Method Article

Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

DOI:

10.3791/53369

⸱

September 29th, 2017

 ,  ,  , 
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wykorzystuje trójwymiarowe (3D) techniki obrazowania i analizy do wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Techniki te mają zastosowanie w innych sytuacjach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do odizolowania podzbioru danych od innego sygnału fluorescencyjnego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest badanie mitochondriów w wewnątrznaskórkowych włóknach nerwowych. W związku z tym opracowano techniki obrazowania i analizy 3D w celu wyizolowania mitochondriów specyficznych dla nerwów i oceny wywołanych chorobą zmian mitochondriów w dystalnym końcu nerwów czuciowych. Protokół łączy immunohistochemię fluorescencyjną, mikroskopię konfokalną i techniki analizy obrazu 3D w celu wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Szczegółowe parametry są definiowane w trakcie procedur, aby zapewnić konkretny przykład wykorzystania tych technik do izolacji mitochondriów specyficznych dla nerwów. Przeciwciała użyto do znakowania sygnałów nerwowych i mitochondrialnych w sekcjach tkanek biopsji przekłucia skóry, a następnie przeprowadzono immunofluorescencję pośrednią w celu uwidocznienia nerwów i mitochondriów odpowiednio zielonym i czerwonym sygnałem fluorescencyjnym. Obrazy serii Z uzyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej, a do przetwarzania i analizy sygnałów użyto oprogramowania do analizy 3D. Nie jest konieczne przestrzeganie dokładnych parametrów opisanych w środku, ale ważne jest, aby być konsekwentnym z tymi wybranymi na wszystkich etapach barwienia, akwizycji i analizy. Zaletą tego protokołu jest to, że można go zastosować w wielu różnych okolicznościach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do izolowania innych sygnałów, które w przeciwnym razie byłyby niemożliwe do samodzielnego zbadania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria pełnią ważne funkcje komórkowe, takie jak wytwarzanie energii komórkowej, buforowanie wapnia oraz regulacja nekrotycznej i apoptotycznej śmierci komórki1,2,3. Układ nerwowy ma wysokie tempo przemiany materii w porównaniu do ciała4, co sugeruje, że neurony generują wysoki stopień energii komórkowej w postaci adenozynotrójfosforanu (ATP) poprzez oddychanie mitochondrialne. Wiele dowodów dokumentuje, że funkcje neuronalne są zależne od ATP5, szczególnie w synapsach6. Dlatego ważna jest dystrybuc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biopsje skóry zostały uzyskane od osób, które zostały zrekrutowane z dużej sieci podstawowej opieki zdrowotnej w Centrum Diabetologicznym Uniwersytetu Utah (Salt Lake City, UT). Badanie to zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Michigan i było zgodne z założeniami Deklaracji Helsińskiej. Przed badaniem uzyskano pisemną świadomą zgodę od każdego uczestnika.

1. Immunohistochemia fluorescencji

  1. Przygotuj biopsje stempla do immunohistochemii śródnaskórkowych włókien nerwowych:
    1. Wykonać biopsję skóry 3 mm przez personel medyczny i umieścić całą biopsję w 1,5 ml roztworu utrwalają....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja i kwantyfikacja mitochondriów w ludzkich IENFach

Immunohistochemia fluorescencyjna pozwala na jednoczesne oznaczanie wielu sygnałów w biopsjach ludzkiej skóry w celu wizualizacji nerwów, mitochondriów i jąder. Płytka 96-dołkowa to wygodny sposób na uporządkowanie etapów procedury immunohistochemicznej. Rysunek 1 pokazuje, że ta konfiguracja obejmuje do 8 sekcji, które m.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ma na celu izolację, ilościowe określenie i analizę wielkości i rozmieszczenia mitochondriów specyficznych dla nerwów w IENF w 3D z biopsji ludzkiej skóry. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Swobodna immunohistochemia fluorescencyjna jest przeznaczona do barwienia i analizowania wielu sygnałów w każdej próbce, zapewniając bardziej wszechstronną metodologię badań eksploracyjnych44,45. Procedura ta pozwala na przenikanie przeciwciał do .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak konfliktu interesów, który można by zadeklarować.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants K08 NS061039-01A2, The Program for Neurology Research & Discovery oraz The A. Alfred Taubman Medical Research Institute na University of Michigan. W pracy wykorzystano rdzeń analizy morfologii i obrazu Centrum Badań nad Cukrzycą w Michigan, finansowany przez National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 z Narodowego Instytutu Cukrzycy i Chorób Trawiennych i Nerek. Autorzy pragną podziękować J. Robinsonowi Singletonowi i A. Gordonowi Smithowi (University of Utah) za hojne przekazanie próbek ludzkiej skóry.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2% Utrwalacz Zamboni's NewcomerSupply, Middleton, WI 1459A2% paraformaldehyd, 0,2% nasycony kwas pikrynowy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,4
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP399-4Aby stworzyć 1x PBS
Image-iT FX Signal EnhancerThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsI36933wzmacnia sygnały barwnika Alexa Fluor poprzez redukcję niespecyficznego wiązania
Anti-Protein Gene Product 9.5 Przeciwciało (poliklonalne królika)Proteintech Group Inc. Rosemont, IL14730-1-APw skrócie PGP9.5, zastępuje wycofany z produkcji AbD Serotec (Kat. Nr 7863-0504) przeciwciało
Przeciwciało anty-pirogronianowe Dehydrogenaza E2/E3bp (mysi monoklonalny)abcam, Cambridge, MAab110333w skrócie PDH
Goat anty-mysie Przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 594 sprzężoneThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsA-11034czerwono-fluorescencyjne sprzężone przeciwciało drugorzędowe
Kozioł anty-królik Przeciwciało drugorzędowe KoniugatAlexa Fluor 488ThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsA-11032albumina przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z zieloną fluorescencją
, z surowicy bydlęcejSigma-Aldrich, St. Louis, MOA7906-100w skrócie BSA
Triton X-100Sigma-Aldrich, St. Louis, MOT9284w skrócie TX-100
0,22 i mikro; m FiltrEMD Millipore, Billerica
MA MILLEX		GP SLGP 033NS0,22 & mikro; m Filtr miliporowy
Parafilm MFisher Scientific, Pittsburgh, PA13-374-10Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Nieskalibrowana pętlaFisher Scientific, Pittsburgh, PA22-032092pętla inokulacyjna firmy Decon LeLoop (MP 199-25)
96-dołkowa płytka testowaCorning Incorporated, Corning, NY360396-dołkowa płaska płyta dolna
Odczynnik przeciwblaknięcia Prolong Gold z DAPIThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsP-36931DAPI barwienie jąder
Szkło pokrywowe mikroskopu 50 x 24 mmFisher Scientific, Pittsburgh, PA12-544ESzkiełka nakrywkowe Szkiełka
mikroskopowe Superfrost PlusFisher Scientific, Pittsburgh, PA12-550-15Szkiełka mikroskopowe
Leica SP5 Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyLeica Microsystems, Buffalo Grove, ILSP5Mikroskop konfokalny
Volocity x64 Oprogramowanie Perkin Elmer, Waltham , MAwersja 4.4.0Oprogramowanie Volocity jest używane do kroków 3.1 i 3.2 w protokole przetwarzania obrazu
Imaris x64 Oprogramowanie do analizy 3-wymiarowejBitplane, Concord, MAwersja 7.7.1Oprogramowanie Imaris jest używane w krokach od 3.3 do 3.5 w protokole do analizy obrazu
ExcelMicrosoft, Redmond, WAwersja Office 2013Arkusz kalkulacyjny Excel jest używany w kroku 3.6 w protokole do podsumowania cech morfometrycznych
Optymalna temperatura cięcia ZwiązekSakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA4583w skrócie OCT
Leica CryostatLeica Biosystems, Buffalo Grove, ILCM1850Kriostat do cięcia 50 i mikro; m sekcje
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0ThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsC10600Używany jako kontrola pozytywna do oznaczania mitochondriów zielonym sygnałem fluorescencyjnym

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondria ImagingNerve FibersConfocal Microscopy3D Image AnalysisFluorescence ImmunohistochemistryEpidermal MitochondriaNerve specific MitochondriaZ series AcquisitionSurface MaskingMitochondrial Quantification

Related Articles