Artykuł metodologiczny

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

DOI:

10.3791/53333

⸱

25 listopada 2015

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy technikę, która łączy protokół wstrzykiwania znacznika in vitro, który wykorzystuje serię impulsów elektrycznych i ciśnieniowych do zwiększenia absorpcji barwnika poprzez elektroporację w eksplantatach mózgu z ukierunkowanym oświetleniem laserowym i dopasowanymi goglami filtrującymi podczas zabiegu. Opisana technika elektroporacji in vitro sama w sobie daje stosunkowo dobrą kontrolę wzrokową przy celowaniu w określone obszary mózgu. Łącząc to z laserowym wzbudzaniem fluorescencyjnych markerów genetycznych i ich odczytem przez gogle filtrujące przechodzące przez pasmo, które mogą wychwytywać emisje genetycznie znakowanych komórek/jąder i fluorescencyjny barwnik śledzący, badacz może znacznie zwiększyć dokładność wstrzyknięć, znajdując obszar zainteresowania i znacznie skuteczniej kontrolując rozprzestrzenianie się / wychwyt barwnika w obszarze wstrzyknięcia. Ponadto technika oświetlenia laserowego pozwala na badanie funkcjonalności danego obwodu nerwowego poprzez dostarczanie informacji o typie neuronów rzutujących na określony obszar w przypadkach, gdy ekspresja GFP jest związana z typem przekaźnika wyrażanego przez subpopulację neuronów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zdefiniować pewien (mikro)obwód neuronalny, należy zacząć od znalezienia różnych uczestników tego obwodu i ich wzorca połączeń. Od czasu publikacji Wallera na temat śledzenia włókien nerwowych poprzez uszkodzenie1 ustalono wiele różnych technik śledzenia neuroanatomicznego. Niektóre z tych technik mogą być stosowane w utrwalonej tkance post mortem2-4, inne polegają na aktywnym transporcie barwnika w żywych neuronach, jak odkryto w 1971 roku5-6. Te ostatnie można dalej podzielić na dwie grupy, rozróżniając metody wykorzystujące aktywną retrogradację (od wstrzykiwanego obszaru do źródła danej projekcji, czyli somatów neuronów, które rzutują na ten obszar) i aktywnego następczego (od wstrzykiwanego obszaru do celu danej projekcji, tj. wypustki aksonalne i zakończenia aksonalne znakowanych neuronów) transport. Ponadto w niektórych przypadkach materiał znacznikowy jest wstrzykiwany żywym zwierzętom, które następnie przeżywają wstrzyknięcie przez kilka dni lub tygodni (wstrzyknięcia znacznikowe in vivo), podczas gdy w innych przypadkach eksplantowane mózgi są wstrzykiwane i inkubowane przez kilka godzin po wstrzyknięciu w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (wstrzyknięcia znacznikowe in vitro).

W tym protokole zmodyfikowaliśmy istniejącą technikę elektroporacji in vitro 7-8, aby oznaczyć neuronalne somaty i procesy w eksperymentach śledzenia następczego i wstecznego przy użyciu podjednostki cholesterolotoksyny b i dekstranu tetrametylorodaminy jako substancji śledzących. Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie neurobiologom skutecznego narzędzia do śledzenia wzorców połączeń neuronalnych między różnymi jądrami mózgu, przy jednoczesnym wykorzystaniu dostępnych linii myszy transgenicznych i podstawowego sprzętu optycznego w celu zwiększenia dokładności celowania podczas wstrzykiwań znacznika. Chociaż metoda śledzenia następczego i wstecznego przy użyciu choleratoksyny i aminy dekstranu oraz ich odpowiednich fluorescencyjnie znakowanych koniugatów nie jest nowa9-13 (podobnie jak metoda elektroporacji, np. Haas i wsp.14), połączenie wstrzyknięć znacznika z elektroporacją w preparacie in vitro obejmującym bloki tkanki mózgowej jest nowszym osiągnięciem7. Jego główną zaletą w porównaniu z technikami śledzenia neuronów wykorzystującymi ten sam rodzaj barwników znacznikowych u żywych zwierząt jest zwiększona intensywność znakowania, ze względu na wyższą wydajność, z jaką elektroporowany barwnik jest pobierany przez neurony. Dodatkowym atutem jest skrócony okres inkubacji (wymagany do transportu barwnika) oraz jego zwiększona dokładność celu podczas iniekcji znacznika, ponieważ eksperymentator ma wizualną kontrolę nad obszarem docelowym iniekcji. To ostatnie oznacza również, że nie jest wymagany drogi sprzęt stereotaktyczny, aby znaleźć jądro lub obszar zainteresowania mózgu.

Aby dodatkowo zwiększyć dokładność celowania, skorzystaliśmy z transgenicznej linii myszy, która wyraża GFP w swojej glicynergicznej subpopulacji neuronów15 oraz podstawowego sprzętu optycznego składającego się z ręcznego wskaźnika laserowego o długości fali 405 nm i dopasowanych okularów filtrujących pasmowo-przepustowych (450 - 700 nm). W ten sposób osiągnęliśmy znaczny dalszy wzrost dokładności celowania, identyfikując obszar wstrzyknięcia na podstawie sygnału fluorescencyjnego i zapewniając dokładniejszy sposób kontroli rozprzestrzeniania się barwnika w obszarze iniekcji poprzez obserwację interakcji między rodzimym sygnałem GFP a fluorescencją znacznika. Nasza technika pozwala również odkryć funkcjonalność obwodu wraz z jego łącznością poprzez identyfikację neuronów hamujących GFP-dodatnich (lub pobudzających w innych liniach myszy), które zostały wypełnione znacznikiem.

Podsumowując, jeszcze bardziej udoskonaliliśmy potężne narzędzie neuronaukowe do badania konektomu mózgu kręgowców i oceny różnych cech neuroanatomicznych danego obwodu nerwowego. Używając transgenicznych myszy wraz z niedrogim i powszechnie dostępnym sprzętem optycznym, byliśmy w stanie znacznie zwiększyć dokładność celowania naszych zastrzyków. Co więcej, transgeniczne myszy pozwoliły nam zidentyfikować rodzaj śledzonych połączeń, co pomogło odkryć funkcjonalność hamującego mikroobwodu w słuchowym pniu mózgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Genotypowanie optyczne

1. Genotypowanie optyczne szczeniąt myszy

  1. Sprawdzić ekspresję odpowiedniego markera fluorescencyjnego za pomocą wskaźnika laserowego o odpowiedniej długości fali wzbudzenia (405 nm w opisanych tutaj doświadczeniach) i odpowiednich gogli filtrujących blokujących długość fali wzbudzenia, ale przechodzących przez długość fali emisyjnej (450 - 700 nm w opisanych tutaj doświadczeniach). Skieruj wskaźnik laserowy na tył głowy lub rdzeń kręgowy szczeniaka myszy (patrz rysunek 1). Unikaj świecenia laserem w oczy i długotrwałej ekspozycji skóry na światło lasera.

2. Genotypowanie optyczne starszych zwierząt

  1. Głęboko znieczulić mysz (w wieku od p14 do p138 w opisanych tutaj eksperymentach) przedawkowaniem pentobarbitalu poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (120 mg/kg masy ciała). Potwierdź prawidłowe znieczulenie, sprawdzając odruchy zwierzęcia (krótko uszczypnij czubek ucha lub jedną z tylnych nóg, aby wywołać odruch wycofania ucha lub nogi).
  2. Uwaga: Pomimo przedawkowania pentobarbitalu (120 mg/kg masy ciała) procedurę wstrzyknięcia nazywamy "głębokim znieczuleniem" zamiast eutanazji, ponieważ w idealnym przypadku zwierzę jest jeszcze żywe (tj. jego serce nadal bije), gdy rozpoczyna się operacja i perfuzja. Zapewnia to bardziej efektywną perfuzję narządów wewnętrznych, w tym mózgu.
  3. Gdy zwierzę nie wykazuje żadnych odruchów, ostrożnie usuń skórę pokrywającą czaszkę (ryc. 2A), wykonując nacięcie w skórze pokrywającej tył głowy i przecinając do środkowej części czaszki. Wystaw odsłoniętą czaszkę na działanie światła laserowego i obserwuj fluorescencję przez gogle filtrujące, jak opisano powyżej. Jeśli zaobserwuje się pozytywny sygnał GFP, przejdź do kroku 2, jeśli nie, uśmierc zwierzę poprzez ścięcie głowy (druga/zapewniająca forma eutanazji zgodnie z naszymi przepisami IACUC).

Uwaga: U jeszcze starszych myszy ( >1 miesiąc) fluorescencję można zaobserwować oczami zwierzęcia.

2. Perfuzja przezsercowa i preparacja mózgu

  1. Perfuzja przezsercowa lodowato zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS; NaCl: 137 mM, KCl: 2,7 mM, KH2PO4: 1,76 mM, Na2HPO4: 10 mM) za pomocą igły strzykawkowej 30 G, aby w znacznym stopniu usunąć krew ze zwierzęcia.
    1. Najpierw ostrożnie otwórz klatkę piersiową ostrymi nożyczkami, a następnie wepchnij igłę do lewej komory serca. Zacznij pompować PBS do serca i aorty, a natychmiast po tym kroku otwórz prawe przedsionki serca nożyczkami, aby umożliwić krew wydostanie się z organizmu. Uwaga: Perfuzja trwa 5 - 10 minut w zależności od wielkości zwierzęcia.
  2. Po wykrwawieniu przez perfuzję należy odciąć głowę zwierzęciu, zabezpieczyć jego głowę igłami (lub igłami strzykawkowymi 30 G), przekłuwając je przez oczodoły w naczyniu do przygotowywania i usunąć mózg z czaszki.
    1. Najpierw użyj ostrych nożyczek, aby odciąć skórę pokrywającą czaszkę: wykonaj małe nacięcie z tyłu głowy, następnie przeciąć wzdłuż linii środkowej po grzbietowej stronie głowy, przyciąć na boki tuż doogonowo od oczu zwierzęcia i na koniec przeciąć w kierunku ogonowym, aby całkowicie usunąć płaty skóry z tyłu głowy.
    2. Następnie powtórz ten sam wzór cięcia dla samej czaszki, upewnij się, że usunąłeś oba ślimaki w tym procesie, ponieważ znacznie uprości to usunięcie pnia mózgu w końcu. Po tym zabiegu ogonowa połowa mózgu powinna leżeć całkowicie odsłonięta.
    3. W kolejnym kroku za pomocą ostrej żyletki lub skalpela przeciąć całe przodomózgowie pod kątem około 45° i około 2 mm rostral od móżdżku. Wyciągnij oddzieloną przednią połowę mózgu za pomocą zgiętej szpatułki.
    4. Użyj szpatułki, aby podnieść ogonową połowę mózgu na jej rostralnym końcu, a następnie przeciąć nerwy czaszkowe, które są nadal połączone z pniem mózgu po jego brzusznej stronie. W efekcie końcowym ogonowa połowa mózgu, w tym pień mózgu, powinna swobodnie opadać z reszty przygotowanej głowy zwierzęcia.
    5. Odwróć usuniętą ogonową połowę mózgu, aby odsłonić jej brzuszną stronę i przeciąć wzdłuż płaszczyzny koronalnej tylko rostralnie (w przypadku iniekcji następczych) lub tylko ogonowej (w przypadku wstrzyknięć wstecznych) brzusznie położonych "bańek" zawierających ciało trapezoidalne (patrz krok 2.3).
      1. Do procedury cięcia zawsze używaj ostrej żyletki lub skalpela, aby zminimalizować śmierć komórek spowodowaną nadmiernym obciążeniem mechanicznym tkanki. W rezultacie powinien zostać uzyskany eksplant mózgu o długości około 1 cm i zawierający kompletny górny kompleks oliwarów wzdłuż innych obszarów mózgu.

Uwaga: Ten protokół demonstruje procedurę wstrzykiwania znacznika do ciała trapezoidalnego znajdującego się w słuchowym pniu mózgu. W razie potrzeby dostosuj położenie i orientację płaszczyzn cięcia i miejsc iniekcji. Jeśli fluorescencyjne obszary mózgu będące przedmiotem zainteresowania leżą wystarczająco blisko powierzchni mózgu, tak że można je zidentyfikować i wstrzyknąć bez przecinania mózgu (patrz Rysunek 2B), wówczas etap cięcia koronalnego można pominąć.

  1. Zidentyfikuj ciało trapezoidalne jako dwie wydatne brzuszne "bańki" zawierające jądro brzuszne ciała trapezoidalnego (VNTB).

Uwaga: Aby uzyskać więcej informacji anatomicznych na temat przybliżonego stereotaktycznego położenia tych płaszczyzn cięcia, zobacz Franklin & Paxinos, 2008. Panel 78 atlasu, Bregma ~ -5,7 mm pokazuje przyśrodkowe jądro ciała trapezoidalnego (=MNTB) oznaczone jako "Tz". Panel 69 przedstawia jądro brzuszne ciała trapezoidalnego (VNTB) oznaczone jako "MVPO" (jądro okołooliwarowe przyśrodkowo-brzuszne)19.

3. Śledzenie wsteczne/wsteczne

Uwaga: Wykonaj wszystkie poniższe procedury przy temperaturze RT (25°C).

  1. Po przecięciu umieścić eksplant pnia mózgu w naczyniu przygotowawczym zawierającym natleniony (95%O2, 5% CO2) roztwór preparacyjny (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl2: 1 mM, CaCl2: 0,1 mM, glukoza: 25 mM, NaH2PO4: 1,25 mM, NaHCO3: 25 mM, kwas askorbinowy: 0,4 mM, mio-inozytol: 3 mM, kwas pirogronowy: 2 mM), zabezpieczając go igłami strzykawkowymi 30 G. Upewnij się, że obszar wstrzyknięcia jest skierowany do góry.
  2. Wyciągnąć pipety iniekcyjne ze szkła borokrzemianowego i napełnić je jednym z następujących trzech roztworów: a) roztworem 1,0 mg/ml podjednostki b cholesteroleratoksyny sprzężonym z fluoroforem Alexa 555 w PBS12-13 (używanym głównie do transportu wstecznego), b) 1% rozcieńczeniem w 0,9% soli fizjologicznej dekstranu tetrametylorodaminy 555 (3 000 MW, stosowany głównie do transportu wstecznego) lub c) 1% rozcieńczeniem w 0,9% soli fizjologicznej dekstranu-TRITC 555 o mocy 10 000 MW (stosowany głównie do transportu następczego).
    1. Upewnij się, że rezystancja pipet iniekcyjnych wynosi od 2,5 do 3,5 MOhm i że są one produkowane w 3-4 cyklach ciągnięcia. W przypadku opisanych tutaj eksperymentów należy to osiągnąć, wybierając wstępnie zaprogramowany algorytm ciągnięcia na ściągaczu do pipet.
  3. Oświetlić eksplant mózgu za pomocą statycznie zamontowanego wskaźnika laserowego o odpowiedniej długości fali (pozycja nr 2 na rysunku 3A; długość fali 405 nm w opisanych tutaj eksperymentach). Użyj wskaźnika laserowego jako przewodnika do wstrzyknięć i skieruj wiązkę laserową na znakowane fluorescencyjnie jądro mózgu lub komórki będące przedmiotem zainteresowania, które zostaną wstrzyknięte.
  4. Znajdź i obserwuj oświetlony obszar docelowy za pomocą mikroskopu dwuokularowego, nosząc kompatybilne gogle filtrujące (filtr pasmowo-przepustowy 450 - 700 nm w opisanych tutaj eksperymentach). Wprowadzić elektrodę iniekcyjną za pomocą mikromanipulatora w obszar zainteresowania.
  5. Wstrzyknąć substancję znacznikową. Zastrzyki składają się z 2 - 10 impulsów ciśnienia o ciśnieniu 15 psi przez 50 ms każdy, za pomocą urządzenia do wstrzykiwania ciśnienia, skierowanych prostopadle do obszaru zainteresowania (ROI) w sekcji mózgu. Podawaj każdy impuls ciśnienia w odstępach 10 - 15 sekund, aby umożliwić rozprowadzenie barwnika.
  6. W przypadku iniekcji tetrametylorodaminy (TRITC) należy dodatkowo stymulować elektrycznie w celu zwiększenia wychwytu barwnika poprzez elektroporację z elektrodą umieszczoną w obszarze mózgu będącym przedmiotem zainteresowania (MNTB i VNTB w opisanych tutaj eksperymentach).
    1. Użyj 8 impulsów TTL o napięciu 8 V przez 50 ms z interwałami międzyimpulsowymi 50 ms, napędzanych stymulatorem i wzmacnianych do 55 V za pomocą izolatora stymulacji (pozycje nr 7 i 9 na rysunku 3B). Stosować 10 - 20 powtórzeń tego protokołu, podawanych przez kilka minut7,8. Upewnij się, że elektroda jest prawidłowo uziemiona - przewód uziemiający powinien być podłączony do roztworu wanny!
  7. Sprawdzić, czy wstrzyknięcie zakończyło się powodzeniem. Ponieważ znacznik fluorescencyjny o dłuższej długości fali emisyjnej emituje również sygnał fluorescencyjny po wzbudzeniu laserowym krótszymi długościami fal, należy wizualnie sprawdzić absorpcję/rozprzestrzenianie się barwnika w wstrzykniętym obszarze docelowym, oświetlając obszar laserem i obserwując przez gogle filtrujące.

4. Inkubacja

  1. Po wstrzyknięciu należy inkubować pnie mózgu w natlenionym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl2: 1 mM, CaCl2: 2 mM, glukoza: 25 mM, NaH2PO4: 1,25 mM, NaHCO3: 25 mM, kwas askorbinowy: 0,4 mM, mio-inozytol: 3 mM, kwas pirogronowy: 2 mM, bąbelkowany 95% O2 - 5% CO2) w temperaturze pokojowej (RT, 25° C) przez 1 - 4 godziny, podczas transportu barwnika. Bąbelkować roztwór przez cały okres inkubacji.
  2. Następnie przenieś pnie mózgu w 4% paraformaldehydzie (PFA) rozpuszczonym w PBS (ok. 100 ml; pH 7 dla mieszanki PFA/PBS) i inkubuj je w temperaturze 4° C, aby umożliwić późniejsze utrwalenie przez noc (O/N).

5. Krojenie i montaż tkanek

  1. Następnego dnia umyj pień mózgu trzy razy w PBS (5 minut na każdy etap mycia), przykryj go 4% agarem, a następnie pokrój w plastry o grubości 50 - 80 μm na wibratomie. Plastry namontować za pomocą podłoża montażowego na szkiełku podstawowym i szkiełku nakrywkowym.
  2. Opcjonalnie oznacz sekcje fluorescencyjnym Nisslem przez 25 minut (na przykład niebieskim Nisslem w rozcieńczeniu 1:100 w pożywce AB).
    1. Aby przygotować pożywkę AB, zmieszać 250 ml 0,2 M buforu fosforanowego (PB; 51 mM KH2PO4, 150 mM Na2HPO4), 15 ml 5 M NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml ddH2O i 5 g albuminy surowicy bydlęcej.
    2. Poprzedz i zakończ etap etykietowania Nissl o 3 etapy mycia w PBS (10 min każdy).

Uwaga: W przypadkach, gdy grubsze odcinki muszą być zamontowane i przeanalizowane (w opisanych tutaj eksperymentach takie plastry miały grubość 100 - 500 mikronów, aby zachować połączenia aksonalne na większe odległości), technika ta może być połączona z oczyszczaniem tkanek. Stwierdziliśmy, że ClearT212 jest udany20. Gdy dołączony jest etap oczyszczania tkanki, wykonaj go przed zamontowaniem sekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunki 1 i 2 pokazują, jak można szybko i tanio użyć wskaźnika laserowego i gogli laserowych do genotypowania zwierząt z miotu GFP. W przypadku młodych szczeniąt myszy technika ta może być wykorzystana do nieinwazyjnej identyfikacji znacznika GFP w mózgach zwierzęcia przez czaszkę i przylegającą skórę (ryc. 1A - D). Emitowana fluorescencja może być widoczna przez skórę i czaszkę młodych myszy co najmniej do 3 dnia po urodzeniu (ryc. 1C). Procedura jest pokazana na

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólną zaletą elektroporacji znacznikowej in vitro , w przeciwieństwie do badań śledzenia in vivo , jest to, że daje ona naukowcom lepszy dostęp do obszaru zainteresowania mózgu, a zatem nie wymaga drogiego sprzętu stereotaktycznego (i często elektrofizjologicznego). Ponadto, okres przeżycia wymagany dla eksplantatów mózgu obejmuje tylko kilka godzin (1 - 4) zamiast dni lub nawet tygodni w przypadku wstrzyknięć znacznikowych in vivo (patrz szczegółowy przegląd stosowania amin dekstranu i innych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obsługiwane przez NIH/NIDCD R01 DC 011582. Eksperymenty obrazowe przeprowadzono w University of Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Core, wspieranym częściowo przez NIH/NCRR Colorado CTSI Grant Number UL1 RR025780 oraz Rocky Mountain Neurlogical Disorders Core Grant NIH P30NS048154. Dr Sascha du Lac z Instytutu Salka dostarczył nam myszy GlyT2-GFP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek soduSigma-AldrichS7653Wszystkie chemikalia pochodzą z Sigma-Aldrich, chyba że zaznaczono inaczej.
Chlorek potasu P9333
Fosforan potasu jednozasadowyP5655
Fosforan sodu dwuzasadowyS907
ChlorekM2670
ChlorekC5080
GlukozaG7528
WodorowęglanS6297
KwasA4544
Myo-inozytolI5125
PirogronianP2256
Albumina surowicy bydlęcejA2153opcjonalnie, do dodatkowej (immuno)histochemii
P2139opcjonalnie, do oczyszczania mózgu
FormamidFisher ScientificF84opcjonalnie, do oczyszczania mózgu
Podjednostka choleratoksyny-bSondy molekularneC-34776 (Alexa 555) 
Sondy molekularnedekstranu tetrametylo-rodaminyD-7162 (Alexa 555)
Fluorescencyjne NisslInvitrogenN-21479 (niebieskie)opcjonalnie
ParaformaldehydFisher ScientificSF93
AgarozaInvitrogen16520
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Pentobarbi-talVortech PharmaceuticalsFatal-Plus 
Filamenty ze szkła borokrzemianowegoAparat HarvardaG150F-10
Ściągacz do pipetZeitz Instruments, NiemcyDMZ Uniwersalny ściągacz
Konfiguracja perfuzjiWykonany
wskaźnik laserowy laserpointerpro.com, Hong KongHK-88007294 (405 nm)
Gogle filtrujące/ochronneDragon Lasers, ChinyLSG09 (pasmo przepustowe 450-700 nm)
Mikroskop biookularowy Wild Heerbrugg, SzwajcariaWild M3Wyposażony w oświetlacz o dużej intensywności (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) 
PicospritzerParker InstrumentsPicospritzer III
PC z zainstalowanym oprogramowaniem MC StimulusMulti Channel Sys-tems, Niemcy (oprogramowanie)
2-kanałowy stymulatorMulti Channel Sys-tems, NiemcySTG-1002
Jednostka izolująca stymulacjęA.M.P.I., IzraelMikromanipulator Iso-Flex
Narishige, JaponiaYOU-1
VibratomeLeica, NiemcyVT1000S
magnezu wapnia sodu askorbinowy sodu Triton-X-100 X100 opcjonalnie, do dodatkowej (immuno)histochemii Poli(glikol etylenowy), 8000 MW na zamówienie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
  2. Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
  3. Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
  4. Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).
  5. Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
  6. Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
  7. Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
  8. Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
  9. Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
  10. Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
  11. Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
  12. Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
  13. Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
  14. Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
  15. Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
  16. Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
  17. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
  18. Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
  19. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).
  20. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  21. Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
  22. Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
  23. Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
  24. Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83(2014).
  25. Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
  26. Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
  27. Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
  28. Zwicker, E., Fastl, H. Psychoacoustics Facts and Models. , Springer. (1990).
  29. Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
  30. Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
  31. Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235(2007).
  32. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  33. Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Electroporation Tracer InjectionFluorescent Genetic MarkersBand pass Filter GogglesCholera Toxin Subunit BTetraethyl Rodine DextrinVentral Nucleus Trapezoid BodyMicro Manipulator PositioningPressure Electrical Pulses

Powiązane artykuły