Szczepienie kulek w rozwijających się kończynach zarodka kurczaka w celu identyfikacji szlaków transdukcji sygnału wpływających na ekspresję genów

Podsumowanie

Poprzez szczepienie koralików nasączonych czynnikami wzrostu lub specyficznymi inhibitorami szlaków sygnałowych do rozwijających się zarodków, możliwe jest bezpośrednie testowanie ich efektów in vivo. W tym protokole kulki są szczepione w zawiązku kończyny w celu określenia wpływu tych cząsteczek na ekspresję genów i transdukcję sygnału.

Streszczenie

Za pomocą zarodków kurzych można bezpośrednio przetestować wpływ czynników wzrostu lub specyficznych inhibitorów szlaków sygnałowych na ekspresję genów i aktywację szlaków transdukcji sygnału. Technika ta pozwala na dostarczanie cząsteczek sygnałowych w ściśle określonych stadiach rozwojowych przez określony czas. Następnie można pobrać zarodki i zbadać ekspresję genów, na przykład poprzez hybrydyzację in situ lub aktywację szlaków transdukcji sygnału obserwowaną za pomocą barwienia immunologicznego.

W tym filmie kulki heparyny nasączone FGF18 lub AG 1-X2 nasączone U0126, inhibitorem MEK, są wszczepiane do pąka kończyny in ovo. Pokazuje to, że FGF18 indukuje ekspresję fosforylacji MyoD i ERK, a zarówno endogenna, jak i indukowana przez FGF18 ekspresja MyoD jest hamowana przez U0126. Kulki nasączone antagonistą kwasu retinowego mogą nasilać przedwczesną indukcję MyoD przez FGF18.

To podejście może być stosowane z szeroką gamą różnych czynników wzrostu i inhibitorów i jest łatwo dostosowane do innych tkanek w rozwijającym się zarodku.

Wprowadzenie

Ptasie embriony od^{wielu lat dostarczają} potężnego narzędzia do badania rozwoju1. Jedną z ich najbardziej przydatnych cech jest to, że są stosunkowo łatwe do manipulowania. Rozwój zewnętrzny umożliwia otwarcie komórki jajowej w celu uzyskania dostępu do zarodka i wykonanie różnych mikromanipulacji, w tym przykładów, takich jak klasyczny system chimery przepiórka-pisklę do badania losu komórki^2,3, wstrzykiwanie retrowirusów w celu nadekspresji w określonych tkankach podczas rozwoju^4,5 oraz hodowla eksplantatów w celu identyfikacji rozwojowych źródeł sygnalizacji⁶. Niedawne chimery wygenerowane między nieznakowanymi gospodarzam....

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie te eksperymenty są zgodne z wytycznymi etycznymi Uniwersytetu w Nottingham dotyczącymi opieki nad zwierzętami i etyki.

1. Przygotowanie kulek heparyny do szczepienia

1. Przed użyciem dokładnie umyj kulki heparyny w PBS. Uwaga: Koraliki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C jako gnojowica w PBS.
   1. Wybrać kulki do szczepienia, wyjmując je z wyrostka pipetą o pojemności 20 μl do kropli PBS o pojemności 1 ml. Następnie za pomocą mikropipety ustawionej na 2 μl przenieś kulki do kropli PBS o objętości 20 μl na szalce Petriego o średnicy 3 cm. Wybierz koraliki na podstawie ro....

Wyniki

Na etapie HH 21 MyoD nie ulega ekspresji w rozwijających się mioblastach kończyn, chociaż można zobaczyć barwienie w miotomii rozwijających się somitów (Rysunek 1A). Rysunek 1B przedstawia hybrydyzację in situ dla MyoD 6 godzin po przeszczepie kulki FGF18. MyoD jest indukowany w mioblastach w pobliżu koralika, podczas gdy nie ma ekspresji w przeciwległej kończynie. Współszczepienie kulki nasączonej U0126, specyficznym inhibitorem MEK, blokuje indukcję FGF18 MyoD (Figura .......

Dyskusja

Zastosowanie przeszczepów perełkowych stosowanych bezpośrednio do rozwijających się tkanek in ovo jest potężnym narzędziem do analizy roli sygnalizacji czynnika wzrostu podczas rozwoju, dając niezrównaną kontrolę nad etapem rozwoju, na którym są one stosowane, i czasem trwania ekspozycji.

Wybór kulki dla każdego rodzaju cząsteczki jest ważny. Małe cząsteczki hydrofobowe, takie jak opisane tutaj inhibitory i kwas retinowy, zwykle dobrze wiążą się z derywatyzowanymi kulkami AG 1-X2, chociaż koni.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Koraliki akrylowe heparyny	Sigma	H5263	Stosowane koraliki akrylowo-heparynowe zostały wycofane z produkcji. Dostępny jest jednak produkt zastępczy, kulki agarozy Heparyny, nr kat. H6508. Są przezroczyste, więc trudniej jest z nimi pracować, ale można je barwić czerwienią fenolową w taki sam sposób, jak koraliki AG 1-X2,
koraliki AG 1-X2	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel niebieskie koraliki	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	Koraliki te były używane z szeregiem czynników wzrostu, w tym Shh i FGF, i mogą być używane do zastąpienia kulek heparyny
FGF18	Peprotech	100-28	Zawiesić w PBS z 0/1% BSA, przygotować jednorazowe porcje 0,5-1ul i przechowywać w temperaturze -80°C. Partie i dostawcy mogą się różnić, dlatego należy testować różne stężenia w celu określenia skutecznej dawki.
U0126	Sygnalizacja komórkowa	9903	Wytwarzać do 20 mM zapasów w DMSO i przechowywać w jednorazowych porcjach w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Chronić przed światłem.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Zawiesić w DMSO i przechowywać w jednorazowych porcjach w temperaturze -80°C. Chronić przed światłem.
atrament	indyjski Windsor i Newton	5012572003384 (30 ml)	Chociaż dostępne są alternatywy dla tego produktu, należy zachować ostrożność, ponieważ niektóre atramenty są toksyczne dla zarodków
Drut wolframowy, średnica 0,1 mm 99,95%	Alfa Aesar	10404
Penicylina / streptomycyna	Sigma	P0781	Rozcieńczyć 100X w PBS / tusz i PBS / FCS