspierany przez National Institutes of Health poprzez Cancer Center Support Grant (P30CA16672).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lipofektamin 2000Life Technologies11668027
0,45 &mikro; m filtr strzykawkowyThermo Scientific (Nalgene)190-2545
Ultraodśrodkowe urządzenie filtrujące Amicon z progiem 100  kDaMerck Millipore
PolybreneMerck MilliporeTR-1003-G
TRIzol odczynnikLife Tachnologies (Invitrogen)15596-026
293 Linia komórkowa ludzkaSigma-Aldrich85120602

Bibliografia

  1. Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
  2. Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  4. Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61(2011).
  5. Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50(2013).
  6. Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
  7. Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
  8. Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
  9. Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
  10. Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
  11. Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
  12. Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
  13. Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
  14. Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
  15. Consortium, E. P. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046(2011).
  16. Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
  17. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
  18. Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
  19. Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279(2009).
  20. Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regulacja czynnik w transkrypcyjnychsygnatura epigenetyczna H3K4me3sekwencjonowanie ChIPtransfekcja shRNAmikromacierze miRNAwyciszenie STAT3przewlek a bia aczka limfocytowawestern blottingilo ciowa RT PCR
Opisywanie zależnej od czynnika transkrypcyjnego regulacji transkryptomu mikroRNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.