Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Summary

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Abstract

Prezentujemy technikę, która łączy protokół wstrzykiwania znacznika in vitro, który wykorzystuje serię impulsów elektrycznych i ciśnieniowych do zwiększenia absorpcji barwnika poprzez elektroporację w eksplantatach mózgu z ukierunkowanym oświetleniem laserowym i dopasowanymi goglami filtrującymi podczas zabiegu. Opisana technika elektroporacji in vitro sama w sobie daje stosunkowo dobrą kontrolę wzrokową przy celowaniu w określone obszary mózgu. Łącząc to z laserowym wzbudzaniem fluorescencyjnych markerów genetycznych i ich odczytem przez gogle filtrujące przechodzące przez pasmo, które mogą wychwytywać emisje genetycznie znakowanych komórek/jąder i fluorescencyjny barwnik śledzący, badacz może znacznie zwiększyć dokładność wstrzyknięć, znajdując obszar zainteresowania i znacznie skuteczniej kontrolując rozprzestrzenianie się / wychwyt barwnika w obszarze wstrzyknięcia. Ponadto technika oświetlenia laserowego pozwala na badanie funkcjonalności danego obwodu nerwowego poprzez dostarczanie informacji o typie neuronów rzutujących na określony obszar w przypadkach, gdy ekspresja GFP jest związana z typem przekaźnika wyrażanego przez subpopulację neuronów.

Introduction

Aby zdefiniować pewien (mikro)obwód neuronalny, należy zacząć od znalezienia różnych uczestników tego obwodu i ich wzorca połączeń. Od czasu publikacji Wallera na temat śledzenia włókien nerwowych poprzez uszkodzenie¹ ustalono wiele różnych technik śledzenia neuroanatomicznego. Niektóre z tych technik mogą być stosowane w utrwalonej tkance post mortem^2-4, inne polegają na aktywnym transporcie barwnika w żywych neuronach, jak odkryto w 1971 roku^5-6. Te ostatnie można dalej podzielić na dwie grupy, rozróżniając metody wykorzystujące aktywną retrogradację (od wstrzykiwanego obszaru do źródła danej projekcji, czyli somató....

Protocol

1. Genotypowanie optyczne

1. Genotypowanie optyczne szczeniąt myszy

1. Sprawdzić ekspresję odpowiedniego markera fluorescencyjnego za pomocą wskaźnika laserowego o odpowiedniej długości fali wzbudzenia (405 nm w opisanych tutaj doświadczeniach) i odpowiednich gogli filtrujących blokujących długość fali wzbudzenia, ale przechodzących przez długość fali emisyjnej (450 - 700 nm w opisanych tutaj doświadczeniach). Skieruj wskaźnik laserowy na tył głowy lub rdzeń kręgowy szczeniaka myszy (patrz rysunek 1). Unikaj świecenia laserem w oczy i długotrwałej ekspozycji skóry na światło lasera.

2. ....

Results

Rysunki 1 i 2 pokazują, jak można szybko i tanio użyć wskaźnika laserowego i gogli laserowych do genotypowania zwierząt z miotu GFP. W przypadku młodych szczeniąt myszy technika ta może być wykorzystana do nieinwazyjnej identyfikacji znacznika GFP w mózgach zwierzęcia przez czaszkę i przylegającą skórę (ryc. 1A - D). Emitowana fluorescencja może być widoczna przez skórę i czaszkę młodych myszy co najmniej do 3 dnia po urodzeniu (ryc. 1C). Procedura jest pokazana na

Discussion

Ogólną zaletą elektroporacji znacznikowej in vitro , w przeciwieństwie do badań śledzenia in vivo , jest to, że daje ona naukowcom lepszy dostęp do obszaru zainteresowania mózgu, a zatem nie wymaga drogiego sprzętu stereotaktycznego (i często elektrofizjologicznego). Ponadto, okres przeżycia wymagany dla eksplantatów mózgu obejmuje tylko kilka godzin (1 - 4) zamiast dni lub nawet tygodni w przypadku wstrzyknięć znacznikowych in vivo (patrz szczegółowy przegląd stosowania amin dekstranu i innych.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S7653	Wszystkie chemikalia pochodzą z Sigma-Aldrich, chyba że zaznaczono inaczej.
Chlorek potasu		P9333
Fosforan potasu jednozasadowy		P5655
Fosforan sodu dwuzasadowy		S907
Chlorek		M2670
Chlorek		C5080
Glukoza		G7528
Wodorowęglan		S6297
Kwas		A4544
Myo-inozytol		I5125
Pirogronian		P2256
Albumina surowicy bydlęcej	A2153	opcjonalnie, do dodatkowej (immuno)histochemii
		P2139	opcjonalnie, do oczyszczania mózgu
Formamid	Fisher Scientific	F84	opcjonalnie, do oczyszczania mózgu
Podjednostka choleratoksyny-b	Sondy molekularne	C-34776 (Alexa 555)
Sondy molekularne	dekstranu tetrametylo-rodaminy	D-7162 (Alexa 555)
Fluorescencyjne Nissl	Invitrogen	N-21479 (niebieskie)	opcjonalnie
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	SF93
Agaroza	Invitrogen	16520
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Pentobarbi-tal	Vortech Pharmaceuticals	Fatal-Plus
Filamenty ze szkła borokrzemianowego	Aparat Harvarda	G150F-10
Ściągacz do pipet	Zeitz Instruments, Niemcy	DMZ Uniwersalny ściągacz
Konfiguracja perfuzji	Wykonany
wskaźnik laserowy	laserpointerpro.com, Hong Kong	HK-88007294 (405 nm)
Gogle filtrujące/ochronne	Dragon Lasers, Chiny	LSG09 (pasmo przepustowe 450-700 nm)
Mikroskop biookularowy	Wild Heerbrugg, Szwajcaria	Wild M3	Wyposażony w oświetlacz o dużej intensywności (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)
Picospritzer	Parker Instruments	Picospritzer III
PC z zainstalowanym oprogramowaniem MC Stimulus	Multi Channel Sys-tems, Niemcy (oprogramowanie)
2-kanałowy stymulator	Multi Channel Sys-tems, Niemcy	STG-1002
Jednostka izolująca stymulację	A.M.P.I., Izrael	Mikromanipulator Iso-Flex
	Narishige, Japonia	YOU-1
Vibratome	Leica, Niemcy	VT1000S