Szczepienie kulek w rozwijających się kończynach zarodka kurczaka w celu identyfikacji szlaków transdukcji sygnału wpływających na ekspresję genów

Podsumowanie

Poprzez szczepienie koralików nasączonych czynnikami wzrostu lub specyficznymi inhibitorami szlaków sygnałowych do rozwijających się zarodków, możliwe jest bezpośrednie testowanie ich efektów in vivo. W tym protokole kulki są szczepione w zawiązku kończyny w celu określenia wpływu tych cząsteczek na ekspresję genów i transdukcję sygnału.

Streszczenie

Za pomocą zarodków kurzych można bezpośrednio przetestować wpływ czynników wzrostu lub specyficznych inhibitorów szlaków sygnałowych na ekspresję genów i aktywację szlaków transdukcji sygnału. Technika ta pozwala na dostarczanie cząsteczek sygnałowych w ściśle określonych stadiach rozwojowych przez określony czas. Następnie można pobrać zarodki i zbadać ekspresję genów, na przykład poprzez hybrydyzację in situ lub aktywację szlaków transdukcji sygnału obserwowaną za pomocą barwienia immunologicznego.

W tym filmie kulki heparyny nasączone FGF18 lub AG 1-X2 nasączone U0126, inhibitorem MEK, są wszczepiane do pąka kończyny in ovo. Pokazuje to, że FGF18 indukuje ekspresję fosforylacji MyoD i ERK, a zarówno endogenna, jak i indukowana przez FGF18 ekspresja MyoD jest hamowana przez U0126. Kulki nasączone antagonistą kwasu retinowego mogą nasilać przedwczesną indukcję MyoD przez FGF18.

To podejście może być stosowane z szeroką gamą różnych czynników wzrostu i inhibitorów i jest łatwo dostosowane do innych tkanek w rozwijającym się zarodku.

Wprowadzenie

Ptasie embriony od^{wielu lat dostarczają} potężnego narzędzia do badania rozwoju1. Jedną z ich najbardziej przydatnych cech jest to, że są stosunkowo łatwe do manipulowania. Rozwój zewnętrzny umożliwia otwarcie komórki jajowej w celu uzyskania dostępu do zarodka i wykonanie różnych mikromanipulacji, w tym przykładów, takich jak klasyczny system chimery przepiórka-pisklę do badania losu komórki^2,3, wstrzykiwanie retrowirusów w celu nadekspresji w określonych tkankach podczas rozwoju^4,5 oraz hodowla eksplantatów w celu identyfikacji rozwojowych źródeł sygnalizacji⁶. Niedawne chimery wygenerowane między nieznakowanymi gospodarzami z przeszczepami z transgenicznej linii kurczaków wykazujących ekspresję GFP wykazały, że połączenie klasycznego szczepienia i modyfikacji genetycznej może dostarczyć ważnych informacji na temat rozwoju^7,8.

Łatwość, z jaką można manipulować ptasim embrionem, sprawiła, że jest to doskonały model do badania rozwoju kończyn⁹. Zastosowanie specyficznych czynników wzrostu do rozwoju kończyn in vivo odegrało zasadniczą rolę w identyfikacji czynników, które zmieniają wzorzec kończyn^10,11 i nadal dostarcza informacji na temat tego procesu¹². Podejście to zostało również wykorzystane do zbadania czynników regulujących rozwój mięśni i odkryło rolę wielu sygnałów, takich jak Wnts¹³, BMP¹⁴ i HGF¹⁵.

Ostatnio ta technika została wykorzystana do zbadania sygnałów kontrolujących ekspresję genów miogennych w pąku kończyny i pokazała, że interakcje między FGF18 a kwasem retinowym mogą kontrolować czas ekspresji MyoD¹⁶. Zastosowanie kombinacji czynników wzrostu i małych cząsteczek, które można załadować na kulki, a następnie wszczepić bezpośrednio do określonych tkanek na określonych etapach rozwoju, daje możliwość interwencji w prawie każdym czasie i regionie podczas rozwoju. Wykorzystano to do zbadania wielu procesów, w tym wzorców somitowych^17,18, specyfikacji neuronalnej¹⁹, migracji grzebienia neuronalnego²⁰ i wydłużenia osi²¹.

Tutaj opisujemy metodę szczepienia koralików nasączonych czynnikami wzrostu lub inhibitorami w rozwijających się kończynach kurczaka. Wykorzystano to do określenia wpływu tych sygnałów na miogenezę poprzez analizę ekspresji genów specyficznych dla mięśni z hybrydyzacją in situ. Opisujemy przeszczepy za pomocą kulek nasączonych heparyną, które są używane do czynników wzrostu, lub kulek AG 1-X2 do małych cząsteczek hydrofobowych, takich jak kwas retinowy lub małocząsteczkowe inhibitory określonych szlaków sygnałowych. Dostępne są jednak również inne koraliki, które zostały użyte do dostarczenia zarówno FGF²², jak i Shh²³.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie te eksperymenty są zgodne z wytycznymi etycznymi Uniwersytetu w Nottingham dotyczącymi opieki nad zwierzętami i etyki.

1. Przygotowanie kulek heparyny do szczepienia

1. Przed użyciem dokładnie umyj kulki heparyny w PBS. Uwaga: Koraliki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C jako gnojowica w PBS.
   1. Wybrać kulki do szczepienia, wyjmując je z wyrostka pipetą o pojemności 20 μl do kropli PBS o pojemności 1 ml. Następnie za pomocą mikropipety ustawionej na 2 μl przenieś kulki do kropli PBS o objętości 20 μl na szalce Petriego o średnicy 3 cm. Wybierz koraliki na podstawie rozmiaru i za pomocą stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego przenieś wybrane koraliki za pomocą końcówki do pipety P2; Idealne są te o średnicy około 100 μm.
2. Usuń PBS z koralików. Usuń większość płynu za pomocą pipety o pojemności 20 μl, a pozostałą ciecz za pomocą kapilar za pomocą precyzyjnych kleszczyków zegarmistrzowskich. Uwaga: Ważne jest, aby usunąć jak najwięcej, aby czynnik wzrostu nie został rozcieńczony po dodaniu do kulek.
3. Odpipetować czynnik wzrostu bezpośrednio na kulki. W przypadku FGF18 dodać 0,5 μl rekombinowanego FGF18 rozpuszczonego w 0,5 mg/ml w 0,1% powierzchni ciała w PBS. Umieść kilka kropli wody wokół krawędzi naczynia, aby zapobiec parowaniu płynu.
4. Inkubuj koraliki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń krople wody z naczynia za pomocą pipety Pasteura i umieść na lodzie gotowym do szczepienia.
5. W razie potrzeby (w przypadku przezroczystych kulek) przed szczepieniem przenieś 4-5 kulek do 2% czerwieni fenolowej, aby pomóc je uwidocznić. Wypłukać w PBS przed przeniesieniem do zarodka.

2. Przygotowanie koralików AG 1-X2 do szczepienia

1. Przed użyciem wyprowadzić kulki z 0,2 N kwasem mrówkowym.
   1. Aby to zrobić, użyj szpatułki, aby przenieść kulki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 ml 0,2 N kwasu mrówkowego i myć na platformie do wytrząsania przez 1 godzinę.
   2. Następnie usuń kwas mrówkowy za pomocą pipety p1000 i zastąp go 1 ml wody. Myj przez 1 godzinę i powtórz sześć razy, aby usunąć pozostały kwas mrówkowy.
   3. Usuń pozostały płyn za pomocą pipety p1000 i przechowuj kulki w temperaturze 4 °C. Uwaga: Na tym etapie nie jest konieczne usuwanie całej pozostałej wody.
2. Za pomocą małej szpatułki wyjąć z bulionu małą osadkę kulek o objętości około 5-10 μl na szalkę Petriego o średnicy 3 cm i dodać 1 ml DMSO (lub innego rozpuszczalnika, w którym lek jest rozpuszczony). Uwaga: Powinno to zapewnić kilkaset koralików, z których można wybrać te o odpowiednim rozmiarze.
3. Następnie za pomocą pipety P2 ustawionej na 2 μl przenieś kulki o średnicy około 100 μm do kropli rozpuszczalnika o objętości 20 μl na innej szalce Petriego o średnicy 3 cm.
4. Usunąć rozpuszczalnik za pomocą pipety o pojemności 20 μl, a wszelkie pozostałości rozpuszczalnika za pomocą pipety o pojemności 2 μl. Zastąp 20 μl leku, który ma być zastosowany.
   UWAGA: Aby uzyskać spójność, rozpuścić lek w stężeniu 100 μM w DMSO (lub innym użytym rozpuszczalniku), podwielokrotność do 20 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C, ponieważ niektóre inhibitory drobnocząsteczkowe są niestabilne i najlepiej jest unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. W razie potrzeby rozcieńczyć lek do pożądanego stężenia przed namoczeniem koralików. Dla każdego leku może być konieczne empiryczne określenie skutecznych stężeń.
5. Inkubuj przez 1 godzinę. Chroń przed światłem, ponieważ wiele z tych cząsteczek jest wrażliwych na światło.
6. Przed szczepieniem przenieść 4-5 kulek pipetą p2 ustawioną na 2 μl do 20 μl 2% czerwieni fenolowej rozpuszczonej w wodzie. Wykonaj ten krok za pomocą stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego, aby uwidocznić koraliki. Usuń pojedynczy koralik za pomocą drobnych kleszczyków zegarmistrzowskich lub drucianej pętli i spłucz w PBS przed przeniesieniem do zarodka. Nie pozostawiaj kulek w 2% czerwieni fenolowej na dłużej niż 15 minut przed użyciem, ponieważ może to spowodować utratę aktywności.

3. Przygotowanie igieł wolframowych

1. Pokrój drobny drut wolframowy na odcinki 3-4 cm. Włóż jeden kawałek drutu do końca szklanej pipety Pasteura i rozpuść w palniku Bunsena, aby zamocować na miejscu. Przygotuj do 10 igieł, aby mieć pewność, że są zapasowe, jeśli zostaną uszkodzone podczas użytkowania.
2. Umieść koniec drutu w płomieniu lampy lutowniczej i trzymaj go tam, aż wolfram zaświeci się na biało, a końcówka będzie ostra (około 2-3 min). Uwaga: Podczas użytkowania igłę można w razie potrzeby wyczyścić i ponownie naostrzyć w lampie lutowniczej.
   UWAGA: Igły te mogą być również używane do robienia pętli do przenoszenia koralików. Delikatnie przyłóż igłę do ławki, a ugnie się, tworząc pętlę.

4. Przygotowanie zarodków do przeszczepów koralików

1. Wysiaduj jaja końcem, aż osiągną pożądany etap (3-5 dni w przypadku większości manipulacji pąkami kończyn). Za pomocą kleszczy dotknij końca, aby rozbić skorupę, a następnie użyj kleszczy, aby usunąć skorupę i odsłonić zarodek. Upewnij się, że membrana skorupki jajka również została usunięta.
   UWAGA: 1-2 ml PBS można dodać za pomocą pipety Pasteura, aby pomóc w tym, jeśli membrana przyklei się do żółtka. Delikatnie odpipetuj PBS na powierzchnię żółtka, chwyć błonę kleszkami, uważając, aby nie uszkodzić żółtka, i delikatnie odciągnij je od jajka.
2. Usunąć do 5 ml białka z jaja za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły 19 G. Weź tylko tyle, ile jest to konieczne, aby upewnić się, że zarodek nie styka się z taśmą używaną do uszczelniania komórki jajowej, ponieważ usunięcie większych objętości może zmniejszyć przeżywalność zarodka.
3. Aby uwidocznić zarodek, dodaj 5-6 kropli tuszu Artists India do 15 ml PBS zawierającego 100 U penicyliny i 0,1 mg streptomycyny/ml. Wstrzyknąć 0,5-1 ml bezpośrednio pod zarodek za pomocą strzykawki 1 ml i igły 25 G.
4. Dodać 2-3 ml PBS z 1% płodową surowicą cielęcą i 100 j. penicyliną i 0,1 mg streptomycyny/ml do komórki jajowej, aby upewnić się, że zarodek nie ulegnie odwodnieniu. Za pomocą zaostrzonych kleszczy zegarmistrzowskich usuń błonę witelinową i otwórz owodnię nad rozwijającymi się zawiązkami kończyn. Upewnij się, że zarodek nie wysycha i, jeśli to konieczne, dodaj więcej PBS / FCS.
   UWAGA: Zawiązki kończyn można wyraźnie zobaczyć jako sparowane wyrostki na boku zarodka. Na tych etapach zarodek zmieni się tak, że prawa strona jest zwykle najwyższa. W rezultacie zwykle łatwiej jest przeszczepić koraliki do prawych kończyn i użyć lewych jako kontroli kontralateralnej.
5. Użyj zaostrzonego drutu wolframowego, aby wykonać nacięcie w pąku kończyny, w którym zostanie wszczepiony koralik. Jeśli to możliwe, unikaj przecinania pąka kończyny, chociaż w młodszych stadiach jest to trudne.
   UWAGA: W starszych zarodkach (HH stadium 22 i wyższe) możliwe jest wybranie określonych obszarów zawiązka kończyny do szczepienia, ale w młodszych stadiach jest to trudniejsze, ponieważ sam zawiązek kończyny jest mały. Ważne jest również, aby pamiętać, że pączek kończyny wyrośnie poza szczepiony koralik, więc szczególnie w młodszych stadiach koralik pozostanie w bliższej kończynie.
6. Podnieś koralik z czynnika wzrostu lub leku za pomocą bardzo cienkich kleszczy zegarmistrzowskich lub pętli wykonanej z igły wolframowej. Jeśli kulka została namoczona w DMSO lub czerwieni fenolowej, przed nałożeniem na zarodek spłucz PBS. Przenieś koralik do zarodka za pomocą kleszczy / drucianej pętli. Następnie użyj zaostrzonego drutu wolframowego, aby włożyć koralik w nacięcie.
7. Dodać 1-2 ml PBS/FCS do komórki jajowej, upewniając się, że zarodek jest nawodniony, ale unikaj stosowania bezpośrednio na sam zarodek, ponieważ może to uszkodzić zarodki i spowodować usunięcie kulki. Zamknij jajo taśmą i wróć do inkubatora.

Wyniki

W stadium HH 21 MyoD nie jest ekspresowany w rozwijających się mioblastach kończyn, choć barwienie można zaobserwować w myotomie rozwijających się somytów (Rycina 1A). Rycina 1B przedstawia hybrydyzację in situ dla MyoD 6 h po przeszczepieniu kuleczki z FGF18. Ekspresja MyoD zostaje indukowana w mioblastach znajdujących się blisko kuleczki, podczas gdy w kończynie przeciwległej ekspresja nie występuje. Współprzeszczepienie kuleczki nasączonej U0126, specyficznego inhibitora MEK,...

Dyskusja

Zastosowanie przeszczepów perełkowych stosowanych bezpośrednio do rozwijających się tkanek in ovo jest potężnym narzędziem do analizy roli sygnalizacji czynnika wzrostu podczas rozwoju, dając niezrównaną kontrolę nad etapem rozwoju, na którym są one stosowane, i czasem trwania ekspozycji.

Wybór kulki dla każdego rodzaju cząsteczki jest ważny. Małe cząsteczki hydrofobowe, takie jak opisane tutaj inhibitory i kwas retinowy, zwykle dobrze wiążą się z derywatyzowanymi kulkami AG 1-X2, chociaż koni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Koraliki akrylowe heparyny	Sigma	H5263	Stosowane koraliki akrylowo-heparynowe zostały wycofane z produkcji. Dostępny jest jednak produkt zastępczy, kulki agarozy Heparyny, nr kat. H6508. Są przezroczyste, więc trudniej jest z nimi pracować, ale można je barwić czerwienią fenolową w taki sam sposób, jak koraliki AG 1-X2,
koraliki AG 1-X2	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel niebieskie koraliki	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	Koraliki te były używane z szeregiem czynników wzrostu, w tym Shh i FGF, i mogą być używane do zastąpienia kulek heparyny
FGF18	Peprotech	100-28	Zawiesić w PBS z 0/1% BSA, przygotować jednorazowe porcje 0,5-1ul i przechowywać w temperaturze -80°C. Partie i dostawcy mogą się różnić, dlatego należy testować różne stężenia w celu określenia skutecznej dawki.
U0126	Sygnalizacja komórkowa	9903	Wytwarzać do 20 mM zapasów w DMSO i przechowywać w jednorazowych porcjach w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Chronić przed światłem.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Zawiesić w DMSO i przechowywać w jednorazowych porcjach w temperaturze -80°C. Chronić przed światłem.
atrament	indyjski Windsor i Newton	5012572003384 (30 ml)	Chociaż dostępne są alternatywy dla tego produktu, należy zachować ostrożność, ponieważ niektóre atramenty są toksyczne dla zarodków
Drut wolframowy, średnica 0,1 mm 99,95%	Alfa Aesar	10404
Penicylina / streptomycyna	Sigma	P0781	Rozcieńczyć 100X w PBS / tusz i PBS / FCS