Optogenetyczny funkcjonalny rezonans magnetyczny

Summary

Ten protokół opisuje kroki i analizę danych wymaganych do pomyślnego przeprowadzenia optogenetycznego funkcjonalnego rezonansu magnetycznego (ofMRI). ofMRI to nowatorska technika, która łączy odczyt fMRI w wysokim polu ze stymulacją optogenetyczną, pozwalając na specyficzne dla typu komórki mapowanie funkcjonalnych obwodów nerwowych i ich dynamiki w całym żywym mózgu.

Abstract

Badanie funkcjonalnej łączności precyzyjnych obwodów nerwowych w całym nienaruszonym mózgu można osiągnąć za pomocą optogenetycznego funkcjonalnego rezonansu magnetycznego (MRI), który jest nowatorską techniką, która łączy stosunkowo wysoką rozdzielczość przestrzenną wysokopolowego fMRI z precyzją stymulacji optogenetycznej. Światłowody, które umożliwiają dostarczanie określonych długości fal światła w głąb mózgu in vivo, są wszczepiane w obszary zainteresowania w celu specyficznej stymulacji docelowych typów komórek, które zostały genetycznie indukowane do ekspresji światłoczułych transbłonowych kanałów przewodnictwa, zwanych opsynami. fMRI służy do zapewnienia nieinwazyjnej metody określania globalnej dynamicznej odpowiedzi mózgu na optogenetyczną stymulację określonych obwodów nerwowych poprzez pomiar sygnału zależnego od poziomu tlenu we krwi (BOLD), który zapewnia pośredni pomiar aktywności neuronalnej. Protokół ten opisuje budowę implantów światłowodowych, operacje implantacji, obrazowanie z fotostymulacją oraz analizę danych wymaganych do pomyślnego wykonania rezonansu magnetycznego. Podsumowując, precyzyjna stymulacja i zdolność monitorowania całego mózgu przez rezonans magnetyczny są kluczowymi czynnikami, które sprawiają, że rezonans magnetyczny jest potężnym narzędziem do badania konektomiki mózgu zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym.

Introduction

Optogenetyczne funkcjonalne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) to nowatorska technika, która łączy rozdzielczość przestrzenną wysokopolowego fMRI z precyzją stymulacji optogenetycznej^1-11,38, umożliwiając specyficzne dla typu komórki mapowanie funkcjonalnych obwodów nerwowych i ich dynamiki w całym mózgu. Optogenetyka pozwala na ukierunkowanie określonych typów komórek na stymulację poprzez wprowadzenie światłoczułych transbłonowych kanałów przewodnictwa, zwanych opsynami. Określone elementy obwodów neuronalnych są genetycznie modyfikowane w celu ekspresji tych kanałów, umożliwiając modulację aktywności w nienaruszonym mózgu w skali milisekundowej^1-15. fMRI zapewnia nieinwazyjną metodę określania globalnej dynamicznej odpowiedzi mózgu na optogenetyczną stymulację określonych obwodów nerwowych poprzez pomiar sygnału zależnego od poziomu tlenu we krwi (BOLD)^16-18, który zapewnia pośredni pomiar aktywności neuronalnej.

Połączenie tych dwóch technik, określanych jako optogenetyczne funkcjonalne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), jest korzystniejsze w porównaniu z innymi metodami rejestrowania aktywności mózgu podczas stymulacji, takimi jak elektrofizjologia, ponieważ może zapewnić widok całego mózgu w stosunkowo wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Umożliwia to wykrycie aktywności neuronalnej w odpowiedzi na ukierunkowaną stymulację w dużych odległościach od miejsca stymulacji bez konieczności wszczepiania inwazyjnych elektrod rejestrujących^1-11. ofMRI jest korzystniejsza w porównaniu z bardziej tradycyjną metodą wykonywania stymulacji elektrycznej podczas fMRI, która może rekrutować różne typy komórek w pobliżu elektrody, a tym samym zakłócać przyczynowy wpływ każdej populacji¹⁹. Ponadto elektrody używane do stymulacji elektrycznej i generowany prąd mogą powodować artefakty podczas obrazowania MR²⁰. Rzeczywiście, ofMRI umożliwia obserwację wpływu na globalną aktywność mózgu wynikającego ze specyficznej modulacji szerokiej gamy typów komórek dzięki zastosowaniu zaawansowanych technik celowania genetycznego, takich jak system Cre-Lox u zwierząt transgenicznych lub stosowanie promotorów. Kombinatoryczna kontrola optyczna z monitorowaniem całego mózgu jest możliwa za pomocą ofMRI dzięki zastosowaniu zarówno NpHR do hamowania, jak i ChR2 do pobudzania określonych typów komórek. Zestaw narzędzi optogenetycznych dostępnych do stosowania w MRI również szybko się poprawia wraz z upływem czasu dzięki wprowadzeniu opsyn o zwiększonej wrażliwości na światło lub ulepszonej kinetyce, stabilizowanych opsyn o funkcji krokowej (SSFO) lub opsyn przesuniętych ku czerwieni, które mogą negować wymóg wszczepiania światłowodów, umożliwiając nieinwazyjną stymulację podczas obrazowania²¹. Te możliwości nie są dostępne w przypadku stymulacji elektrycznej.

Jednak artefakty sygnałowe wynikające z ogrzewania tkanek z powodu dostarczania światła do mózgu zostały zgłoszone²², gdzie wykazano, że wywołana temperaturą modyfikacja czasów relaksacji powoduje pseudo aktywację. Badacze wykonujący rezonans magnetyczny powinni być zatem świadomi tego potencjalnego zamieszania. Dzięki odpowiedniej konfiguracji i kontrolkom problem można rozwiązać. Dodatkowo, stosunkowo niska rozdzielczość czasowa pomiaru odpowiedzi hemodynamicznej w fMRI może być czynnikiem ograniczającym dla niektórych zastosowań tej techniki.

Ten protokół najpierw opisuje budowę implantów światłowodowych, które umożliwiają dostarczanie określonych długości fal światła w głąb mózgu in vivo. Protokół opisuje następnie dostarczenie wektora wirusowego kodującego opsynę do precyzyjnego obszaru mózgu za pomocą chirurgii stereotaktycznej. Następnie w protokole opisano proces funkcjonalnego rezonansu magnetycznego całego mózgu podczas jednoczesnej stymulacji światłem. Na koniec protokół przedstawia podstawową analizę pozyskanych danych.

Warto zauważyć, że opisana tutaj optogenetyka wymaga przewlekłego implantu do dostarczania światła. Jednak implanty światłowodowe są stabilne i biokompatybilne, co pozwala na skanowanie podłużne i badanie obwodów nerwowych przez okres miesięcy^23,24.

Podsumowując, precyzyjna stymulacja i zdolność monitorowania całego mózgu przez MRI są kluczowymi czynnikami, które sprawiają, że ofMRI jest potężnym narzędziem do badania konektomiki mózgu. Ponadto może dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów chorób neurologicznych²⁵ w połączeniu z różnymi modelami zwierzęcymi. Rzeczywiście, ofMRI został wykorzystany do wyjaśnienia aktywności sieciowej różnych podregionów hipokampa związanych z napadami padaczkowymi⁸. Dlatego laboratoria zainteresowane odpowiedziami na pytania neurobiologiczne na poziomie systemowym uznają tę technikę za ważną.

Protocol

Oświadczenie etyczne: Procedury eksperymentalne tutaj zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanforda (IACUC).

1. Przygotowanie krosowych i implantów okuć

Uwaga: Chociaż krosowe i implanty okuć są dostępne na rynku, produkcja tych we własnym zakresie umożliwia specjalistyczne projekty i będzie kosztować mniej.

1. Aby przygotować światłowodowy do dostarczania światła z lasera do implantu w mózgu, najpierw należy rozciąć światłowód na żądaną długość.
   1. Za pomocą tasaka światłowodowego zakończ światłowód, aby uzyskać płaski koniec w punkcie zakończenia. Jeśli włókno zostało pokryte kurtką, należy ją wcześniej zdjąć za pomocą narzędzia do ściągania izolacji.
   2. Rozetnij drugi koniec światłowodu, aby uzyskać żądaną długość, upewniając się, że jest wystarczająco długi, aby rozciągać się od źródła światła do zwierzęcia wewnątrz otworu skanera.
2. Wymieszaj niewielką ilość kleju epoksydowego w stosunku 1:1 z kawałkiem folii aluminiowej na krótko przed kolejnym krokiem, ponieważ klej epoksydowy staje się zbyt lepki, aby użyć go 5 minut po wymieszaniu.
3. Za pomocą małego drewnianego patyczka delikatnie nałóż klej epoksydowy na część włókna, która zostanie umieszczona wewnątrz wklęsłej strony ceramicznej skuwki, a następnie nałóż niewielką kroplę na powierzchnię płaskiej strony skuwki. Po włożeniu go do tulejki upewnij się, że niewielka długość włókna (<0,5 mm) wystaje z płaskiej strony ceramicznej skuwki. Pozwól klejowi epoksydowemu stwardnieć O/N, aby uzyskać optymalne rezultaty.
4. Po stronie światłowodowego, który połączy się z laserowym źródłem światła, delikatnie nałóż klej epoksydowy na część włókna, która zostanie umieszczona wewnątrz wklęsłej strony tulejki złącza FC/PC, a następnie nałóż niewielką kroplę na powierzchnię płaskiej strony tulejki. Po włożeniu go do tulejki upewnij się, że niewielka długość włókna (<0,5 mm) wystaje z płaskiej strony skuwki. Pozwól klejowi epoksydowemu stwardnieć O/N, aby uzyskać optymalne rezultaty.
5. Wypoleruj płaski koniec tulejek po obu stronach za pomocą tarczy polerskiej za pomocą pęsety, aby delikatnie docisnąć tuleję w dół, wykonując obroty w kształcie ósemki na arkuszach docierających z tlenku glinu (od 3 μm do 1 μm do 0,3 μm).
6. Zbadaj płaski koniec skuwki pod mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu. Upewnij się, że powierzchnia płaskiego końca, w tym sama powierzchnia światłowodu, jest wolna od kleju epoksydowego; Kontynuuj polerowanie, jeśli na powierzchni pozostanie klej epoksydowy. Upewnij się, że powierzchnia światłowodu nie jest uszkodzona ani wyszczerbiona.
   UWAGA: Upewnij się, że personel bierze udział w odpowiednich zajęciach z bezpieczeństwa laserowego i nosi laserowe okulary ochronne przed obsługą sprzętu laserowego.
7. Podłącz światłowodowy krosowy do laserowego źródła światła za pomocą złącza FC/PC i wyrównaj końcówkę światłowodu z punktem ogniskowym łącznika. Zmierz moc transmisji światła światłowodu za pomocą miernika mocy, aby zapewnić odpowiednią moc światła.
   Uwaga: Poniższe kroki dotyczą przygotowania ceramicznych okuć ze światłowodami do przewlekłej implantacji do mózgu; Ceramiczne skuwki są puste w środku i przenoszą światłowody, które dostarczają światło z krosowego do obszaru zainteresowania (ROI) w mózgu.
8. Za pomocą tasaka światłowodowego zakończ światłowód, aby uzyskać płaski koniec w punkcie zakończenia. Jeśli włókno zostało pokryte kurtką, należy ją wcześniej zdjąć za pomocą narzędzia do ściągania izolacji.
9. Rozetnij drugi koniec światłowodu, aby uzyskać pożądaną długość do implantacji w mózgu. Określ długość włókna za pomocą atlasu stereotaktycznego, aby określić ROI w mózgu.
   1. Na przykład: aby celować w grzbietowy hipokamp u szczura, który znajduje się 3,5 mm poniżej bregmy, upewnij się, że długość włókna wystającego z ferruli wynosi 3,5 mm + 0,25 mm, biorąc pod uwagę grubość czaszki i dopuszczając margines błędu. Dlatego sprawdź, czy końcowa długość włókna wynosi 3,5 mm + 0,25 mm + 10,5 mm (długość tulejki) = 14,25 mm.
10. Wymieszaj niewielką ilość kleju epoksydowego w stosunku 1:1 z kawałkiem folii aluminiowej na krótko przed kolejnym krokiem (klej epoksydowy staje się zbyt lepki do użycia po 5 minutach od wymieszania).
11. Za pomocą małego drewnianego patyczka delikatnie nałóż klej epoksydowy na część włókna, która zostanie umieszczona wewnątrz wklęsłej strony ceramicznej skuwki, a następnie nałóż niewielką kroplę na powierzchnię płaskiej strony skuwki. Po włożeniu go do tulejki upewnij się, że niewielka długość włókna (<0,5 mm) wystaje z płaskiej strony ceramicznej skuwki. Pozwól klejowi epoksydowemu stwardnieć O/N, aby uzyskać optymalne rezultaty.
12. Wypoleruj płaski koniec tulejki za pomocą tarczy polerskiej za pomocą pęsety, aby delikatnie docisnąć tuleję w dół, wykonując obroty w kształcie cyfry 8 na arkuszach docierających z tlenku glinu (od ziarnistości 3 μm do 1 μm do 0,3 μm).
13. Zbadaj płaski koniec skuwki pod mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu. Upewnij się, że powierzchnia płaskiego końca, w tym sama powierzchnia światłowodu, jest wolna od kleju epoksydowego; Kontynuuj polerowanie, jeśli na powierzchni pozostanie klej epoksydowy. Upewnij się, że powierzchnia światłowodu nie jest pęknięta ani wyszczerbiona.
14. Połącz polerowaną tulejkę ze światłowodowym krosowym za pomocą tulei tulejowej i podłącz krosowy do laserowego źródła światła. Zmierz moc transmisji światła na końcówce światłowodu za pomocą miernika mocy, aby zapewnić odpowiednią wydajność.
15. Prowadź dziennik mocy wyjściowej wymaganej z tulejki krosowego dla każdego implantu tulejki, aby wyprowadzić żądany poziom mocy na końcówce światłowodu (2.5 mW w tym protokole). Odrzuć tulejki o współczynniku tłumienia ponad 50% i z nieokrągłym wzorcem wyjściowym.

2. Stereotaktyczna chirurgia implantacji i wstrzyknięcie wirusa

1. Należy zapewnić, że wszelkie procedury doświadczalne obejmujące wykorzystanie zwierząt są zatwierdzone przez lokalny IACUC. Utrzymuj warunki aseptyczne podczas operacji przetrwania, przestrzegając procedur aseptycznych, w tym używając sterylnych rękawiczek, sterylnych masek, sterylnych obłożeń chirurgicznych i sterylizowanych narzędzi chirurgicznych.
   UWAGA: Przed rozpoczęciem zabiegu upewnij się, że chirurdzy noszą odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym okulary ochronne. Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami bezpieczeństwa biologicznego podczas pracy z wektorem związanym z adenowirusem (AAV), uważając, aby uniknąć rozpryskiwania. Odpady AAV należy wyrzucać do pojemnika na zagrożenia biologiczne.
2. Do mikrolitrowej strzykawki należy załadować wystarczającą ilość AAV do wstrzyknięcia zwierzęciu plus dodatkową ilość w celu uwzględnienia potencjalnych strat objętości (łącznie 4 μl na zwierzę), trzymając strzykawkę na lodzie przed użyciem. W tym protokole stosuje się AAV5-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP przy mianie 4x10¹² vg/ml. Umieścić zwierzę w znieczuleniu izofluranem za pomocą komory indukcyjnej, podłączonej do precyzyjnego parownika izofluranu ustawionego na 3 - 4% ze źródłem tlenu gazowego.
3. Ogol głowę elektryczną maszynką do golenia i wykonaj potrójny peeling chirurgiczny na skórze przy użyciu betadyny i płukanki z 70% etanolu.
4. Gdy zwierzę znajdzie się w głębokim znieczuleniu (sprawdź odruch u nogi i częstość oddechów), unieruchom czaszkę zwierzęcia w aparacie stereotaktycznym z wewnątrzusznymi kołkami pozycjonującymi i listwą zębatą.
   Uwaga: Cała procedura zajmie 1-2 godziny, od indukcji znieczulenia do rekonwalescencji.
5. Ustaw znieczulenie na odpowiedni poziom (1 - 3% izofluranu w parowniku) i stale monitoruj parametry życiowe zwierzęcia, dostosowując znieczulenie w razie potrzeby, aby utrzymać częstość oddechów ~40 oddechów/min. Podaj maść okulistyczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
6. Wykonaj nacięcie skóry głowy o długości 15 - 20 mm w linii środkowej za pomocą skalpela i cofnij skórę głowy za pomocą hemostatyków chirurgicznych przymocowanych do okostnej. Odwołaj się do lambda i bregma, aby ustawić wiertło nad współrzędnymi ROI.
7. Wywierć małą kraniotomię (2 - 3 mm) nad ROI za pomocą wiertła dentystycznego, uważając, aby nie przebić mózgu. Powoli wprowadzić igłę przymocowaną do mikrolitrowej strzykawki przez kraniotomię do ROI w mózgu.
8. Za pomocą sterownika pompy mikrostrzykawkowej wstrzyknąć 2 μl roztworu wektorowego do ROI. Użyj natężenia przepływu 150 nl/min, aby uniknąć uszkodzenia tkanek. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać 10 minut przed powolnym wyjęciem strzykawki z szybkością 0,5 mm/min.
9. Po wstrzyknięciu należy osuszyć powierzchnię czaszki. Odwołaj się do lambda i bregma, aby potwierdzić współrzędne, a następnie włóż implant okucia na docelową głębokość (na przykład: 3,5 mm poniżej bregmy dla grzbietowego hipokampa) z prędkością około 0,5 mm/min. Zamontuj implant okucia do czaszki za pomocą cementu dentystycznego. Po zastygnięciu cementu dentystycznego uszczelnij nacięcie szwami (rozmiar 5-0 dla szczurów) wokół nasadki z cementu dentystycznego.
10. Po operacji umieść zwierzę w klatce pojedynczo z połową klatki na grzejniku w celu odzyskania znieczulenia. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Nie umieszczaj zwierzęcia w towarzystwie innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
11. W leczeniu bólu po operacji należy podawać buprenorfinę podskórnie co 12 godzin w dawce 0,05 mg/kg przez 24 godziny. Antybiotyk w proszku należy podawać codziennie w miejsce nacięcia przez 3 dni.
12. Usuń szwy około dwa tygodnie po zabiegu, aby zapobiec powstawaniu strupów.
13. Odczekaj 4 - 6 tygodni po wstrzyknięciu wirusa, aby uzyskać wystarczającą ekspresję genów optogenetycznych przed wykonaniem eksperymentów.

3. Optogenetyczny funkcjonalny rezonans magnetyczny

UWAGA: Zachowaj ostrożność w odniesieniu do stałego pola magnetycznego skanera MRI. Zabezpiecz sprzęt, w tym generator funkcyjny, źródło światła, wentylator, kapnograf i zbiorniki gazu, wystarczająco daleko (co najmniej powyżej limitu 5 Gaussów).

1. Umieść zwierzę w znieczuleniu gazowym za pomocą komory indukcyjnej, podłączonej do precyzyjnego parownika izofluranu ustawionego na 5% ze źródłem tlenu gazowego.
2. Gdy zwierzę znajdzie się w głębokim znieczuleniu (sprawdź odruch u nogi i częstość oddechów), zaintubuj zwierzę zgodnie z protokołem szczegółowo opisanym w Rivard et al. (2006), aby umożliwić monitorowanie dwutlenku węgla za pomocą kapnografii²⁶. Uwaga: intubacja ma kluczowe znaczenie dla utrzymania prawidłowego poziomu wydechowego CO₂ podczas obrazowania.
3. Zabezpiecz zwierzę w uchwycie skanera.
   Uwaga: W tym protokole kołyska została wyprodukowana na zamówienie, ale takie kołyski są również dostępne na rynku. Kołyska dla szczurów służy do zabezpieczania zwierzęcia w skanerze w celu podania znieczulenia, ogrzanego powietrza i ograniczenia ruchu.
4. Dostarczyć mieszaninę izofluranu (w zakresie od 1,2 do 1,5%) w około 60% podtlenku azotu i 40% tlenu przez rurki przez kołyskę. Upewnij się, że głowa zwierzęcia jest bezpiecznie zamocowana, aby uniknąć artefaktów ruchu.
5. Przeprowadź ogrzane powietrze przez rurki w kołysce i włóż termometr doodbytniczy ze smarem, aby monitorować temperaturę ciała. Podawaj maść okulistyczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
6. Podłącz światłowodowy krosowy do laserowego źródła światła i zmierz moc wyjściową na końcówce tulejki krosowego za pomocą miernika mocy.
7. Dostosuj do odpowiedniego poziomu mocy (określonego wcześniej w kroku 1.15), aby wytworzyć pożądaną moc wyjściową (2,5 mW w tym protokole) na końcówce światłowodu wszczepionego do mózgu. Ponieważ nadmierna moc wyjściowa ze światłowodu może potencjalnie spowodować uszkodzenie tkanek wewnątrz mózgu lub spowodować nagrzewanie się tkanek, które spowoduje artefakty sygnału, nie należy znacząco zwiększać mocy wyjściowej lasera poza zamierzoną moc wyjściową.
8. Zapobiegaj wyciekowi światła z implantu za pomocą stożka z czarnej taśmy izolacyjnej i zakryj oczy zwierzęcia. Podłącz światłowodowy do implantu okucia na zwierzęciu za pomocą tulei z tuleją.
9. Umieść cewkę nad głową zwierzęcia. Włóż podstawkę ze zwierzęciem do otworu skanera.
   Uwaga: W tym protokole cewka nadawczo-odbiorcza z pojedynczą pętlą została wyprodukowana na zamówienie i wstępnie dostrojona do odbioru optymalnej częstotliwości radiowej z tkanki mózgowej.
10. Monitoruj częstość oddechów i temperaturę ciała przez cały ten proces, dostosowując sztuczny wentylator i grzałkę w razie potrzeby, aby utrzymać wartości fizjologiczne w granicach (upewnij się, że wydechowy CO₂ wynosi 3 - 4%, obracając pokrętła na respiratorze w celu regulacji częstotliwości i objętości skoku oraz że temperatura wynosi 37 °C, klikając strzałki ustawienia temperatury).
11. Wybierz sekwencję pozycjonowania, aby zobrazować położenie głowy zwierzęcia. Jeśli mózg nie znajduje się w izocentrum, dostosuj położenie głowy zwierzęcia i powtarzaj skanowanie pozycjonowania, aż mózg znajdzie się w izocentrum. Wybierz sekwencję podkładek liniowych i kliknij przycisk Załaduj w oknie wyboru sekwencji. Następnie kliknij start, aby zmniejszyć niejednorodności pola magnetycznego.
    Uwaga: Shimming jest krytycznym krokiem, który bezpośrednio wpłynie na integralność danych fMRI.
12. Wybierz sekwencję ważoną T2 i kliknij przycisk załaduj w oknie wyboru sekwencji. Następnie kliknij start, aby uzyskać T2-zależne obrazy anatomiczne koronalne o wysokiej rozdzielczości przed fMRI, aby sprawdzić ogólną integralność mózgu i potwierdzić lokalizację implantu światłowodowego.
    Uwaga: Obrazy te mogą być używane jako nakładki anatomiczne do serii skanów ofMRI.
13. Podłącz BNC z portu wyzwalającego skanera MRI do generatora funkcyjnego, tak aby laserowe źródło światła było sterowane zgodnie z eksperymentalnym paradygmatem stymulacji.
    Uwaga: W tym protokole paradygmat stymulacji to 30 sekund linii bazowej, po której następuje 20 sekund włączenia/40 sekund wyłączenia na sześć minut.
14. Wybierz wieloplasterkową sekwencję powtórzonego echa gradientu (GRE) i kliknij przycisk wczytaj w oknie wyboru sekwencji. Następnie kliknij przycisk start, aby uzyskać wycinki koronalne w płaszczyźnie o wymiarach 35 mm x 35 mm (pole widzenia 2D) o rozdzielczości przestrzennej 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm.
    Uwaga: Zastosowana tutaj sekwencja GRE ma czas powtarzania (TR) i czas echa (TE) TR/TE = 750/12 ms i kąt obrotu 30°.
15. Po zakończeniu skanowania wyjmij zwierzę ze skanera i monitoruj, aż obudzi się ze znieczulenia i będzie w stanie utrzymać leżący mostek.

4. Analiza danych MRI

Uwaga: Następujące kroki są wykonywane w MATLAB, jak opisano w publikacji na temat wysokiej przepustowości MRI²⁷.

1. Po przesłaniu surowych danych skanowania do komputera używanego do analizy, użyj rekonstrukcji w oknie przesuwnym, aby aktualizować obraz co TR, z odczytem spirali z czterema przeplotami, 750 ms TR i 12 ms czasu echa, aby uzyskać 23 wycinki na serię skanowania. Zamiast konwencjonalnej rekonstrukcji, w której nowe obrazy fMRI są rekonstruowane dopiero po uzyskaniu wszystkich przekładek dla każdego przekroju, metoda rekonstrukcji z okienkiem przesuwnym rekonstruuje obrazy po uzyskaniu każdego międzywarstwowego²⁷.
2. Przetwarzanie nieprzetworzonych danych w celu dwuwymiarowej rekonstrukcji siatki, korekcji ruchu i obliczania szeregów czasowych zgodnie z wcześniejszym opisem²⁷.
3. Użyj metody koherencji progowej, aby określić aktywowane woksele, obliczając procentową modulację sygnału BOLD każdego woksela w stosunku do okresu bazowego zebranego przed stymulacją, jak opisano wcześniej²⁷. Oblicz wartości koherencji jako wielkość transformaty Fouriera przy częstotliwości powtarzających się cykli stymulacji podzielona przez sumę kwadratów wszystkich składowych częstotliwości⁸.
4. Korzystając z danych szeregów czasowych dla każdego woksela, najpierw uśrednij obrazy z korekcją ruchu, które należą do kolejnych skanów tego samego paradygmatu stymulacji. Następnie wyrównaj średnie obrazy 4D do wspólnego układu współrzędnych z transformacją ciała sztywnego o sześciu stopniach swobody oraz skalowaniem izotropowym w celu porównania w obrębie zwierząt i między nimi, jak opisano wcześniej²⁷.

Results

Rysunek 1 i Rysunek 2 pokazują reprezentatywne dane wynikające z optogenetycznej stymulacji kory ruchowej 20 Hz (szerokość impulsu 15 ms, 473 nm, 30% cyklu pracy). Zastosowano paradygmat stymulacji wynoszący 30 sekund wartości wyjściowej, a następnie 20 sekund włączenia / 40 sekund wyłączenia przez sześć minut. Wcześniejsze badania wykazały, że paradygmat ten wytwarza silny sygnał BOLD ze stymulacji optogenetycznej^1,8. Rycina 1 przedstawia aktywowane woksele wykryte zarówno w lokalnym miejscu stymulacji (kora ruchowa), jak i we wzgórzu, w wyniku połączeń synaptycznych dalekiego zasięgu między tymi regionami. Rycina 2 pokazuje, że informacje czasowe można uzyskać z HRF, ponieważ odpowiedź wzgórza jest opóźniona (niższe nachylenie początkowe) w porównaniu z odpowiedzią kory ruchowej po stymulacji optogenetycznej.

Ryc. 1. Mapa aktywacji sygnału BOLD indukowanego przez optogenetyczną stymulację komórek wykazujących ekspresję CaMKIIa w korze ruchowej. Wartości koherencji aktywnych wokseli, zidentyfikowanych jako te istotnie zsynchronizowane z powtarzającymi się stymulacjami, są pokazane nałożone na koronalny wycinek anatomiczny zależny od T2. Dane zebrane w okresie sześciu minut i 30 sekund (początkowa linia bazowa 30 sekund i sześć cykli stymulacji po 20 sekund włączenia/40 sekund wyłączenia przy świetle 473 nm, 20 Hz, szerokość impulsu 15 ms) są skondensowane w jedną mapę aktywacji. Sekwencyjne plastry są oddalone od siebie o 0,5 mm, a położenie implantu światłowodowego jest oznaczone trójkątem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Funkcja odpowiedzi hemodynamicznej. (Po lewej) Procentowa modulacja sygnału BOLD w stosunku do wartości wyjściowej jest pokazana dla aktywnych wokseli w korze ruchowej i wzgórzu podczas optogenetycznej stymulacji kory ruchowej (sześć cykli stymulacji po 20 sekund włączenia/40 sekund wyłączenia przy świetle 473 nm, 20 Hz, szerokość impulsu 15 ms). Zacienione szare paski błędów oznaczają błąd standardowy dla aktywowanych wokseli w ramach ROI. (Po prawej) Odpowiedzi uśrednione w czasie są udzielane przez funkcje odpowiedzi hemodynamicznej (HRF). HRF wzgórza wykazuje opóźnioną odpowiedź w stosunku do stymulowanej kory ruchowej. Niebieskie paski wskazują okresy fotostymulacji 473 nm. Zacienione szare paski błędów oznaczają błąd standardowy w sześciu cyklach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Ruch obiektu podczas obrazowania jest istotnym źródłem artefaktów, które mogą prowadzić do uszkodzenia danych. Odpowiednie zabezpieczenie zwierzęcia na kołysce do obrazowania może zminimalizować takie artefakty, jak utrzymanie odpowiedniego poziomu znieczulenia. W tym przypadku zastosowaliśmy izofluran, ale należy również rozważyć alternatywne środki znieczulające, takie jak medetomidyna lub ketamina i ksylazyna. Jednak poziom i wybór środka znieczulającego mogą wpływać na wiele parametrów w mózgu, w tym na odpowiedź BOLD²⁸. Izofluran może powodować zmiany w pobudliwości neuronów²⁹. Inne środki znieczulające mogą również wpływać na hamowanie synaptyczne GABA³⁰. Dlatego wybór znieczulenia jest ważny podczas wykonywania rezonansu magnetycznego ze względu na jego zdolność do wpływania na aktywność neuronów. rezonans magnetyczny przy braku znieczulenia jest możliwy, ale może być trudny przy zwiększonym ruchu zwierzęcia, który można zmniejszyć, jeśli zwierzę jest przyzwyczajone; takie badania MRI na jawie były już wcześniej przeprowadzane i pozwoliłyby uniknąć mylącego wpływu znieczulenia na mózg^9,10. Algorytmy korekcji ruchu w post-processingu mogą być wykorzystywane do znacznego łagodzenia skutków ruchu. Istnieje kilka takich metod, w tym odwrotny algorytm Gaussa-Newtona zastosowany w tym protokole, który minimalizuje funkcję sumy kwadratów kosztu obrazu referencyjnego i obrazu poddanego korekcji. Algorytm jest użyteczny, ponieważ umożliwia szybką i solidną korekcję ruchu, wykorzystując konstrukcję platformy równoległej GPU w celu skrócenia czasu przetwarzania²⁷.

Do rekonstrukcji danych w tym protokole użyto niestandardowego oprogramowania napisanego w środowisku MATLAB do dwuwymiarowej rekonstrukcji siatki, w której próbki spiralne są rekonstruowane w przestrzeni k w postaci obrazów w siatce^31-33. Dane szeregów czasowych zostały wygenerowane poprzez obliczenie procentowej modulacji sygnału BOLD każdego woksela w stosunku do okresu bazowego zebranego przed stymulacją. Woksele, których szeregi czasowe były zsynchronizowane z blokami stymulacji optogenetycznej o wartości koherencji 0,35 lub większej, zdefiniowano jako woksele aktywowane; ta wartość koherencji odpowiada wartości mniejszej niż ^10-9 P⁸. Wartości koherencji obliczono jako wielkość transformaty Fouriera przy częstości powtarzających się cykli stymulacji podzieloną przez sumę kwadratów wszystkich składowych częstotliwości^8,27. Błąd rodzinny można kontrolować za pomocą poprawki Bonferroniego do wielokrotnych porównań. Można stosować alternatywne metody analizy, w tym parametryczne testy statystyczne, takie jak ogólne modele liniowe (GLM). Metoda koherencji wymaga mniejszej wcześniejszej wiedzy na temat płaskich wyrobów ze stali walcowanych na gorąco w porównaniu z konwencjonalnym ogólnym modelem liniowym. Dlatego jest to korzystne podczas eksploracji danych za pomocąMRI. Metoda koherencji może być jednak stosowana tylko w przypadku danych z projektami blokowymi lub wybranymi projektami związanymi ze zdarzeniami ze stałym interwałem między bodźcami i nie może być stosowana w danych MRI z innymi projektami związanymi ze zdarzeniami lub projektami mieszanymi. Następnie dynamiczne modelowanie przyczynowe (DCM) może być wykorzystane do analizy interakcji między regionami mózgu zidentyfikowanymi za pomocą rezonansu magnetycznego. DCM jest bayesowską techniką statystyczną opracowaną do analizy funkcjonalnej łączności od odpowiedzi systemu na dane wejściowe eksperymentalne podczas fMRI³⁴.

Dodatkowe problemy techniczne związane z rezonansem magnetycznym omówiono tutaj. Implanty mogą ulec uszkodzeniu lub odpaść, co prowadzi do usunięcia chorego zwierzęcia z badania. Operacje reimplantacji nie są zalecane ze względu na dodatkową niepewność co do uzyskania takiego samego zwrotu z inwestycji, jak w przypadku pierwotnej operacji implantacji, a także ze względu na kwestie dobrostanu zwierząt. Ze względu na znaczną ilość czasu i zasobów zainwestowanych w każde badane zwierzę, rozważenie wytrzymałości materiału jest istotnym problemem przy wyborze odpowiedniego cementu dentystycznego do stosowania w badaniach MRI. Operacja implantacji jest kluczowym czynnikiem maksymalizującym długowieczność implantu i zwierzęcia. Na przykład upewnienie się, że czaszka jest sucha przed nałożeniem cementu dentystycznego i umieszczenie odpowiedniej ilości cementu wokół implantu ceramicznego okucia może zapewnić stabilność przez potencjalnie wielomiesięczny okres zwierzęcia podczas badania. Ponadto można zbadać alternatywne projekty klatek i omówić je z lokalną placówką opieki nad zwierzętami, aby uniknąć klatek z drucianymi wierzchami trzymającymi jedzenie i wodę, które często wystają do klatki i stwarzają zwierzęciu możliwość uszkodzenia implantu. Co ważne, cement dentystyczny musi być starannie wybrany, aby zredukować artefakty, które wpływają na obrazowanie, a alternatywne cementy można testować poprzez nałożenie na fantom i obrazowanie w skanerze przed użyciem w eksperymentach na zwierzętach. Metody prób i błędów z różnymi cementami dentystycznymi wykazały, że cement użyty w tym protokole daje stosunkowo niewiele artefaktów. Kolejnym wyzwaniem technicznym związanym z wykonywaniem rezonansu magnetycznego jest dokładność umieszczenia światłowodu przy zamierzonym ROI, biorąc pod uwagę niezwykle małe odległości, jakie mogą istnieć między jądrami w mózgu³⁵. Po zakończeniu operacji implantacji, skany anatomiczne T2-zależne mogą być wykorzystane do określenia prawidłowego umiejscowienia poprzez nałożenie na atlas mózgu. Umiejętności chirurga i praktyka wykonywania tych operacji mogą poprawić prawidłowe wskaźniki umieszczania. Swoistość i ekspresję opsyny przy zamierzonym ROI można zweryfikować na zakończenie badania poprzez perfuzję zwierzęcia i utrwalenie mózgu, przy użyciu immunohistochemii lub endogennej fluorescencji białka reporterowego znakowanego do opsyny w celu wizualizacji. Te białka reporterowe mogą być również kolokalizowane z innymi białkami, aby zapewnić ekspresję opsyny w pożądanych typach komórek nerwowych^1,8,15,25. Jak wspomniano wcześniej, podczas wykonywania rezonansu magnetycznego mogą powstawać artefakty z powodu ogrzewania tkanek w wyniku dostarczania światła²². Podgrzewanie tkanek powoduje modyfikację czasów relaksacji, co skutkuje fałszywym sygnałem BOLD. Aby upewnić się, że aktywacja wynikająca ze stymulacji światłem podczas MRI nie jest spowodowana tym artefaktem, należy przeprowadzić kontrole opsynowo-ujemne, w których zwierzęta z wstrzyknięciem soli fizjologicznej lub zwierzęta, którym wstrzyknięto kontrolne wektory fluoroforowe (takie jak AAV-CaMKIIa-EYFP) są poddawane MRI. Dodatkowo, tylko dobrze skonstruowane implanty światłowodowe o dobrej wydajności transmisji światła powinny być stosowane w celu wyeliminowania konieczności stosowania dużych mocy lasera. przeprowadzono badania MRI, w których fałszywa aktywacja spowodowana podgrzaniem tkanek nie stanowiła problemu^1,6-8,10,11.

Jeśli chodzi o wybór wektora do wprowadzenia wymaganych genów optogenetycznych do neuronów w celu ekspresji, nie wiadomo, czy AAV powodują chorobę u ludzi i dlatego są wygodną opcją, biorąc pod uwagę niższy poziom bezpieczeństwa biologicznego wymagany do stosowania tych środków (BSL-1). Ponadto wiele rdzeni wektorów przenosi AAV z różnymi genami optogenetycznymi w magazynie i z wieloma serotypami. Serotyp AAV musi być wybrany w oparciu o zamierzoną docelową populację komórek, aby zapewnić optymalny poziom ekspresji^36,37. Można również stosować lentiwirusy, ale wymagają one wyższego poziomu bezpieczeństwa biologicznego. Okres wymagany do wystarczającej ekspresji genów optogenetycznych jest zmienny w zależności od konkretnego zastosowanego modelu zwierzęcego, konkretnego zastosowanego AAV i specyficznego paradygmatu doświadczalnego. W tym protokole wykorzystuje się szczury Sprague Dawley w wieku 11 tygodni, a badania optogenetyczne rozpoczynają się od czterech do sześciu tygodni po wstrzyknięciu wirusa. Myszy transgeniczne mogą być również wykorzystywane w badaniach optogenetycznych. Konieczne jest przeprowadzenie eksperymentów pilotażowych w celu określenia konkretnej ilości czasu wymaganego do wystarczającej ekspresji opsyn. Paradygmaty stymulacji mogą się różnić w zależności od konkretnej użytej opsyny. W tym protokole używany jest AAV5-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP, a paradygmat stymulacji to 20 sekund wł./40 sekund wyłączenia. W przypadku korzystania z SSFO paradygmat stymulacji będzie się różnił, ponieważ SSFO wymaga tylko krótkiego impulsu światła do aktywacji, a następnie krótkiego impulsu światła o innej długości fali, aby zostać zakończonym.

Dodatkowym krytycznym problemem podczas wykonywania MRI jest zapobieganie wyciekom światła z interfejsu implantu okucia z kablem światłowodowym podczas stymulacji optogenetycznej, aby zapobiec mylącemu sygnałowi mózgowemu pochodzącemu ze stymulacji wzrokowej, nawet gdy zwierzę jest znieczulone. Stożki z czarnej taśmy izolacyjnej mogą być używane do blokowania światła z okuć i do zasłaniania oczu zwierzęcia. Co ważne, wartości fizjologiczne, w tym wydechowy CO₂ i temperatura ciała osoby badanej, muszą być odpowiednio utrzymane przez cały czas trwania badania obrazowego. Wydechowy poziom CO₂ powinien być utrzymywany na poziomie 3 - 4 %, a temperatura ciała na poziomie 37 °C. Ponadto sekwencje podkładkowania w celu zmniejszenia jak największej niejednorodności pola magnetycznego przed rozpoczęciem skanów MRI w znacznym stopniu decydują o jakości uzyskanych danych BOLD. Kontrola tych czynników ma kluczowe znaczenie w tworzeniu wiarygodnych danych MRI. W tym protokole lasery DPSS są wykorzystywane jako źródło światła do stymulacji optogenetycznej. Ponieważ światło lasera jest spójne, światłowód może być łatwo dostarczony przez więcej niż wystarczającą ilość energii. Źródła światła LED sprzężone ze światłowodami są dostępne u dostawców komercyjnych, ale mają tę wadę, że mają zmniejszoną moc transmisji światła. Laserowe źródło światła wymaga wyrównania do każdego konkretnego kabla światłowodowego, ale przy odrobinie praktyki wyrównanie można osiągnąć w ciągu kilku sekund do minut.

Przyszłe zastosowania rezonansu magnetycznego obejmują wykorzystanie opsyn nowej generacji, takich jak opsyny przesunięte ku czerwieni, aby umożliwić nieinwazyjną stymulację podczas obrazowania. Dodatkowo, wszczepienie kompatybilnych z MRI elektrod EEG lub podobnych elektrod rejestrujących wraz z implantem światłowodowym może pozwolić na uzyskanie danych o wysokiej rozdzielczości czasowej oprócz danych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej MRI. rezonans magnetyczny z zapisem elektrofizjologicznym może dostarczyć obszernych informacji na temat funkcjonalnych połączeń mózgu. Podsumowując, zdolność ofMRI do monitorowania całego mózgu w odpowiedzi na stymulację określonych populacji komórek zdefiniowanych przez tożsamość genetyczną lub anatomiczną sprawia, że ofMRI jest kluczowym narzędziem do wykorzystania w badaniach chorób neurologicznych i konektomiki zdrowego mózgu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7 Skaner Tesli	System Agilent Technologies	Discovery MR901 Szczury
Sprague Dawley	River	Crl:SD	11-tygodniowy
obcinak do włókien	Fujikura	CT-05
	Thor Labs	AFS105/125Y
ściągacz izolacji	Thor Labs	T08S13
ceramiczny rękaw dzielony	Produkty z włókien precyzyjnych	SM-CS1140S
klej epoksydowy	Thor Labs	G14250
	Stoelting Co.	50975
wielomodowe ceramiczne tuleje cyrkonowe	Produkty z włókna precyzyjnego	Złącze wielomodowe MM-FER2002
FC / PC	Thor Labs	30128C3
	Produkty z włókna precyzyjnego Arkusz	M1-80754
0,3 i mikro; m	Thor Labs	LFG03P
arkusz docierający z tlenku glinu, 1 i mikro; m	Thor Labs	LFG1P
, 3 i mikro; m	Thor Labs	LFG3P
lornetka mikroskop biologiczny 40X-1,000X	Amscope	B100
laserowe okulary ochronne	Kentek	KXL-62W01
473 nm laser DPSS	Laserglow	LRS-0473
594 nm laser DPSS	Laserglow	LRS-0594
Zestaw			kluczy imbusowych imbusowych2,0 mm (5/64") do wyrównania końcówki światłowodu do ogniska łącznika w mierniku mocy lasera
, Czujnik Si, 400-1,100 nm	Thor Labs	PM121D
Izofluran (Isothesia)	Henry Schein	50033
waporyzator izofluranowy z komorą indukcyjną	VetEquip	901806
NanoFil 100 µ l strzykawka	World Precision Instruments	NANOFIL-100
UltraMicroPump ze sterownikiem SYS-Micro4 World	Precision Instruments	UMP3-1
	A.M.P.I.	Master-8
stereotax dla małych zwierząt	David Kopf Instruments	Model 940
Wentylator dla małych zwierząt model 683	Aparat Harvarda	550000
Typ 340 kapnograf	Harvard Apparatus	733809
wiertarka dentystyczna (zestaw mikrosilnika obrotowego)	Foredom Electric Co.	K.1070
maść okulistyczna (sztuczne łzy)	Rugby	00536-6550-91
sterylizator narzędzi	CellPoint Scientific	Germinator 500	sterylizator z kulkami szklanymi
antybiotyk w proszku	Pfizer	NEO-PREDEF	siarczan neomycyny, octan izoflupredonu i chlorowodorek tetrakainy
buprenorfina lek przeciwbólowy	Hospira	NDC:0409-2012	substancja kontrolowana z harmonogramu III, 0,3 mg / ml zapasu