Ocena przerzutów do płuc w modelach guza sutka myszy za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Podsumowanie

Protokół ten opisuje, jak używać ilościowego PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (QRT-PCR) do wykrywania mRNA specyficznego dla komórek nowotworowych reprezentującego przerzuty w tkance płucnej myszy.

Streszczenie

Choroba przerzutowa to rozprzestrzenianie się złośliwych komórek nowotworowych z głównego miejsca raka do odległego narządu i jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem ¹. Typowe miejsca rozprzestrzeniania się przerzutów to płuca, węzły chłonne, mózg i kości ². Mechanizmy napędzające przerzuty są intensywnymi obszarami badań nad rakiem. W związku z tym skuteczne testy do pomiaru obciążenia przerzutami w odległych miejscach przerzutów mają zasadnicze znaczenie dla badań nad rakiem. Ocena przerzutów do płuc w modelach guza sutka jest na ogół przeprowadzana poprzez ogólną obserwację jakościową tkanki płucnej po sekcji. Ilościowe metody oceny przerzutów są obecnie ograniczone do technik opartych na obrazowaniu ex vivo i in vivo, które wymagają parametrów zdefiniowanych przez użytkownika. Wiele z tych technik odbywa się na poziomie całego organizmu, a nie na poziomie komórkowym ^3-6. Chociaż nowsze metody obrazowania wykorzystujące mikroskopię wielofotonową są w stanie ocenić przerzuty na poziomie komórkowym ⁷, te wysoce eleganckie procedury są bardziej odpowiednie do oceny mechanizmów rozprzestrzeniania się niż ilościowej oceny obciążenia przerzutami. W tym artykule przedstawiono prostą metodę in vitro do ilościowej oceny przerzutów. Za pomocą ilościowego PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (QRT-PCR) można wykryć mRNA specyficzne dla komórek nowotworowych w tkance płucnej myszy.

Wprowadzenie

Analiza QRT-PCR jest proponowana jako metoda oceny przerzutów nowotworowych. Metoda ta jest proponowana jako alternatywa dla użytkowników, którzy są zainteresowani oceną przerzutów, ale mogą nie mieć dostępu do określonego sprzętu, takiego jak sprzęt do obrazowania in vivo lub stereoskop z możliwością fluorescencji. Przedstawiono dyskusję na temat powszechnie stosowanych metod, a następnie zademonstrowano, w jaki sposób analiza QRT-PCR może być stosowana jako oddzielna lub towarzysząca metoda oceny przerzutów. Procedura ta może potencjalnie zapewnić ilościową analizę obciążenia przerzutowego.

Standardowe metody analizy ogólnej, w tym wizualizacja płuc pod mikroskopem stereoskopowym, jak również seryjne sekcje, a następnie barwienie tkanki płucnej hematoksyliną i eozyną (H&E), są policzalne, ale w dużej mierze opierają się na zdefiniowanych przez użytkownika parametrach do liczenia ^2-5. Podczas oceny całych płuc za pomocą mikroskopu stereoskopowego widoczne są tylko przerzuty na dużej powierzchni, a analiza wymaga od badacza rozsądnej wiedzy na temat budowy anatomicznej płuc w celu określenia, co stanowi zmianę przerzutową. Znakowanie fluorescencyjne komórek nowotworowych markerem, takim jak GFP, i użycie mikroskopu stereoskopowego, który zawiera sześcian światła o odpowiednich maksimach wzbudzenia/emisji (np. w pobliżu 470/510 nm dla GFP) pomaga w tym procesie, ale wykrywalne są tylko guzki guzka guza na powierzchni. Dodatkowo fluorescencja z zanieczyszczenia krwi, która jest widoczna przy tych samych parametrach co GFP, może prowadzić do fałszywej identyfikacji ewentualnych zmian przerzutowych.

Cięcie płuca, a następnie barwienie H&E w celu wizualizacji przerzutów do płuc jest użyteczną metodą oceny mikroprzerzutów i innych procesów mikroskopowych, w tym infiltracji komórek odpornościowych, ale często wymaga użycia całej tkanki płucnej do procedur osadzania, cięcia i barwienia parafiny. W związku z tym dalsze procedury nie są idealne po zastosowaniu tej metody. Chociaż procedura ta jest kwantyfikowalna, wymaga od badacza oceny dużej liczby barwionych odcinków płuc na zwierzę, aby upewnić się, że analiza uwzględnia całą strukturę 3D płuc. W związku z tym ten rodzaj badania jest czasochłonny, może prowadzić do błędu liczenia, a analiza w dużej mierze zależy od uznania badacza.

Kilka technik obrazowania in vivo (np. MRI, PET, SPECT) jest obecnie używanych do przeprowadzania lub testowania procesów biologicznych w eksperymentalnych modelach gryzoni ⁸. Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo jest powszechną metodą stosowaną w celu uzyskania ogólnego obrazu przerzutów ⁹. Technika ta jest powszechnie stosowana do oceny obecności aktywności reporterowej lucyferazy z powodu akumulacji komórek nowotworowych, które są zaprojektowane tak, aby zawierały element odpowiedzi lucyferazy, które znajdują się w określonych narządach, takich jak gruczoł sutkowy po implantacji komórek nowotworowych i płuco po spontanicznych przerzutach ¹⁰. Wizualizacja aktywności reporterowej lucyferazy jest indukowana przez obecność substratu lucyferyny (D-lucyferyny). Lucyferazy katalizuje oksydacyjną dekarboksylację D-lucyferyny do oksylucyferyny, generując bioluminescencję. Chociaż metoda ta ma charakter informacyjny, jest ograniczona przez kilka czynników, w tym stabilność substratu (tj. krótki okres półtrwania), odpowiednią dystrybucję substratu, która zależy od sposobu jego dostarczania zwierzętom doświadczalnym, oraz niską czułość wykrywania ⁹. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona nieinwazyjna, może być wykonywana na żywych zwierzętach i może prowadzić do wykrycia przerzutów komórek nowotworowych w wielu narządach, które mogły nie zostać normalnie pobrane podczas sekcji ^9,10.

Pozytywnym aspektem technik obrazowania in vivo jest to, że tkanka płucna jest nienaruszona, co pozwala na wtórne procedury, takie jak zatapianie parafiny lub, jak to tutaj prezentowano, analiza QRT-PCR. Ponieważ jednak QRT-PCR jest teoretycznie bardziej czułą miarą wykrywania, ogólna ocena może nie ujawnić niskiej liczby komórek nowotworowych obecnych w płucach. Opisane powyżej techniki obrazowania, choć przydatne, mogą być zastąpione lub uzupełnione obecnie opisaną metodą QRT-PCR. QRT-PCR może potencjalnie zapewnić czułą miarę mRNA pochodzącego z guza w płucu.

Protokół

Protokół jest zgodny z wytycznymi i standardami opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Medycznego Karoliny Południowej (MUSC) i jego Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).

1. Rozwarstwienie płuc

1. Rozwarstwienie guza sutka (opcjonalne w zależności od celów badania i tego, czy przeprowadzono pierwotną analizę guza, czy wstrzyknięcie żyły ogonowej).
   1. Eutanazja myszy przy użyciu śmiertelnej dawki znieczulenia izofluranem zgodnie z IACUC i przepisami uniwersyteckimi. Potwierdź eutanazję przez chirurgiczne zwichnięcie.
   2. Na płycie piankowej przypiąć szpilki z kołkami preparacyjnymi, kładąc mysz na grzbiecie z rozłożonymi kończynami.
   3. Spryskaj mysz 70% etanolem.
   4. Za pomocą kleszczy chwyć dolną część zwierzęcia pośrodku.
   5. Za pomocą nożyczek przetnij w górę w kierunku szyi przez skórę, uważając, aby nie przebić jamy otrzewnej myszy.
   6. Odetnij skórę na kończynach, aby odsłonić tkankę nowotworową.
   7. Wypreparuj tkankę nowotworową i zachowaj preferowaną metodą, taką jak zamrażanie lub utrwalanie, do dalszej analizy (nie omówione dalej w tym protokole).
2. Rozwarstwienie tkanki płucnej.
   1. Jeśli tkanka nowotworowa została pobrana zgodnie z powyższym opisem, przypnij nadmiar skóry.
   2. Za pomocą kleszczy chwyć otrzewną na dolnym końcu zwierzęcia i zacznij ciąć w górę w kierunku podstawy szyi.
   3. Ostrożnie przeciąć wzdłuż lewej i prawej strony klatki piersiowej, uważając, aby nie przeciąć naczyń krwionośnych, które mogą krwawić do klatki piersiowej. Usuń kości żeber, przecinając w lewo i w prawo przeponę i górną część klatki piersiowej.
   4. Za pomocą kleszczy chwyć tchawicę myszy i pociągnij do przodu.
   5. Odetnij tchawicę nożyczkami preparacyjnymi i usuń płuca myszy.
      Uwaga: Serce może pozostać przyczepione do płuca. Jeśli tak się stanie, ostrożnie wypreparuj serce z dala od płuc, uważając, aby zebrać wszystkie pięć płatów (patrz ryc. 1).
   6. Delikatnie przemyć PBS, aby usunąć nadmiar krwi.
3. Ogólna ocena tkanki płucnej.
   1. Opcja 1: Obrazowanie in vivo.
      1. W przypadku obrazowania lucyferazy, ~ 10 minut przed obrazowaniem, podaj zwierzętom dawkę 150 mg / kg lucyferyny we wstrzyknięciu dootrzewnowym (i.p.). Obraz płuc in vivo u znieczulonych zwierząt lub po usunięciu po sekcji (ryc. 2) ⁵.
   2. Opcja 2: Ocena brutto.
      1. Zbadaj płuca pod mikroskopem stereoskopowym, aby uwidocznić guzki nowotworowe. Uwaga: Jeśli komórki są znakowane GFP, stereomikroskop z możliwością fluorescencji zawierający sześcian świetlny o odpowiednich maksimach wzbudzenia/emisji (np. w pobliżu 470/510 nm) do wykrywania GFP może być użyty do stereoskopowego badania płuc pod kątem fluorescencji przed przetwarzaniem.
   3. Jeśli płuca mają być natychmiast przeanalizowane, przejdź do sekcji "Izolacja RNA". W przeciwnym razie zamroź tkankę za pomocą ciekłego azotu lub suchego lodu. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Izolacja RNA

Uwaga: Dla reprezentatywnej analizy, RNA zostało wyizolowane za pomocą zestawu do izolacji RNA (zobacz Lista materiałów). Podczas gdy obecna analiza wykorzystuje produkt jednego konkretnego producenta, dostępne są różne zestawy izolacyjne od kilku renomowanych dostawców. Dodatkowo opcjonalnie dostępne są również metody wirowania bez zestawu. cDNA należy również przygotować z próbki RNA kontroli dodatniej, takiej jak linia komórkowa lub plazmid, do analizy krzywej standardowej. Alternatywnie można zakupić kontrolę pozytywną specyficzną dla zestawu sond starterowych (patrz Lista materiałów).

1. Jeśli używasz wcześniej zamrożonej tkanki, zbierz zamrożoną tkankę na suchym lodzie.
2. Homogenizuj tkanki przy użyciu jednej z następujących metod, takich jak: mielenie moździerza i tłuczka wykonywane ręcznie na suchym lodzie po zamrożeniu tkanki w ciekłym azocie; homogenizator tkankowy lub mechaniczne urządzenie dysocjujące zgodnie z sugestią producenta; sonikacja lub inna preferowana metoda.
   Uwaga: Do celów analizy reprezentatywnej preferowaną metodą homogenizacji jest sonikacja.
   1. Do analizy przedstawionej na rysunku 3 należy przygotować bufor do lizy (znajdujący się w zestawie do izolacji RNA) i 2-merkaptoetanol w proporcji 20 μl 2-merkaptoetanolu na każdy 1 ml buforu do lizy. Ponownie zawiesić tkankę w buforze do lizy o pojemności 300 μl uzupełnionym 2-merkaptoetanolem na każde 30 g tkanki i sonikować przez 10 sekund za pomocą sonikatora ustawionego na 30% amplitudy.
   2. W przypadku użycia moździerza i tłuczka, po zmieleniu ponownie zawiesić zmieloną tkankę w buforze do lizy o pojemności 300 μl.
3. Dodać 10 μl proteinazy K do 590 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA). Dodać 600 μl roztworu proteinazy K na każde 300 μl (tj. na każde 30 mg) tkanki. Inkubować przez 10 minut w temperaturze RT.
   Uwaga: Czas trawienia może się różnić.
4. Odwirować próbki o masie 13 000 g ≥ przez 10 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń.
5. Przenieść supernatant do nowych probówek.
6. Dodaj 450 μl etanolu (96%-100%) na każde 900 μl supernatantu, aby wytrącić RNA.
7. Przenieść 700 μl mieszaniny lizatu i etanolu do kolumny.
8. Odwirować próbki o masie ≥13 000 g przez 1 minutę w celu związania RNA z kolumną.
9. Wyrzuć odpady płynne i dodaj pozostały supernatant do kolumny i ponownie odwiruj.
10. Po odwirowaniu całego lizatu przez kolumnę dodać 350 μl buforu płuczącego 1 do górnej części kolumny i odwirować próbki o masie ≥13 000 g przez 30 sekund.
11. Wylej płyn z kolumny i zastąp górną część.
12. Przygotować DNazę, mieszając 5 jednostek enzymu DNazy I z 5 μl 10x DNazy i 40 μl wody wolnej od DNazy/RNaz na próbkę (całkowita objętość 50 μl/próbkę).
13. Dodać 50 μl mieszanki DNazy do każdej kolumny i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
14. Dodać 350 μl buforu płuczącego 1 do kolumny i odwirować próbki o masie 13 000 g ≥ przez 30 sekund.
15. Wylej płyn z kolumny i zastąp górną część.
16. Dodać 600 μl buforu płuczącego 2 do kolumny i wirować przez 30 sekund w temperaturze ≥13 000 g.
17. Wylej płyn z kolumny i zastąp górną część.
18. Dodać 250 μl buforu do płukania 2 i wirować przez 2 minuty przy ≥13 000 g.
19. Włóż część kolumny do nowej probówki zbiorczej i wyrzuć starą probówkę zbiorczą.
20. Dodać 50-100 μl wody wolnej od RNaz/DNaz do kolumny i inkubować przez 1 min.
21. Wiruj przez 1 minutę w ≥ 13 000 g.
22. Ponownie uruchom zebrane eluacje przez kolumnę, aby zwiększyć wydajność RNA.
23. W celu natychmiastowego użycia należy przechowywać próbki na lodzie i przystąpić do oznaczania ilościowego. Do późniejszego użycia zatrzaskowo zamrozić na suchym lodzie lub ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C w zamrażarce do czasu, gdy będzie potrzebny.

3. Synteza pierwszej nici

Uwaga: Dla reprezentatywnej analizy, reakcja odwrotnej transkryptazy (RT) została przeprowadzona za pomocą zestawu do syntezy cDNA pierwszej nici przeznaczonego do QRT-PCR (patrz Lista Materiałów).

1. Jeśli próbki zostały wcześniej pobrane, rozmrozić probówki na lodzie.
2. Zmierzyć ilość RNA za pomocą spektrofotometru.
3. Używając 0,5-2 μg całkowitego RNA, przeprowadź syntezę pierwszej nici przy użyciu odwrotnej transkryptazy w celu wygenerowania zapasu cDNA.
   1. W sterylnych probówkach/płytkach do PCR wolnych od RNaz/DNaz przygotować mieszaninę reakcyjną (tabela 1). Delikatnie wymieszaj i odwiruj. Zaprogramować standardową maszynę do PCR (Tabela 2).
4. Rozcieńczyć gotową reakcję do pożądanej objętości (zwykle 50-100 μl) za pomocą sterylnej wody wolnej od nukleaz.

4. PCR w czasie rzeczywistym

Uwaga: Do analizy reprezentatywnej użyto koloru zielonego SYBR. Jednak każda preferowana metoda może zostać zastąpiona według uznania użytkownika.

1. Korzystając z cDNA kontroli pozytywnej, ustaw krzywą wzorcową dla każdego zestawu starterów.
   1. Do analizy pokazanej na rysunku 3 należy przygotować krzywą wzorcową dla ludzkiego HER2, stosując zalecane przez producenta cDNA kontroli dodatniej (patrz Wykaz materiałów). W przypadku mysiego gapdh użyj cDNA płuc kontroli ujemnej, aby wygenerować krzywą standardową. Dla każdej sondy należy seryjnie rozcieńczyć cDNA w stosunku 1:4, aby wygenerować 5 wzorców.
2. Obliczyć całkowitą liczbę próbek, która powinna obejmować krzywą wzorcową i próbki doświadczalne.
   Uwaga: W opisanej tutaj analizie przeanalizowano 2-3 powtórzenia eksperymentalne na próbkę. Przeprowadzono analizę krzywej standardowej w celu wygenerowania prostego modelu regresji liniowej, który można zastosować do określenia względnej ilości HER2 i gapdh na próbkę w celu obliczenia końcowej znormalizowanej ilości. Analiza ta zapewni również, że skuteczność podkładu jest odpowiednia do przeprowadzanej analizy.
3. W sterylnej probówce wolnej od RNaz/DNaz przygotować mieszankę wzorcową (Tabela 3).
   1. Oblicz ilość mieszanki wzorcowej na próbkę. Skalowanie w górę dla więcej niż jednej próbki. Użyj mieszanki głównej dla każdego genu eksperymentalnego będącego przedmiotem zainteresowania, a także kontroli wewnętrznej, takiej jak gapdh. Stosować podkłady do gapdh w końcowym stężeniu 200 nM.
      Uwaga: Kontrola wewnętrzna jest szczególnie przydatna przy próbie rozróżnienia pochodzenia komórek ludzkich i myszy.
      Uwaga: Stężenie podkładu dla HER2 zostało zoptymalizowane i określone przez producenta.
4. Przygotować płytkę testową zawierającą 1 μl cDNA odpowiadającą każdej próbce wzorcowej lub doświadczalnej. Przydziel co najmniej 1 próbkę cDNA / studzienkę dla każdej sondy starterowej. Dodać 19 μl mieszanki wzorcowej na dołek dla każdej sondy startera.
   Uwaga: W przypadku reprezentatywnych danych na rysunku 3, próbki cDNA analizowano w dwóch egzemplarzach dla każdej sondy starterowej i przedstawiono na wykresie jako średnią z dwóch próbek.
5. Uruchom reakcję w maszynie QRT-PCR przy użyciu zalecanego lub wcześniej przetestowanego protokołu PCR. Patrz tabela 4 dla protokołu PCR zastosowanego dla reprezentatywnych danych na rys. 3 i rys. 4.

Wyniki

Poza czasem potrzebnym na przeprowadzenie wstępnej inokulacji komórek nowotworowych zwierzęciu doświadczalnemu i jeśli jest wykonywane, pierwotna analiza guza in vivo, pobieranie tkanek, izolacja RNA i analiza QRT-PCR to procedura trwająca 1-2 dni (Rysunek 1).

Przykładem analizy ogólnej jest obrazowanie bioluminescencyjne w celu oceny komórek nowotworowych w tkance płucnej. W tym przypadku przeprowadzon...

Dyskusja

Protokół ten opisuje zastosowanie QRT-PCR do oceny przerzutów komórek nowotworowych sutka do płuc przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu. Uznaje się, że dostępne są inne techniki, w tym obrazowanie bioluminescencyjne, które są również skuteczne w wykrywaniu przerzutów, mimo że mają swoje własne wartości i ograniczenia. Przedstawione dane sugerują, że QRT-PCR stanowi skuteczną miarę wykrywania mRNA pochodzącego z guza w tkance płucnej w celu ilościowego określenia całkowitych przerzutów. Proponuje się, aby analiza QR...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-merkaptoetanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
Zestaw do izolacji RNA GeneJet	Thermo Scientific	K0732
iScript Supermix z odwrotną transkrypcją do QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
Test PrimePCR SYBR Green: ERBB2, Człowiek	Bio-Rad	100-25636
Szablon PrimePCR do zielonego testu SYBR: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25716
Sekwencja			gapdh dla-ATGGTGAAGGTCGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG