Method Article

Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

DOI:

10.3791/53369

⸱

September 29th, 2017

 ,  ,  , 
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wykorzystuje trójwymiarowe (3D) techniki obrazowania i analizy do wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Techniki te mają zastosowanie w innych sytuacjach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do odizolowania podzbioru danych od innego sygnału fluorescencyjnego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest badanie mitochondriów w wewnątrznaskórkowych włóknach nerwowych. W związku z tym opracowano techniki obrazowania i analizy 3D w celu wyizolowania mitochondriów specyficznych dla nerwów i oceny wywołanych chorobą zmian mitochondriów w dystalnym końcu nerwów czuciowych. Protokół łączy immunohistochemię fluorescencyjną, mikroskopię konfokalną i techniki analizy obrazu 3D w celu wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Szczegółowe parametry są definiowane w trakcie procedur, aby zapewnić konkretny przykład wykorzystania tych technik do izolacji mitochondriów specyficznych dla nerwów. Przeciwciała użyto do znakowania sygnałów nerwowych i mitochondrialnych w sekcjach tkanek biopsji przekłucia skóry, a następnie przeprowadzono immunofluorescencję pośrednią w celu uwidocznienia nerwów i mitochondriów odpowiednio zielonym i czerwonym sygnałem fluorescencyjnym. Obrazy serii Z uzyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej, a do przetwarzania i analizy sygnałów użyto oprogramowania do analizy 3D. Nie jest konieczne przestrzeganie dokładnych parametrów opisanych w środku, ale ważne jest, aby być konsekwentnym z tymi wybranymi na wszystkich etapach barwienia, akwizycji i analizy. Zaletą tego protokołu jest to, że można go zastosować w wielu różnych okolicznościach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do izolowania innych sygnałów, które w przeciwnym razie byłyby niemożliwe do samodzielnego zbadania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria pełnią ważne funkcje komórkowe, takie jak wytwarzanie energii komórkowej, buforowanie wapnia oraz regulacja nekrotycznej i apoptotycznej śmierci komórki1,2,3. Układ nerwowy ma wysokie tempo przemiany materii w porównaniu do ciała4, co sugeruje, że neurony generują wysoki stopień energii komórkowej w postaci adenozynotrójfosforanu (ATP) poprzez oddychanie mitochondrialne. Wiele dowodów dokumentuje, że funkcje neuronalne są zależne od ATP5, szczególnie w synapsach6. Dlatego ważna jest dystrybucja mitochondriów w neuronach.

W ciągu ostatnich 10 lat wiele informacji pokazało, że transport i dokowanie mitochondriów neuronalnych jest ściśle regulowane. Białka motoryczne biorą udział w dystrybucji mitochondriów do określonych przedziałów komórkowych w całym neuronie. Transport mitochondriów jest szczególnie ważny, ponieważ neurony wyrzucają aksony i dendryty daleko od somy. Białka motoryczne kinezyny przede wszystkim kierują następczy (z dala od somy) transport mitochondriów wzdłuż mikrotubul, podczas gdy białka motoryczne dyneiny kierują ruchliwość wsteczną (w kierunku somy)7,8,9,10. Istnieją sygnały komórkowe, takie jak potencjał błony mitochondrialnej i przewodzenie impulsów, które wpływają na obecność i kierunek transportu mitochondrialnego11,12,13.

Oprócz transportu mitochondriów, istnieją wyspecjalizowane białka do lokalizacji mitochondriów w określonych przedziałach komórkowych, które mają wysokie zapotrzebowanie na energię, takich jak węzły Ranviera i synapsy8,14,17. W rzeczywistości większość mitochondriów w aksonach jest nieruchliwa9,13,18. Wyspecjalizowane białka, takie jak syntafilina, zakotwiczają mitochondria w mikrotubulach wzdłuż aksonów, podczas gdy inne białka zakotwiczają mitochondria w cytoszkielecie aktyny19-21. Doniesiono, że czynniki wzrostu i jony, takie jak wapń, wspierają zatrzymanie ruchu mitochondriów w celu zlokalizowania ich w regionach, w których są potrzebne21,22,23.

Razem wzięte, transport i dokowanie mitochondriów są niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania neuronów. Na poparcie tego faktu, zakłócenia w transporcie mitochondrialnym są związane z kilkoma schorzeniami neurologicznymi, w tym chorobą Alzheimera, stwardnieniem zanikowym bocznym, chorobą Charcota-Marie-Tootha, chorobą Huntingtona, dziedzicznym niedowładem spastycznym i zanikiem nerwu wzrokowego15,24,25,26,27. Ostatnie badania koncentrowały się na dysfunkcji i patologii mitochondriów jako potencjalnym mechanizmie neuropatii cukrzycowej, utraty czucia związanej z cukrzycą28,29,30,31,32,33. Hipoteza jest taka, że cukrzyca zmienia rozmieszczenie mitochondriów w projekcjach czuciowych zakończeń nerwów skórnych. W związku z tym opracowano technikę wizualizacji i ilościowego określania mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych (IENF), dystalnych końcówek aferentów czuciowych zwoju korzenia grzbietowego. Technika ta łączy immunohistochemię fluorescencyjną określonych znaczników mitochondriów i włókien nerwowych z mikroskopią konfokalną, akwizycją sygnałów serii Z z potężnym oprogramowaniem do analizy obrazów 3D w celu zmierzenia rozmieszczenia mitochondriów specyficznych dla nerwów z ludzkich biopsji skórnych, aby osiągnąć ten cel.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biopsje skóry zostały uzyskane od osób, które zostały zrekrutowane z dużej sieci podstawowej opieki zdrowotnej w Centrum Diabetologicznym Uniwersytetu Utah (Salt Lake City, UT). Badanie to zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Michigan i było zgodne z założeniami Deklaracji Helsińskiej. Przed badaniem uzyskano pisemną świadomą zgodę od każdego uczestnika.

1. Immunohistochemia fluorescencji

  1. Przygotuj biopsje stempla do immunohistochemii śródnaskórkowych włókien nerwowych:
    1. Wykonać biopsję skóry 3 mm przez personel medyczny i umieścić całą biopsję w 1,5 ml roztworu utrwalającego Zamboniego (2% paraformaldehydu, 0,3% nasyconego kwasu pikrynowego w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS), pH 7,4) w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Przepłukać próbki roztworem 30% sacharozy w PBS w temperaturze 4 °C przez 16-24 godziny lub do momentu, gdy próbka opadnie.
    3. Osadzanie próbek w związku o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) za pomocą krioformy. Umieść całą biopsję 3 mm z naskórkiem skierowanym w dół w formie i wypełnij formę około 2 ml OCT. Zamroź formę na pokruszonym suchym lodzie. Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do użycia.
    4. Wyciąć przekroje o grubości 50 μm za pomocą kriostatu i przechowywać w indywidualnych dołkach 96-dołkowej płytki, używając 180 μl roztworu do przechowywania płynu niezamarzającego na studzienkę (30% glikolu etylenowego, 30% glicerolu w PBS). Poniższe wskazówki dotyczą 8 dołków z 96-dołkową płytką. Wybarwij skrawki z każdego miejsca biopsji, które są oddalone od siebie o 200 - 300 μm.

DZIEŃ 1:

  1. Ugasić niespecyficzne oznakowanie warstwy rogowej naskórka:
    1. Oznacz płytkę 96-dołkową, jak pokazano na Rysunek 1.
    2. Wlej 150 μl roztworu wzmacniacza sygnału zapasowego, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie przeciwciał drugorzędowych34,35 do każdej studzienki. Przenieś sekcje do roztworu wzmacniacza sygnału za pomocą pętli zaszczepiającej.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas pracy z tkanką, aby uniknąć uszkodzenia lub rozerwania odcinków tkanki. Trzymaj w roztworze wzmacniacza sygnału przez 30 minut w temperaturze pokojowej na płaskim kołysku.
    3. Przygotować studzienki płuczące w rzędach 2 i 3 płytki 96-dołkowej, dodając 150 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do każdej studzienki.
    4. Ostrożnie przenieś sekcje do rzędu 2 i płucz w 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Płukać po raz drugi w 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej (rząd 3).
  2. Przygotować 5% roztwór blokujący albuminę surowicy bydlęcej (BSA):
    1. Przygotować 5% roztwór blokujący, który zawiera 5% BSA i 0,3% Triton X 100 (TX-100) w 0,1 M PBS (patrz Tabela 1), podczas gdy sekcje inkubują w roztworze wzmacniacza sygnału. BSA nie wchodzi łatwo w rozwiązanie. Wirować roztwór, aż BSA całkowicie się rozpuści.
    2. Przygotować studzienki blokujące w rzędzie 4 płytki 96-dołkowej, dodając 150 μl 5% roztworu blokującego BSA do każdej studzienki.
    3. Przenieść skrawki do indywidualnych studzienek z 5% roztworem blokującym BSA i inkubować sekcje w 5% roztworze blokującym BSA przez 1 - 2 godziny w temperaturze pokojowej na płaskim kołysku.
  3. Przygotować 1% roztwór płuczący BSA i rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe:
    1. Przygotować 1% roztwór do płukania, który zawiera 1% BSA i 0,3% TX-100 w 0,1 M PBS (patrz Tabela 2), podczas gdy sekcje inkubują w 5% roztworze blokującym BSA. BSA nie wchodzi łatwo w rozwiązanie. Wirować roztwór, aż BSA całkowicie się rozpuści.
    2. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w 1% roztworze płuczącym BSA, podczas gdy sekcje inkubują się w 5% roztworze blokującym BSA.
      1. Przygotować 1,500 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego i dodać do każdej studzienki w rzędzie 5.
      2. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe: Użyj etykiety specyficznej dla nerwów, króliczego poliklonalnego genu antybiałkowego 9.5 (PGP9.5) w stosunku 1:1,000. Użyj etykiety specyficznej dla mitochondriów, mysiego przeciwciała monoklonalnej dehydrogenazy antypirogronianowej E2 / E3bp (PDH) w stosunku 1:100 w 1% roztworze płuczącym BSA.
  4. Przygotuj przeciwciało pierwszorzędowe:
    1. Odpipetować 150 μl przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki w rzędzie 5 płytki 96-dołkowej.
    2. Za pomocą narzędzia do pętli przenieś skrawki z roztworu blokującego (rząd 4) do rzędu 5 zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe.
    3. Owiń płytkę szczelnie parafilmem, aby nie wyschła.
    4. Umieścić próbki na płaskim kołysku w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie inkubować próbki w temperaturze 4 °C na płaskim kołysku przez noc.

DZIEŃ 2:

  1. Próbki płukania:
    1. Przygotować studzienki płuczące w rzędach 6, 7 i 8 płytki 96-dołkowej, dodając 150 μl 1% roztworu płuczącego BSA do każdej studzienki.
    2. Przenieść skrawki do pierwszego 1% roztworu płuczącego BSA (rząd 6) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórzyć płukanie jeszcze dwukrotnie, inkubując sekcje w 1% roztworze płuczącym BSA w rzędach 7 i 8 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w 1% roztworze płuczącym BSA:
    1. Przygotować 1 500 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych podczas inkubacji skrawków w ostatnim płukaniu 1% roztworu płuczącego BSA (rząd 8).
    2. Rozcieńczone przeciwciała drugorzędowe: dla PGP9.5 (zielonofluorescencyjne sprzężone kozie przeciwciało anty-królicze, 1:1000), dla PDH (czerwono-fluorescencyjne sprzężone kozie przeciwciało anty-mysie, 1:1,000) w 1% roztworze płuczącym BSA.
  3. Przygotować przeciwciało drugorzędowe:
    1. Odmierzyć pipetą 150 μl przeciwciała wtórnego do rzędu 9 płytki 96-dołkowej.
    2. Delikatnie przenieść skrawki z 1% roztworu płuczącego BSA (rząd 8) do dołków na przeciwciała wtórne (rząd 9).
    3. Za pomocą parafilmu szczelnie owiń płytkę, aby nie wyschła. Przykryj folią aluminiową. Umieścić próbki na płaskim bujaku w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie inkubować próbki w temperaturze 4 °C na płaskim bujaku przez noc.

DZIEŃ 3:

  1. Przygotuj czysty 1x PBS, filtrując przez filtr 0,22 μm:
    1. Odpipetować 150 μl przefiltrowanego 1x PBS do rzędów 10, 11 i 12.
    2. Przenieść próbki do rzędu 10 i płukać w 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przykryj 96-dołkową płytkę folią aluminiową i ułóż na płaskim bujaku podczas płukania. Powtórzyć przefiltrowane płukanie 1x PBS jeszcze dwa razy po 1 godzinie w temperaturze pokojowej w rzędach 11 i 12.
  2. Przygotuj szkiełka mikroskopowe do montażu skrawków tkanek:
    1. Umieść 50 μL przefiltrowanego 1x PBS na szkiełku podstawowym (PBS).
    2. Przenieś sekcję z 1x PBS (rząd 12) do kropli 50 μL. Ostrożnie umieść wycinek w kropli PBS, rozkładając tkankę i delikatnie spłaszczając ją na szkiełku podstawowym. Usunąć nadmiar PBS za pomocą szklanej pipety, aby uniknąć rozcieńczenia odczynnika montażowego. Nie dotykaj sekcji szklaną bańką.
    3. Odmierzyć pipetę 1-2 kropli odczynnika montażowego zawierającego DAPI bezpośrednio na przekrój szkiełka mikroskopowego, uważając, aby nie zakłócić orientacji sekcji. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe mikroskopu o wymiarach 50 mm x 24 mm #1.5 na sekcji.
    4. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, które powstały podczas zakładania szkiełka nakrywkowego i zetrzyj nadmiar płynu z krawędzi szkiełka nakrywkowego. Przygotuj nową prowadnicę i powtórz proces montażu dla każdej sekcji.
    5. Utwardź/wysusz nośnik montażowy, umieszczając szkiełka w ciemności na noc w temperaturze pokojowej. Przenieść szkiełka do temperatury 4 °C w przypadku krótkotrwałego (1 - 2 tygodnie) lub -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania (powyżej 2 tygodni).
      UWAGA: Kontrole ujemne pominęły pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko PGP9.5 lub PDH w kroku 1.4.2.2 i nie wykazały wyraźnego znakowania nerwów lub mitochondriów w naskórku. Przeprowadzono kontrole pozytywne przeciwciała PDH, aby udowodnić, że znakuje ono wszystkie mitochondria (dane nie pokazano). Kontrole pozytywne przeprowadzono na hodowanych pierwotnych neuronach zwoju korzenia grzbietowego myszy, które zostały transdukowane bakulowirusem w celu znakowania mitochondriów sygnałem białka zielonej fluorescencji (GFP), a następnie utrwalone i wybarwione przeciwciałem PDH i przeciwciałem drugorzędowym czerwonej fluoryzacji. Wszystkie mitochondria, w których ulegała ekspresja GFP, były znakowane czerwoną etykietą dla immunohistochemii PDH (dane nie pokazane).

2. Obrazowanie konfokalne

  1. Wykonaj obrazowanie konfokalne:
    1. Zbieraj obrazy za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z 40-krotnym obiektywem zanurzonym w oleju (apertura numeryczna 1,25 (NA)) w mikroskopie odwróconym.
      1. W każdej płaszczyźnie ogniskowej sekwencyjnie odbieraj sygnały fluorescencyjne:
        Jądra: wzbudzenie λ = 405 nm, widmowy filtr emisyjny λ = 420 - 480 nm
        Włókna nerwowe: wzbudzenie λ= 488 nm, filtr emisji widmowej λ = 505 - 560 nm
        Mitochondria: wzbudzenie λ = 543 nm, filtr emisji widmowej λ= 606 - 670 nm
    2. Wprowadź następujące parametry skanowania do oprogramowania mikroskopu: częstotliwość skanowania 600 Hz z uśrednianiem 2 klatek i zoomem 2,2; 12-bitowa rozdzielczość intensywności (4096 poziomów szarości).
      1. Ustaw oprogramowanie mikroskopu na zoptymalizowaną rozdzielczość boczną (rozdzielczość skanowania = 1,024 x 1,024) i rozdzielczość osiową/przekrój optyczny (apertura konfokalna = 1 jednostka przewiewna (AU) o rozmiarze kroku z 210 nm).
        UWAGA: Wynikowa rozdzielczość XYZ wynosi 172,2 nm x 172,2 nm x 210 nm przy rozmiarze obrazu 176,1 μm x 176,1 μm x 30-50 μm.
    3. Aktywuj skanowanie na żywo dla sygnału nerwowego (zielona fluorescencja) i dostosuj sterowanie z-focus, aby znaleźć i ustawić górną i dolną płaszczyznę ogniskową w oprogramowaniu mikroskopu, które obejmują sygnał nerwowy w sekcji tkanki. Całkowity zakres z wynosi zwykle 30-50 μm dla przekroju tkanki 50 μm.
    4. Podczas skanowania na żywo obróć pole skanowania za pomocą oprogramowania mikroskopu, tak aby naskórek był ustawiony poziomo lub pionowo na obrazie.
    5. Zeskanuj każdy sygnał osobno i dostosuj napięcie detektora (lampa fotopowielacza, PMT) oraz przesunięcie, aby zminimalizować/usunąć wszelkie nadmiernie i niedostatecznie nasycone piksele.
      UWAGA: Czas skanowania z powyższymi parametrami wynosi około 20 - 40 minut w zależności od liczby plasterków z.

3. 3D Wizualizacja i analiza mitochondriów w ludzkich wewnątrznaskórkowych włóknach nerwowych

  1. Izoluj naskórek 3D:
    1. Zduplikuj oryginalny obraz i użyj projekcji o maksymalnej intensywności (rozszerzony widok ostrości) obrazu, aby zidentyfikować i wyizolować naskórek.
    2. Użyj narzędzia do śledzenia obszaru zainteresowania, aby obrysować wzdłuż górnej i dolnej krawędzi naskórka, aby usunąć niechciane obszary, takie jak warstwa rogowa naskórka i skóra właściwa, w których nie ma śródnaskórkowych włókien nerwowych. Przytnij do tego zaznaczenia.
  2. Użyj dekonwolucji na nerwach i mitochondrialnych sygnałach fluorescencyjnych:
    UWAGA: Dekonwolucja pomaga przywrócić integralność sygnałów fluorescencyjnych. Odbudowa stosowana w tym protokole nazywana jest ślepą dekonwolucją, ponieważ wykorzystuje sygnały fluorescencyjne na obrazach do określenia, jak bardzo sygnały rozprzestrzeniają się od ich pierwotnego źródła (funkcja rozproszenia punktowego). Proces ten poprawia rozdzielczość sygnału poprzez ponowne przypisanie rozproszenia sygnału z powrotem do jego lokalizacji początkowej.
    1. Obliczyć funkcję rozproszenia punktów (PSF) dla zielonego fluorescencyjnego sygnału nerwowego (zielonej fluorescencji) o następujących parametrach:
      1. Ustaw obliczone PSF na konfokalne. Ustaw średni współczynnik załamania światła na 1,515, a aperturę numeryczną na 1,25. Ustaw otwór detektora na 1 jednostkę Airy (A.U.). Ustaw długość fali wzbudzenia laserowego na 488 nm i długość fali emisji na 515 nm.
    2. Obliczyć PSF dla sygnału mitochondrialnego czerwonej fluorescencji (czerwonej fluorescencji) o następujących parametrach:
      1. Ustaw obliczone PSF na konfokalne. Ustaw średni współczynnik załamania światła na 1,515, a aperturę numeryczną na 1,25. Ustaw otwór detektora na 1 AU. Ustaw długość fali wzbudzenia laserowego na 543 nm, a długość fali emisji na 617 nm.
    3. Zoptymalizuj sygnały fluorescencyjne nerwów i mitochondriów poprzez dekonwolucję przy użyciu odpowiednich PSF wymienionych powyżej i funkcji iteracyjnej przywracania ustawionej ze 100% pewnością i limitem iteracji wynoszącym 10 cykli.
  3. Tworzenie powierzchni specyficznych dla nerwów:
    1. Użyj narzędzia "utwórz powierzchnię", aby stworzyć solidną powierzchnię nerwów z zdekonwolucyjnego zielono-fluorescencyjnego wtórnego znakowania nerwów zidentyfikowanych jako PGP9.5.
    2. Odznacz funkcję "gładki" i użyj funkcji intensywności bezwzględnej, aby ustawić próg sygnału nerwowego, ponieważ jest on znacznie jaśniejszy niż fluorescencja tła.
    3. Użyj funkcji intensywności bezwzględnej, aby ustawić próg sygnału nerwowego, ponieważ jest on znacznie jaśniejszy niż fluorescencja tła. Ustaw wartość progową na tyle nisko, aby dokładnie zidentyfikować nerwy.
    4. Odfiltruj małe, nienerwowe powierzchnie na podstawie rozmiaru.
      UWAGA: W razie potrzeby ręcznie edytuj dodatkowe powierzchnie nienerwowe na karcie "Edycja", przytrzymując CONTROL, aby podświetlić wiele obiektów, a następnie usuwając je za pomocą Delete.
  4. Wyizoluj specyficzny dla nerwów fluorescencyjny sygnał mitochondrialny:
    1. Wybierz kartę Edytuj powierzchni nerwu, aby wyświetlić funkcję "Właściwości maski". Powierzchnia nerwu utworzona w krokach 3.3 służy do izolowania mitochondriów w tych nerwach z dala od sygnałów mitochondrialnych związanych z keratynocytami.
    2. Gdy przycisk "Maskuj wszystko" otworzy okno "Kanał maski", wybierz zdekonwoluowany sygnał czerwonej fluorescencji z menu rozwijanego w sekcji "Wybór kanału" dla sygnału mitochondrialnego.
    3. Kliknij pole, aby zaznaczyć pole wyboru w opcji "zduplikuj kanał przed zastosowaniem maski".
    4. Kliknij przycisk radiowy przed opcją "Stała wewnątrz/na zewnątrz" w Ustawieniach maski i kliknij pole, aby zaznaczyć opcję "Ustaw woksel na powierzchni zewnętrznej" i wpisz 0,00 jako wartość. Kliknij przycisk OK, aby utworzyć nowy kanał, który reprezentuje sygnały mitochondrialne na powierzchni nerwu.
  5. Tworzenie powierzchni specyficznych dla mitochondriów:
    1. Użyj narzędzia "utwórz powierzchnię", aby utworzyć stałą powierzchnię mitochondriów z nowo utworzonego kanału fluorescencyjnego specyficznych dla nerwów sygnałów mitochondrialnych z kroków 3.4.
    2. Odznacz funkcję "gładkie" i wybierz funkcję "odejmowanie tła", aby ustawić próg. Ta funkcja wykorzystuje lokalny kontrast wokół sygnału mitochondrialnego do identyfikacji mitochondriów na podstawie tła.
    3. Ustaw wartość progową na tyle niską, aby dokładnie zidentyfikować mitochondria. W tym przykładzie dolny próg został ustawiony na 2 000 dla skali 16-bitowej (65 536).
    4. Filtruj powierzchnie mitochondriów na podstawie rozmiaru. W tym przykładzie limit wokseli został ustawiony na 1,0 wokseli, co jest najniższym możliwym limitem. W razie potrzeby ręcznie edytuj powierzchnie inne niż mitochondria na karcie "Edycja", przytrzymując CONTROL, aby wybrać wiele obiektów, a następnie usuwając je za pomocą Delete.
      UWAGA: Czasami oprogramowanie tworzy powierzchnie, które nie są związane z rozróżnialnym fluorescencyjnym sygnałem mitochondrialnym. W takich przypadkach możliwe jest ich usunięcie za pomocą zakładki "Edytuj".
  6. Eksport i obliczanie wartości morfometrycznych do analizy:
    1. Eksportuj wartości powierzchni nerwowych i mitochondrialnych z zakładki "Statystyki" w celu dalszej analizy za pomocą elektronicznego arkusza kalkulacyjnego.
    2. Eksportuj wartości objętości zarówno dla powierzchni nerwów, jak i mitochondriów.
    3. Policz liczbę pojedynczych włókien nerwowych obecnych na każdym obrazie i zapisz wartość w elektronicznym arkuszu kalkulacyjnym.
    4. Dla każdego obrazu oblicz następujące potencjalne wartości do analizy w elektronicznym arkuszu kalkulacyjnym:
      1. Zsumuj objętości dla wszystkich powierzchni nerwowych.
      2. Odfiltruj specyficzne dla nerwów powierzchnie mitochondrialne poniżej objętości mniejszej niż 0,02μm3 i podziel powierzchnie według wielkości. Na przykład użyj przedziałów, takich jak 0,02 - 0,04, 0,04 - 0,08, 0,08 - 0,16, 0,16 - 0,32, 0,32 - 0,64, 0,64 - 1,28, 1,28 - 2,56, większe niż 2,56 μm3,
        UWAGA: Dolna granica objętości mitochondriów została ustalona na 0,02 μm3 na podstawie wcześniej opublikowanych objętości mitonchodria36,37,38.
      3. Policz liczbę specyficznych dla nerwów powierzchni mitochondrialnych w każdym pojemniku i całkowitą liczbę powierzchni nad pojemnikami (0,02 - więcej niż 2,56 μm3).
      4. Oblicz proporcję powierzchni mitochondrialnych specyficznych dla nerwów w każdym pojemniku. Użyj liczby na pojemnik podzielonej przez łączną liczbę powierzchni mitochondriów.
      5. Zsumuj objętości dla wszystkich powierzchni mitochondrialnych specyficznych dla nerwów.
      6. Oblicz proporcję nerwu z sygnałem mitochondrialnym, dzieląc całkowitą objętość powierzchni nerwu przez sumę wszystkich objętości powierzchni mitochondriów.
      7. Oblicz liczbę mitochondriów na objętość nerwu, dzieląc całkowitą objętość powierzchni nerwu przez liczbę wszystkich powierzchni mitochondrialnych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja i kwantyfikacja mitochondriów w ludzkich IENFach

Immunohistochemia fluorescencyjna pozwala na jednoczesne oznaczanie wielu sygnałów w biopsjach ludzkiej skóry w celu wizualizacji nerwów, mitochondriów i jąder. Płytka 96-dołkowa to wygodny sposób na uporządkowanie etapów procedury immunohistochemicznej. Rysunek 1 pokazuje, że ta konfiguracja obejmuje do 8 sekcji, które m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ma na celu izolację, ilościowe określenie i analizę wielkości i rozmieszczenia mitochondriów specyficznych dla nerwów w IENF w 3D z biopsji ludzkiej skóry. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Swobodna immunohistochemia fluorescencyjna jest przeznaczona do barwienia i analizowania wielu sygnałów w każdej próbce, zapewniając bardziej wszechstronną metodologię badań eksploracyjnych44,45. Procedura ta pozwala na przenikanie przeciwciał do ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak konfliktu interesów, który można by zadeklarować.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants K08 NS061039-01A2, The Program for Neurology Research & Discovery oraz The A. Alfred Taubman Medical Research Institute na University of Michigan. W pracy wykorzystano rdzeń analizy morfologii i obrazu Centrum Badań nad Cukrzycą w Michigan, finansowany przez National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 z Narodowego Instytutu Cukrzycy i Chorób Trawiennych i Nerek. Autorzy pragną podziękować J. Robinsonowi Singletonowi i A. Gordonowi Smithowi (University of Utah) za hojne przekazanie próbek ludzkiej skóry.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2% Utrwalacz Zamboni's NewcomerSupply, Middleton, WI 1459A2% paraformaldehyd, 0,2% nasycony kwas pikrynowy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,4
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP399-4Aby stworzyć 1x PBS
Image-iT FX Signal EnhancerThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsI36933wzmacnia sygnały barwnika Alexa Fluor poprzez redukcję niespecyficznego wiązania
Anti-Protein Gene Product 9.5 Przeciwciało (poliklonalne królika)Proteintech Group Inc. Rosemont, IL14730-1-APw skrócie PGP9.5, zastępuje wycofany z produkcji AbD Serotec (Kat. Nr 7863-0504) przeciwciało
Przeciwciało anty-pirogronianowe Dehydrogenaza E2/E3bp (mysi monoklonalny)abcam, Cambridge, MAab110333w skrócie PDH
Goat anty-mysie Przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 594 sprzężoneThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsA-11034czerwono-fluorescencyjne sprzężone przeciwciało drugorzędowe
Kozioł anty-królik Przeciwciało drugorzędowe KoniugatAlexa Fluor 488ThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsA-11032albumina przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z zieloną fluorescencją
, z surowicy bydlęcejSigma-Aldrich, St. Louis, MOA7906-100w skrócie BSA
Triton X-100Sigma-Aldrich, St. Louis, MOT9284w skrócie TX-100
0,22 i mikro; m FiltrEMD Millipore, Billerica
MA MILLEX		GP SLGP 033NS0,22 & mikro; m Filtr miliporowy
Parafilm MFisher Scientific, Pittsburgh, PA13-374-10Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Nieskalibrowana pętlaFisher Scientific, Pittsburgh, PA22-032092pętla inokulacyjna firmy Decon LeLoop (MP 199-25)
96-dołkowa płytka testowaCorning Incorporated, Corning, NY360396-dołkowa płaska płyta dolna
Odczynnik przeciwblaknięcia Prolong Gold z DAPIThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsP-36931DAPI barwienie jąder
Szkło pokrywowe mikroskopu 50 x 24 mmFisher Scientific, Pittsburgh, PA12-544ESzkiełka nakrywkowe Szkiełka
mikroskopowe Superfrost PlusFisher Scientific, Pittsburgh, PA12-550-15Szkiełka mikroskopowe
Leica SP5 Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyLeica Microsystems, Buffalo Grove, ILSP5Mikroskop konfokalny
Volocity x64 Oprogramowanie Perkin Elmer, Waltham , MAwersja 4.4.0Oprogramowanie Volocity jest używane do kroków 3.1 i 3.2 w protokole przetwarzania obrazu
Imaris x64 Oprogramowanie do analizy 3-wymiarowejBitplane, Concord, MAwersja 7.7.1Oprogramowanie Imaris jest używane w krokach od 3.3 do 3.5 w protokole do analizy obrazu
ExcelMicrosoft, Redmond, WAwersja Office 2013Arkusz kalkulacyjny Excel jest używany w kroku 3.6 w protokole do podsumowania cech morfometrycznych
Optymalna temperatura cięcia ZwiązekSakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA4583w skrócie OCT
Leica CryostatLeica Biosystems, Buffalo Grove, ILCM1850Kriostat do cięcia 50 i mikro; m sekcje
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0ThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsC10600Używany jako kontrola pozytywna do oznaczania mitochondriów zielonym sygnałem fluorescencyjnym

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. 3rd CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754(2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondria ImagingNerve FibersConfocal Microscopy3D Image AnalysisFluorescence ImmunohistochemistryEpidermal MitochondriaNerve specific MitochondriaZ series AcquisitionSurface MaskingMitochondrial Quantification

Related Articles