In vitro Test do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy

Podsumowanie

Niniejszy raport opisuje test enzymatyczny in vitro do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy przy użyciu ekstraktów z komórek Leishmania. Test ten opiera się na przeniesieniu radioaktywnej grupy metylowej z S-[metylo-3] H]adenozylo-L-metioniny do endogennej fosfatydyloetanoloaminy.

Streszczenie

Metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy są enzymami biosyntetycznymi, które katalizują transfer jednej lub więcej grup metylowych z S-adenozylo-L-metioniny na fosfatydyloetanoloaminę, monometylo-fosfatydyloetanoloaminę, lub dimetylofosfatydyloetanoloaminę, dając monometylo-fosfatydyloetanoloaminę, dimetylo-fosfatydyloetanoloaminę lub fosfatydylocholinę. Enzymy te są wszechobecne w komórkach zwierzęcych, grzybach, a także znajdują się w około 10% bakterii. Pełnią różne ważne funkcje w fizjologii komórki poza ich bezpośrednią rolą w metabolizmie lipidów, takich jak insulinooporność, cukrzyca, miażdżyca, wzrost komórek lub zjadliwość. Niniejszy manuskrypt informuje o prostym, bezkomórkowym teście enzymatycznym, który mierzy transfer trytyowanych grup metylowych z S-[metylo-3] H]adenozylo-L-metioniny do fosfatydyloetanoloaminy przy użyciu ekstraktów z całych komórek jako źródła enzymu. Powstałe metylowane formy fosfatydyloetanoloaminy są hydrofobowe, a zatem można je oddzielić od rozpuszczalnej w wodzie S-[metylo-3] adenozylo-L-metioniny przez ekstrakcję organiczną. Test ten może być potencjalnie zastosowany do dowolnych innych typów komórek i wykorzystany do testowania inhibitorów/leków specyficznych dla metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy będącej przedmiotem zainteresowania bez konieczności oczyszczania enzymu.

Wprowadzenie

Enzymy metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy (PEMT) katalizują kowalencyjne przyłączanie jednej lub więcej grup metylowych za pomocą S-adenozylometioniny (SAM) jako donora grupy metylowej na PE, monometylo-PE lub dimetylo-PE, aby uzyskać monometylo-PE, dimetylo-PE i/lub fosfatydylocholinę (PC). Enzymy te są prawie wszechobecne w komórkach zwierzęcych i grzybach. Można je również znaleźć w niektórych roślinach ¹ i około 10% bakterii, szczególnie tych, które wchodzą w interakcje z eukariontami ².

PEMT są istotne dla biologii komórki, nie tylko przyczyniając się do produkcji PC, która jest główną klasą lipidów w komórkach zwierzęcych, ale także spełniając inne ważne funkcje komórkowe. U ssaków PEMT ulegają ekspresji głównie w wątrobie, gdzie są niezbędne do prawidłowego wydzielania lipoprotein o bardzo niskiej gęstości, a także przyczyniają się do otyłości wywołanej dietą ³, miażdżycy ⁴ i insulinooporności ⁵. Dodatkowo PEMT ssaków ulega również ekspresji w adipocytach, choć do niższych poziomów, i uczestniczy w odkładaniu tłuszczu ^6,7. Wykazano również rolę PEMT w rozwoju raka ⁸, apoptozie ⁹ i wzroście komórek ¹⁰. Wykazano, że u bakterii enzymy PEMT są ważne dla prawidłowego wzrostu komórek ², wirulencji ² i symbiozy z rośliną żywicielską ¹¹.

Celem i uzasadnieniem obecnego protokołu jest pomiar aktywności PEMT z ekstraktów z całych komórek bez potrzeby oczyszczania enzymu. Opracowano dwa odrębne protokoły pomiaru aktywności PEMT. Pierwszy i najpowszechniejszy polega na przeniesieniu trytytowanej grupy metylowej z radioaktywnego SAM na PE, co jest tematem tego artykułu. Protokół ten został pierwotnie opracowany do pomiaru aktywności PEMT z komórek drożdży ¹² i ssaków (wątroby) ¹³ w celu zrozumienia biosyntezy PC w tych komórkach, a także określenia specyficzności tych enzymów. Później technika ta została zastosowana do innych typów komórek, takich jak bakterie ² (przy użyciu podstawowej wartości pH dla testu ¹⁵) i pasożytnicze pierwotniaki ¹⁴. Technika ta może być stosowana zarówno z ekstraktami z całych komórek, jak i z oczyszczonym enzymem, i potencjalnie może być stosowana do dowolnego systemu ekstrakcji komórek. Zaprojektowano również test nieradioaktywny, który opiera się na enzymatycznym oznaczaniu ilościowym S-adenozylohomocysteiny, produktu transmetylacji SAM ¹⁶. Ten drugi test może być wygodniejszy, ponieważ nie obejmuje radioaktywności, ale nadaje się tylko do oczyszczonych enzymów.

Protokół

1. Przygotowanie ekstraktu komórkowego

1. Hoduj komórki Leishmania w sterylnej plastikowej butelce zamkniętej hermetyczną nakrętką w temperaturze 26 ºC w pożywce wykonanej z 1x M199 uzupełnionej 20 mM HEPES pH7,4, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 5 μg/ml hemu, 0,35 g/L NaCO₂H, 0,1 mM adeniny i 2 μg/ml biopteryny bez wstrząsania. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 1 500 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, gdy osiągną gęstość komórek 1-2 x 10⁷/ml.
2. Odrzucić supernatant pipetą i przemyć komórki poprzez ponowne zawieszenie osadu komórkowego za pomocą pipety serologicznej w połowie objętości kultury soli fizjologicznej buforowanej zimnymi fosforanami (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO_4, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4). Supernatanty komórkowe należy utylizować zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa BL2.
3. Ponownie odwirować komórki w temperaturze 1 500 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad za pomocą pipety. Przejdź do następnego kroku lub zatrzaskowo zamroź osad komórkowy w ciekłym azocie do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 ºC (do trzech miesięcy).
4. Przygotuj 2x bufor do lizy (0,5 M sacharozy, 0,1 M TrisHCl, pH 7,5, 2 mM EDTA i 2x koktajl inhibitorów proteazy) i utrzymuj go w temperaturze 4 ºC na lodzie.
5. Ponownie zawiesić osad komórkowy (świeży lub zamrożony) w równej objętości 2x buforu do lizy. Dodaj 1x objętość szklanych koralików. Wirować energicznie w temperaturze 4 ºC przez 10 min.
6. Dodaj 2 objętości 1x buforu do lizy i wymieszaj. Odwirować ekstrakty komórkowe w temperaturze 1 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu osadzenia nieuszkodzonych komórek i jąder.
7. Przenieść supernatant za pomocą pipety do świeżej, chłodnej probówki wirówkowej i przechowywać ekstrakty komórkowe na lodzie aż do zakończenia doświadczenia.

2. Określ stężenie białka w ekstrakcie komórkowym za pomocą zestawu do oceny białka, takiego jak test kwasu bicunchoninowego

1. Przygotować roztwór kwasu bicinchoninowego (BCA) (1 ml/probówkę), mieszając BCA i siarczan miedzi (II) w stosunku 49:1 (v/v).
2. Przygotować wzorce białka 0, 10, 20, 30, 40, 50 i 60 μg/ml, rozcieńczając roztwór podstawowy albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 10 mg/ml w 1 ml podwielokrotności roztworu BCA.
3. Dodać 2 μl ekstraktów komórkowych w 1 ml roztworu BCA w dwóch egzemplarzach. Roztwory wzorcowe i próbki białka inkubować przez 10 minut w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C.
4. Przenieść próbki do lodu na 3 minuty. Zmierzyć absorbancję wzorców i próbek białek za pomocą spektrofotometru o długości fali 562 nm.
5. Obliczyć stężenie białka w ekstraktach komórkowych, stosując wzorzec BSA jako odniesienie, zgodnie z opisem w protokole producenta. Rozcieńczyć ekstrakty komórkowe do stężenia białka 10 mg/ml z 1x buforem do lizy.

3. Test enzymatyczny w 200 μl na probówkę

UWAGA: Wykonaj następujące kroki w kapturze chemicznym.

1. Zbadać każdą próbkę w dwóch egzemplarzach w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Przygotuj 20 μl 1 M TrisHCl pH 7,5 na probówkę i trzymaj na lodzie. Przygotować 2 ml chloroformu/metanolu (roztwór zatrzymujący w stosunku 1:1 (v/v); roztwór zatrzymujący) w temperaturze pokojowej dla każdej probówki.
2. Odpipetować 20 μl 1 M TrisHCl pH 7,5 do każdej stożkowej probówki o pojemności 15 ml na lodzie.
3. Od tego momentu należy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa radiacyjnego. Dodać odpowiednik 0,06 μM (0,2 μCi) S-[metylo-3 H]adenozylo-L-metioniny i 50 μM zimnego SAM na probówkę, co daje w sumie 50,06 μM SAM. Dodać x μl zimnej wody, gdzie x = 200-(20 (dla buforu) + 20 (dla ekstraktów komórkowych) + objętość zimnego i radioaktywnego SAM) na probówkę.
4. Przenieść każdą stożkową rurkę do wstępnie ogrzanej łaźni wodnej o temperaturze 30 °C. Dodać do każdej probówki 20 μl ekstraktów komórkowych (odpowiednik 200 μg białka), aby rozpocząć reakcję. Inkubować przez żądany czas (od 0 do 45 minut).
5. Zatrzymać reakcję, dodając 2 ml chloroformu/metanolu (roztwór zatrzymujący w stosunku 1:1; v/v) do każdej probówki. Przenieść rurkę stożkową do temperatury pokojowej (20-25 ºC).

4. Ekstrakcja lipidów

UWAGA: Wykonaj następujące kroki w kapturze chemicznym.

1. Dodać 700 μl wody do każdej probówki zawierającej próbkę reakcji enzymatycznej. Wiruj energicznie przez 30 sekund. Wirować przy 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia fazy organicznej od wodnej.
2. Przenieść dolną fazę organiczną do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety. Dodać 1 ml wody do każdej "dolnej fazy" zawierającej probówkę i energicznie wirować przez 30 sekund. Ponownie odwirować przy 1 500 x g przez 5 minut, aby oddzielić fazę organiczną od wodnej.
3. Przenieś dolną fazę organiczną do probówki scyntylacyjnej za pomocą pipety. Suszyć próbki pod strumieniem_N2. Fazy wodne zawierające niewbudowany radioaktywny SAM i radioaktywne stożkowe rurki należy usunąć zgodnie z wytycznymi dotyczącymi promieniowania.
4. Dodać 2 ml / probówkę płynu scyntylacyjnego. Zmierzyć wbudowaną radioaktywność za pomocą licznika scyntylacyjnego zgodnie z protokołem producenta i zastosowaniem przyrządu.
5. Obliczyć aktywność enzymatyczną w nmol/mg białka, korzystając z następującego równania ogólnego:
   wartość cpm x 10³ x [całkowite (radioaktywne i zimne) stężenie SAM (mM)] x 5 aktywność właściwa promieniotwórczego SAM (Ci/mmol) x [stężenie radioaktywnego SAM (mM)]
   UWAGA: powyższy protokół może zostać zmieniony dla testu PEMT zależnego od stężenia SAM lub zależnego od białka. W przypadku testu enzymatycznego zależnego od stężenia SAM czas jest utrzymywany na stałym poziomie (15 minut, co mieści się w zakresie liniowym) i do testu dodaje się różne ilości zimnego SAM, podczas gdy w przypadku testu PEMT zależnego od białka stężenie SAM (wybraliśmy 0,05 mM) i czas są utrzymywane na stałym poziomie (15 min). Również pH buforu można zmienić w razie potrzeby, jeśli niektóre enzymy PEMT mają inną optymalną wartość pH.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia zależny od czasu test PEMT, który został przeprowadzony z Leishmania ekstrakt z całych komórek jako źródło enzymu, z wykorzystaniem endogennej PE jako substratu. Ilość radioaktywności w fazie organicznej określono za pomocą licznika scyntylacyjnego. Otrzymane wartości wykorzystano do obliczenia ilości grup metylowych znakowanych trytem, które zostały przeniesione na PE. Aktywność PEMT była liniowa przez około 20 min. Następnie, około 30 min,...

Dyskusja

Ten prosty, szybki test PEMT pozwala na ilościowe określenie metylowanych form PE, które powstają w wyniku przeniesienia radioaktywnych grup metylowych z SAM na PE przy użyciu ekstraktu z całych komórek jako źródła białka. Jest szybki, czuły, powtarzalny, a także nadaje się do oczyszczonych enzymów ¹⁷. Monometylo- lub dimetylo-PE można dodać do testu, jeśli metylotransferaza będąca przedmiotem zainteresowania jest specyficzna dla tych substratów, a nie dla PE ^12,13,18,19. Jeśli stosuje się oczyszczo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
S-[metylo-3H]adenozylo-L-metionina (specyficzna aktywność 5-15 Ci/mMol)	Perkin Elmer	NET155050UC	Podwielokrotną ilość odczynnika i zamrozić w temperaturze -20 ° C; postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa radiacyjnego podczas korzystania z tego odczynnika
Koktajl inhibitorów proteazy	Roche Life Sciences	11836170001	rozcieńczyć go na świeżo
Koraliki szklane, płukane kwasem, 425-600 mm	Sigma Aldrich	G8772
Roztwór kwasu bicunchoninowego	Sigma Aldrich	B9643
Siarczan miedzi (II)	Sigma Aldrich	C2284
Licznik scyntylacyjny MicroBeta2 z 1-detektorem	Perkin Elmer	2450-0010
Spektrofotometr Biomate 3	Thermo Scientific	840208300
roztwór podstawowy BSA (10 mg / ml)	New England Biolabs	B9001S
Ciecz scyntylacyjna	Produkt Badawczy International Corp	111198
Chlorek (chlorowodorku) S-(5'-adenozylo)-L-metioniny	Cayman Chemicals	13956	rozcieńczyć odczynnik w 20 mM HCl i zamrozić podwielokrotności w temperaturze -80 & stopni; C