Wykorzystanie pojedynczego zapisu sensillum do wykrywania reakcji neuronów węchowych pluskiew na substancje semiochemiczne

Podsumowanie

Pluskwy polegają na neuronach receptorów węchowych umieszczonych w ich czułkach węchowych do wykrywania substancji semiochemicznych w środowisku. Wykorzystując rejestrację pojedynczego czujnika, demonstrujemy metodę oceny reakcji pluskiew na substancje semiochemiczne i badamy związany z tym proces kodowania.

Streszczenie

System węchowy owadów odgrywa ważną rolę w wykrywaniu substancji semiochemicznych w środowisku. W szczególności uważa się, że czułki czułkowe, w których znajduje się jeden lub wiele neuronów, mają główny wkład w reagowanie na bodźce chemiczne. Poprzez bezpośrednie rejestrowanie potencjału czynnościowego w czubku węchowym po ekspozycji na bodźce, technika rejestracji pojedynczej czułości (SSR) zapewnia potężne podejście do badania reakcji neuronalnych owadów na bodźce chemiczne. W przypadku pluskwy, która jest znanym ludzkim pasożytem, scharakteryzowano wiele rodzajów zmysłu węchowego. W tym badaniu wykazaliśmy reakcje neuronalne czucia węchowego pluskiew na dwa bodźce chemiczne oraz zależne od dawki odpowiedzi na jeden z nich za pomocą metody SSR. Takie podejście umożliwia naukowcom przeprowadzanie wczesnych badań przesiewowych pod kątem indywidualnych bodźców chemicznych na czulach węchowych pluskiew, co dostarczyłoby cennych informacji do opracowania nowych atraktantów lub repelentów pluskiew i przyniosłoby korzyści wysiłkom na rzecz zwalczania pluskiew.

Wprowadzenie

Pospolity pluskwa Cimex lectularius L (Hemiptera: Cimicidae), jako tymczasowy ektopasożyt, jest obowiązkowym owadem wysysającym krew, co oznacza, że ich przetrwanie, rozwój i rozmnażanie wymagają źródeł krwi od gospodarzy, w tym zarówno ludzi, jak i zwierząt^1,2. Chociaż rzadko zgłaszano przenoszenie wirusa z powodu C. lectularius, uciążliwość gryzienia spowodowana inwazją poważnie wpływa na gospodarzy zarówno fizycznie, jak i psychicznie³. Wprowadzenie i powszechne stosowanie chemicznych środków owadobójczych, zwłaszcza DDT, obniżyło ryzyko inwazji i pod koniec lat pięćdziesiątych inwazje osiągnęły tak niski poziom, że nie stanowiły już poważnego problemu publicznego. Jednak wiele możliwych czynników doprowadziło do odrodzenia się populacji pluskiew na całym świecie, takich jak zmniejszone stosowanie środków owadobójczych, spadek świadomości społecznej, zwiększona aktywność podróżnicza i rozwój odporności na insektycydy^4-9.

Sygnały chemiczne w środowisku są wykrywane i rozpoznawane przez owady za pomocą narządów węchowych, takich jak czułki i szczęki. Zmysł węchowy na czułkach owadów odgrywa kluczową rolę w wykrywaniu tych sygnałów chemicznych. Cząsteczki chemiczne dostają się do naskórka czułka przez pory na powierzchni naskórka. Białka wiążące substancje zapachowe w limfie czułkowej wiążą się z tymi cząsteczkami chemicznymi i transportują je do receptorów zapachowych¹⁰. Receptory zapachowe i ich koreceptor z nieselektywnego kanału jonów kationowych na błonie nerwowej, który zostanie zdepolaryzowany, gdy te cząsteczki chemiczne zostaną rozpoznane przez receptory zapachowe¹¹.

Single sensillum recording (SSR) został opracowany w celu wykrywania zewnątrzkomórkowych zmian w potencjale czynnościowym spowodowanych zastosowaniem bodźców chemicznych lub niechemicznych. Poprzez wprowadzenie elektrody rejestrującej do limfy sensillum i elektrody referencyjnej do innej części ciała owada (zwykle oczu złożonych lub brzucha), można zarejestrować szybkość wypalania neuronów w odpowiedzi na bodźce12. Zmiany w liczbie kolców reprezentują wrażliwość owada na określone bodźce. Bodźce chemiczne o różnej tożsamości i stężeniu będą wywoływać różne reakcje neuronalne, z różnymi szybkościami wyzwalania i strukturami czasowymi, a zatem mogą być wykorzystane do zbadania procesu kodowania owada na określone substancje chemiczne.

Dla pospolitego pluskwy, obie formy płciowe mają ten sam wzór węchowej sensilli na czułkach: dziewięć rowkowanych kołków C sensilla, 29 włoskowatych sensilli E (E1 i E2) i po jednej parze Dα, Dβ, Dγ smooth peg sensilla ^13,14. Ponieważ w każdym typie sensillum zidentyfikowano wiele neuronów, nie jest łatwo odróżnić potencjały czynnościowe od różnych neuronów znajdujących się w tym samym sensillum, więc w tym eksperymencie całkowita liczba potencjałów czynnościowych została policzona poza linią przez okres 500 ms przed i po stymulacji. Liczba potencjałów czynnościowych po stymulacji została następnie odjęta od liczby potencjałów czynnościowych przed stymulacją i pomnożona przez dwa w celu ilościowego określenia zmian szybkości wypalania w każdym indywidualnym sensylum w skokach na sekundę¹⁵.

Protokół

1. Przygotowanie instrumentów, roztworów bodźców i pluskiew

1. Przygotuj 50% roztwór KNO₂ (w/v) w butelce o pojemności 20 ml.
2. Naostrzyć dwie mikroelektrody wolframowe w roztworze KNO₂ pod napięciem 5 V, wielokrotnie zanurzając elektrody wolframowe w roztworze i wyjmując je z niego.
   1. Z grubsza naostrz drut wolframowy, zanurzając około 10 mm drutu wolframowego w roztworze KNO₂ z prędkością 2 zanurzeń/s przez około 5 minut, co może znacznie pochłonąć przedni koniec drutu wolframowego.
   2. Delikatnie naostrz elektrodę, zanurzając około 1 mm końcówki drutu w roztworze i wyjmując go z prędkością 2 zanurzeń/s przez co najmniej 1 minutę, tak aby elektroda była cienka i ostra. Często sprawdzaj średnicę końcówki elektrody pod mikroskopem, aż osiągnie 0,2-0,5 μm, co powinno wystarczyć do przebicia naskórka czucia węchowego pluskwy.
      Uwaga: Podczas ręcznego ostrzenia elektrody prędkość zanurzania drutu wolframowego w roztworze KNO₂ nie jest cały czas stała. Przy większej wprawie znacznie łatwiej jest utrzymać w miarę stałą prędkość ostrzenia elektrody. Czas ostrzenia jest również niepewny w zależności od tego, jak drobna powinna być elektroda. W tym przypadku końcówka elektrody o średnicy ~0,2 μm jest wystarczająca, aby przebić się przez zmysł węchowy.
3. Rozcieńczyć każdy z bodźców chemicznych w dimetylosulfotlenku (DMSO) z czystego związku do początkowego stężenia 1:10 v/v jako roztwór podstawowy. Stwórz serię dziesięcioletnich rozcieńczeń w zależności od tego, ile dawek jest wymaganych w eksperymencie, ponownie za pomocą DMSO, z każdego z roztworów podstawowych dla każdej substancji chemicznej. Tutaj użyj 10% (+)-β-pinenu i eukaliptolu.
4. Umieść niekarmione lub siedem dni po karmieniu dorosłe pluskwy (samce lub samice) z kolonii Ft. Dix (prezent od dr Haynesa z University of Kentucky) do wykorzystania w eksperymencie na szalce Petriego.
   Uwaga: Nie ma dokładnej liczby pluskiew umieszczonych na szalce Petriego. Może to być kilka lub dużo.

2. Przygotowanie anten pluskiew

1. Znieczulenie pluskiew na lodzie (2-3 min).
2. Przymocuj zarówno czułki, jak i ciało owada do szkiełka nakrywkowego mikroskopu za pomocą taśmy dwustronnej i usuń nogi cienkimi nożyczkami.
3. Użyj małej szpilki, aby delikatnie dotknąć anten, aby równomiernie przykleić je do taśmy.
4. Oprzyj szkiełko nakrywkowe o małą kulkę (~1 cm średnicy) wosku dentystycznego, aby ułatwić manipulację, i ustaw ją pod odpowiednim kątem (~ 90°) dla elektrody rejestrującej (Rysunek 1).
5. Po zabezpieczeniu umieść pluskwę pod mikroskopem stereoskopowym, włącz zimne źródło światła i dostosuj intensywność oświetlenia, aż antena będzie wyraźnie widoczna, a następnie skoncentruj mikroskop na drugiej wici anteny pluskwy przy dużym powiększeniu (720X).
   Uwaga: Intensywność oświetlenia użytego w eksperymencie nie jest mierzona, co tak naprawdę zależy od tego, jak oczy eksperymentatora odczuwają intensywność oświetlenia.

3. Pojedynczy zapis Sensillum

1. Podłącz przedwzmacniacz (10X) do sterownika akwizycji sygnału, który jest połączony z komputerem w celu rejestracji i wizualizacji sygnału. Włącz komputer i uruchom oprogramowanie, np. AutoSpike32 i kliknij tryb "Nagraj" na pasku menu. Następnie wybierz "falę", aby rozpocząć nagrywanie sygnałów fali.
   Uwaga: Płaska linia biegnąca wielokrotnie od lewej do prawej krawędzi monitora powinna być teraz widoczna. W tym przypadku okno nagrywania trwa 40 sekund. Maksymalny zapis fali to 10 sekund. Wybrana częstotliwość próbkowania to 96000, a częstotliwość próbkowania cyfrowego to 240. Jest przesunięcie 0% i brak filtrowania, brak rektyfikacji dla sygnałów nagrywania. Wszystkie te ustawienia parametrów w oprogramowaniu można modyfikować w zależności od potrzeb.
2. Włącz głośnik podłączony do przedwzmacniacza, który służy do prezentacji trybu tonowania dla odpowiedzi neuronalnych z czułka antenowego.
3. Włóż elektrodę referencyjną do brzucha ustabilizowanej pluskwy.
   Uwaga: Elektroda referencyjna była przytrzymywana przez metalowy stojak magnetycznie przymocowany do stołu powietrznego.
4. Po podłączeniu elektrody referencyjnej do brzucha pluskwy, przesuń elektrodę nagrywającą, która jest podłączona do przedwzmacniacza i manipulowana przez mikromanipulator, w kierunku tylnego końca anteny pluskwy.
5. Gdy elektroda rejestrująca styka się z prawą końcówką anteny, włącz mikroskop i zlokalizuj elektrodę w małym powiększeniu.
6. Wyreguluj elektrodę rejestrującą, stopniowo zwiększając powiększenie, aż zarówno elektroda, jak i czułek anteny znajdą się w tej samej płaszczyźnie i będą wyraźnie widoczne pod mikroskopem.
   Uwaga: W tym czasie mikroskop ma zwykle największe powiększenie.
7. Włóż elektrodę rejestrującą do trzonu czujnika za pomocą mikromanipulatora i wejdź nieco głębiej, jeśli szum tła jest wysoki w porównaniu z potencjałem czynnościowym.
8. Po zaobserwowaniu czystych potencjałów czynnościowych z zarejestrowanego sensillum, napełnij mikropipetę 10% (+)-β-pinenem. Za pomocą mikropipety nanieść 10 μl podwielokrotności 10% (+)-β-pinenu na pasek bibuły filtracyjnej (~3 x 15 mm) umieszczony w szklanej pipecie Pasteura.
   1. Podłącz załadowaną pipetę do wylotu rurki przepływu impulsowego kontrolera bodźca i umieść końcówkę pipety w małym otworze w rurce skierowanej w stronę anteny.
9. Gdy wszystkie te połączenia się ustabilizują, naciśnij przełącznik nożny sterownika bodźców, aby dostarczyć 0.5 sekundy bodźca (0.5 l/min) do ciągłego strumienia nawilżonego powietrza. Rejestracja potencjałów czynnościowych zostanie zainicjowana jednocześnie, gdy przełącznik nożny zostanie wciśnięty. Proces nagrywania będzie trwał 10 sekund, zaczynając 1 sekundę przed stymulacją.
10. Policz potencjały czynnościowe w trybie off-line przez dwa okresy 500 ms, jeden przed i jeden po stymulacji. Odejmij wszelkie zmiany w szybkości skoków w ciągu 500 ms po stymulacji od spontanicznej aktywności zarejestrowanej w ciągu poprzednich 500 ms i przelicz zliczenia na konwencjonalną skalę skoków/s, mnożąc je przez 2.

4. Wymiana bodźca w SSR

1. Po uruchomieniu przełącznika nożnego należy dostarczyć 10% (+)-β-pinenu z pipety na czułki pluskiew i rejestrować reakcję na ten konkretny środek zapachowy przez 10 sekund, po czym pipeta zostanie usunięta.
2. Oznacz kolejną nową pipetę 0,001% eukaliptolem, który ma być przetestowany. Umieść mały kawałek bibuły filtracyjnej, na który nałożono 10 μl bodźca, do nowej pipety.
3. Odczekaj 2-5 minut, aż bodziec całkowicie odparuje w szklanej pipecie. Przymocuj pipetę do wylotu rurki przepływu impulsowego.
4. Włóż końcówkę pipety do małego otworu w rurce skierowanej w stronę anteny. Naciśnij przełącznik nożny i rozpocznij 10-sekundowe nagrywanie.
5. Odłącz pipetę i przygotuj kolejną pipetę z 0,01% eukaliptolu.
6. Przetestuj wszystkie pozostałe dawki eukaliptolu (od 0,001% do 10%) na czułce czułki, aby zaobserwować reakcje zależne od dawki. Przeprowadzić test od najbardziej rozcieńczonych do najmniej rozcieńczonych dawek.

Wyniki

Rejestracja z pojedynczego sensillum jest potężną techniką badawczą wykorzystywaną w studiach nad ekologią chemiczną i fizjologią neuronową owadów. Badanie odpowiedzi neuronalnych owadów na różne związki lotne, zwłaszcza te, które uważa się za ekologicznie powiązane z przetrwaniem i rozwojem owadów, nie tylko dostarcza bezcennych informacji na temat procesu olfaktornego u owadów, ale także otwiera obiecujące nowe możliwości, które potencjalnie mogą prowadzić do opracowania użytecznych now...

Dyskusja

Technika Single Sensillum Recording jest szeroko stosowana w testowaniu reakcji neuronalnych owadów, takich jak muszki owocowe, komary i pluskwy, na różne bodźce chemiczne w środowisku. Te bodźce chemiczne są często rozpuszczane i rozcieńczane w zwykłym rozpuszczalniku w celu przygotowania różnych dawek zabiegów. Jednak różne rozpuszczalniki mogą wytwarzać dość różne szybkości uwalniania bodźców. Wcześniejsze badania nad niektórymi szeroko przebadanymi owadami, takimi jak Drosophila melanogaster, Anopheles g...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Drut wolframowy	A-M SYSTEMS	#716500	Służy do przygotowania elektrody
KNO2	Sigma	#310484	Służy do ostrzenia drutu wolframowego
Zasilacz prądu przemiennego	BK Precision	1653A	Zapewnienie napięcia podczas ostrzenia drutu wolframowego
Mikroskop Leica Z6 APO	Leica	10447424	Służy do obserwacji sensyli na antenach
Kontroler Simulus	Syntech	CS-55	Służy do sterowania aplikacją bodźca
4-kanałowy kontroler akwizycji USB	Syntech	IDAC-4	Wyświetlanie w czasie rzeczywistym na ekranie wszystkich sygnałów przed i podczas nagrywania
Źródło światła	SCHOTT	A20500	Zapewnienie źródeł światła do obserwacji
Mikromanupulator	Leica	115378	Służy do niewielkiego ruchu elektroda
Głośnik	Juster	95a	Połączony z kontrolerem akwizycji IDAC-4 i dostarczający dźwięk do sygnału
Stojak magnetyczny	Narishige	GJ-1	Służy do trzymania elektrody referencyjnej, stabilizowanej rurki dostarczającej pluskwy i bodźce
Stół do izolacji drgań TMC	TMC	63-500	Służy do izolowania wibracji od urządzeń
Szkiełko nakrywkowe	Tedpella	2225-1	Służy do przytrzymywania pluskwy
Taśma dwustronna	3M	XT6110	Służy do stabilizacji pluskwy na klipsie
Wosk dentystyczny	Dentakit	DK-R012	Służy do podtrzymywania klipsa w miejscu, w którym stabilizowana jest pluskwa