Artykuł metodologiczny

Pomiar przyczepiania i internalizacji wirusa grypy A w komórkach A549 za pomocą cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/53372

⸱

4 listopada 2015

 , 
1Institute of Medical Virology, University of Zurich

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokół opisujący półilościową metodę pomiaru zarówno przyczepiania wirusa grypy A do komórek A549, jak i internalizacji cząsteczek wirusa do komórek docelowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przywiązanie do komórek docelowych, a następnie internalizacja to pierwsze kroki w cyklu życia wirusa grypy A (IAV). Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół pomiaru względnych zmian w ilości cząstek wirusa, które przyczepiają się do komórek A549, ludzkiej linii komórek nabłonka płuc, a także w ilości cząstek, które są internalizowane do komórki. Używamy biotynylowanego wirusa, który można łatwo wykryć po barwieniu streptawidyną znakowaną Cy3 (STV-Cy3). Opisujemy wzrost, oczyszczanie i biotynylację A/WSN/33, szeroko stosowanego szczepu laboratoryjnego IAV. Związane na zimno biotynylowane cząstki IAV na komórkach A549 są barwione STV-Cy3 i mierzone za pomocą cytometrii przepływowej. Aby zbadać wychwyt cząstek wirusa, wirus związany z zimnem może zostać zinternalizowany w temperaturze 37 °C. W celu rozróżnienia między zewnętrznymi i zinternalizowanymi cząstkami wirusa stosuje się etap blokowania: Wolne miejsca wiązania na biotynie przyłączonego wirusa na powierzchni komórki są wiązane przez nieznakowaną streptawidynę (STV). Późniejsza przenikanie komórek i barwienie za pomocą STV-Cy3 umożliwia następnie wykrycie zinternalizowanych cząstek wirusa. Przedstawiamy obliczenia mające na celu określenie względnej ilości wirusa zinternalizowanego. Ten test jest odpowiedni do pomiaru wpływu leczenia farmakologicznego lub innych manipulacji na przywiązanie lub internalizację IAV.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawienie się wirusa grypy A (IAV) to wieloetapowy proces, który rozpoczyna się od wiązania wirusa z receptorami na błonie komórkowej komórek docelowych 1. Receptorem dla IAV jest kwas sjalowy, który jest obecny w wielu różnych glikoproteinach i glikolipidach. Białko hemaglutyniny (HA) IAV, które jest obecne w otoczce wirusa, wiąże się z kwasem sjalowym i w ten sposób pośredniczy w przyłączaniu cząstek wirusa do błony komórkowej komórek docelowych 2. Wirus wnika do komórek poprzez endocytozę za pośrednictwem klatryny, ale opisano również alternatywne drogi wnikania, takie jak makropinocytoza, 3-6. Interakcja między kwasem hialowym a kwasem sjalowym wydaje się być wystarczająca do pośredniczenia zarówno w przyłączaniu, jak i wyzwalaniu internalizacji cząstek wirusa 7. Niemniej jednak zaproponowano alternatywne receptory wejścia, a ich rola w wnikaniu do IAV jest obecnie badana 1,8,9.

Obecnie podejmowane są wysiłki mające na celu zidentyfikowanie czynników gospodarza, które są zaangażowane w cykl życia wirusa, w celu opracowania pilnie potrzebnych nowych terapii przeciwwirusowych 10-12. Wniknięcie wirusa byłoby korzystnym krokiem w kierunku ukierunkowania wzrostu IAV w celu zablokowania infekcji wirusowej w jej najwcześniejszym punkcie. Eksperymentalne zmierzenie różnych etapów wnikania wirusa IAV jest trudne, ponieważ zwykle do wykrycia przychodzącego wirusa potrzebne są duże ilości wirusa. Ponadto zakres wykrywania zmian w wnikaniu wirusa jest tylko liniowy ze względu na brak replikacji wirusa. Podkreśla to potrzebę stosowania testów o wysokiej czułości.

Test, który tutaj prezentujemy, pozwala na wykrycie wirusa przyczepionego na powierzchni komórki, jak również na wykrycie wirusa zinternalizowanego w stosunku do całkowitej ilości wirusa związanego z komórką. Zastosowanie biotynylowanego wirusa typu dzikiego umożliwia wygodny pomiar poprzez barwienie STV-Cy3 i odczyt za pomocą cytometrii przepływowej. Biotynylowany wirus jest związany na zimno z komórkami, aby umożliwić przyłączenie, ale zapobiec internalizacji cząstek wirusa. Komórki mogą być utrwalane, przepuszczalne i barwione za pomocą STV-Cy3 w celu zmierzenia przyłączonego wirusa. Sygnał z zewnątrzkomórkowych, przyłączonych wirionów może zostać zniesiony, jeśli przed utrwaleniem zostanie zastosowany etap blokowania, w którym komórki są inkubowane z nieznakowaną streptawidyną (STV). W kolejnym etapie, po przyłączeniu biotynylowanego IAV, temperatura jest zmieniana na 37 °C i pozwala na internalizację cząstek wirusa. Zinternalizowane cząstki są chronione przed wiązaniem STV, co pozwala na rozróżnienie wirusów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych.

Na warunki eksperymentalne wymagane są cztery próbki: '0 min': Pierwsza próbka, oznaczona jako '0 min', ma na celu zmierzenie zimnego wirusa na powierzchni komórki. '0 min + STV': Druga próbka, oznaczona jako '0 min + STV', podaje podstawową intensywność sygnału eksperymentu. Przyłączony wirus jest blokowany za pomocą STV, a sygnał po barwieniu STV-Cy3 powinien być znacznie niższy w porównaniu z próbką "0 min". "30 min": Trzecia próbka, "30 min" zawiera wirusa przyłączonego i zinternalizowanego w wyniku zmiany temperatury do 37 °C przez 30 minut. "30 min + STV": Czwarta próbka, "30 min + STV", mierzy wewnątrzkomórkową frakcję wirusów. Etap blokowania STV stosuje się po 30-minutowym okresie inkubacji. W rezultacie, cząsteczki wirusa na powierzchni komórki są wiązane przez STV, pozostawiając tylko zinternalizowane wirusy dostępne do barwienia STV-Cy3. Względną ilość wirusa zinternalizowanego można obliczyć jako stosunek wirusa zinternalizowanego (mierzony w próbce "30 min + STV") podzielony przez całkowitą ilość wirusa (opisaną przez próbkę "30 min").

Jako kontrolę sugerujemy dołączenie komórek zainfekowanych metodą mock. Sygnał następujący po barwieniu STV-Cy3 pozorowanych zainfekowanych komórek daje tło wynikające z protokołu barwienia. Kontrola przyłączenia do IAV polega na wstępnym traktowaniu komórek neuraminidazą bakteryjną (NA). NA oddziela kwas sjalowy od glikoprotein komórkowych, usuwając w ten sposób receptory przyłączeniowe z powierzchni komórki. Azydek sodu (SA) jest silnym inhibitorem metabolizmu, a tym samym blokuje endocytozę 13. Komórki traktowane azydkiem sodu powinny być dodatnie pod względem wiązania wirusa, ale ujemne pod względem internalizacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga przed rozpoczęciem: Używaj kaptura z przepływem laminarnym i odpowiedniego zabezpieczenia biologicznego podczas pracy z żywym wirusem. W tym miejscu opisano warunki wzrostu odpowiednie do hodowli szczepu wirusa grypy A/WSN/33. Wielokrotność infekcji (MOI) i czas inkubacji mogą się różnić w zależności od użytego szczepu wirusa.

1. Przygotowanie biotynylowanego wirusa A/WSN/33

  1. Nasiona komórek Madin-Darby canine kindey (MDCK) do kolby T175 cm2 przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (Pen / Strep). Hodować komórki w temperaturze 37 °C aż do osiągnięcia około 70% zbieżności.
  2. Przed zakażeniem usuń pożywkę i umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH 7,0-7,3), dodając wystarczająco dużą objętość, aby pokryć monowarstwę komórki.
  3. Usuń PBS i zainfekuj komórki A/WSN/33 o MOI 10-4. Rozcieńczony wirus w PBS uzupełniony 0,02 mg Mg2+, 0,01 mg Ca2+, 0,3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 1% Pen/Strep (zakażenie-PBS). Użyć inokulum o pojemności 4 ml do kolby T175 cm2.
  4. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Usunąć inokulum przez aspirację i odpipetować 10 ml DMEM uzupełnionego 0,3% BSA, 20 mM HEPES i 1% Pen/Strep do kolby.
  5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez około 3 dni, aż do uzyskania efektu cytopatycznego (CPE), a następnie pobrać supernatant. CPE można rozpoznać jako zaokrąglanie komórek, po którym następuje odwarstwienie i śmierć komórek 14.
  6. Wirować supernatant w temperaturze 450 x g przez 5 minut, aby usunąć resztki komórek. Przenieś supernatant do nowej probówki Falcon i powtórz ten krok jeszcze raz. Wyrzuć granulki.
  7. Przenieść supernatanty do probówek ultrawirówek i umieścić supernatanty pod 5 ml 30% sacharozy rozcieńczonej w buforze NTE (10 mM Tris [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Zrównoważyć probówki przed ultrawirowaniem i napełnić PBS, aby osiągnąć końcową objętość 30 ml. Wirować supernatanty przy 112 398 x g (co odpowiada 25 000 obr./min dla wirnika SW28) przez 90 minut w ultrawirówce.
  8. Ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie i namoczyć osad wirusa w temperaturze 4 °C w 250 μl PBS. Zawiesić osad, pipetując w górę iw dół. Zmierz zawartość białka w oczyszczonym wirusie za pomocą testu Bradforda 15.
  9. Użyj zestawu do biotynylacji, aby wygenerować biotynylowany A/WSN/33. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
  10. Krótko mówiąc, dodaj odpowiednią ilość biotyny do oczyszczonego wirusa i inkubuj przez 2 godziny na lodzie. Przenieść wirusa do probówki ultrawirówkowej i napełnić probówkę PBS, aż do uzyskania końcowej objętości 30 ml. Wiruj wirusa przy 112 389 xg przez 90 minut w ultrawirówce. Usunąć supernatant za pomocą pipetowania i dodać 250 μl PBS. Namoczyć osad przez noc w temperaturze 4 °C. Podwielokrotność Biotynylowanego wirusa przechowywać w temperaturze -80 °C, gdzie będzie stabilny przez co najmniej 24 miesiące.
    UWAGA: Pomocne może być określenie miana biotynylowanego preparatu IAV za pomocą standardowego testu płytki nazębnej. Należy jednak zauważyć, że kolejny protokół będzie mierzył tylko biotynylowane cząsteczki wirusa. Pozostałe niebiotynylowane cząstki spowodowane niepełną biotynylacją przyczynią się do miana zakaźnego za pomocą testu płytki nazębnej, ale nie do sygnału mierzonego w teście przyłączania/internalizacji.

2. Określ wymaganą ilość biotynylowanego wirusa

UWAGA: Zanim zostanie przeprowadzony test przyłączenia/internalizacji, ważne jest określenie ilości biotynylowanego wirusa potrzebnej do zainfekowania wszystkich komórek próbki.

  1. Hodowla i trypsyna komórek A549 zgodnie z instrukcjami producenta. Policz komórki za pomocą komory komórkowej. Odpipetuj 200 000 komórek A549 do probówek głębinowych FACS. Wirowanie 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 200 μl PBS. Schłodzić komórki na lodzie przez 10 minut.
  2. Przygotować 5-krotne seryjne rozcieńczenia biotynylowanego wirusa w zakażonym PBS.
  3. Probówki wirujące zawierające komórki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad ze 100 μl wirusa zawierającego wirusa-PBS. Jako pozorowaną kontrolę użyj infekcji-PBS bez biotynylowanego wirusa. Inkubuj probówki na lodzie przez 1 godzinę.
  4. Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS. Powtórz ten krok jeszcze raz.
  5. W celu utrwalenia wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl 3,7% paraformaldehydu (PFA). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie powtórzyć krok prania opisany w 2.4).
  6. W celu przepuszczalności wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl PBS zawierającym 0,5% Triton X-100. Inkubować przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Następnie powtórzyć krok prania opisany w 2.4).
  7. Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i zawiesić osad w 50 μl 2% BSA rozcieńczonym w PBS zawierającym STV-Cy3. (Należy pamiętać, że odpowiednie stężenie STV-Cy3 należy określić przed rozpoczęciem eksperymentu. Zacznij od stężenia 1:200 i przetestuj 2-krotne rozcieńczenia do 1:2,400. W naszych rękach rozcieńczenie 1:1000 okazało się optymalne.)
  8. Inkubuj 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej. Następnie powtórzyć etap płukania opisany w ppkt 2.4, ale ponownie zawiesić osad w 200 μl 2% BSA rozcieńczonym w PBS.
  9. Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej 16. Brama w populacji Cy3-dodatniej. Wybierz najniższe stężenie biotynylowanego wirusa, co daje maksymalną liczbę komórek Cy3-dodatnich w populacji A549.

3. Określ wymaganą ilość streptawidyny


UWAGA: Skuteczność blokowania sygnału pochodzącego z wirusa zewnątrzkomórkowego określa zakres wykrywania testu. Dlatego ważne jest, aby w jak największym stopniu usunąć sygnał STV-Cy3. Wymagana ilość potrzebnego STV zależy od ilości użytego biotynylowanego wirusa (określonej w sekcji 2).

  1. Postępuj zgodnie z krokami 2.1-2.4, ale użyj stężenia wirusa określonego w sekcji 2.
  2. Przygotować pięciokrotne seryjne rozcieńczenia STV rozcieńczonego w PBS zawierającym 2% BSA i 0,1% azydku sodu.
  3. Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w rozcieńczeniu 50 μl STV. Jako próbną kontrolę należy użyć PBS zawierającego 2% BSA i 0,1% azydku sodu bez STV. Inkubuj probówki przez 30 minut na lodzie. Następnie powtórzyć etap prania opisany w ppkt 2.4.
  4. Wykonaj kroki 2.5-2.9. Do testu internalizacji wybierz najniższe stężenie STV, co daje silny blok sygnału Cy3 (w porównaniu z próbką, w której nie było STV). W tym celu można użyć procentu komórek CY3-dodatnich lub średniej intensywności fluorescencji sygnału Cy3. Idealnie byłoby, gdyby sygnał Cy3 próbek poddanych działaniu STV był jak najbardziej zbliżony do sygnału z pozorowanych zakażonych komórek.

4. Test przywiązania/internalizacji


UWAGA: Upewnij się, że przygotowałeś wszystkie odczynniki przed rozpoczęciem testu. W przypadku trzech grup kontrolnych przedstawionych w sekcji wyników (pozorowane zakażone komórki, komórki poddane wstępnej działaniu neuraminidazy i komórki poddane działaniu azydku sodu) wymagane są niewielkie zmiany w protokole.

  1. Przygotuj 16 probówek głębinowych, z których każda zawiera 200 000 komórek A549. Obok zestawu doświadczalnego składającego się z 4 probówek znajdują się 3 warunki kontrolne, z których każdy wymaga 4 probówek: komórki zakażone pozorem, komórki poddane działaniu neuraminidazy (NA) i komórki poddane działaniu azydku sodu. Każda grupa składa się z 4 probówek oznaczonych jako "0 min", "0 min + STV", "30 min", "30 min + STV".
  2. Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS.
  3. Probówki wirować w temperaturze 4 °C przy 450 x g. Usunąć supernatant i zawiesić osad w 200 μl DMEM zawierającym 0,3% BSA, 20 mM HEPES i 1% penicyliny-streptomycyny (pożywka inkubacyjna). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Do kontroli neuraminidazy: W celu ponownego zawieszenia komórek należy użyć neuraminidazy bakteryjnej (np. sialidazy z Vibrio) o stężeniu 200 mU/ml rozcieńczonej w pożywce inkubacyjnej.
  4. Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS. Powtórz ten krok jeszcze raz, a następnie schłodzić rurki na lodzie przez 10 minut.
  5. Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl biotynylowanego wirusa (użyć stężenia wirusa oznaczonego w sekcji 2 rozcieńczonego w zakażeniu-PBS). Inkubować 1 godzinę na lodzie. Następnie powtórzyć etap prania opisany w 2.4.
    UWAGA: W przypadku fałszywej kontroli zainfekowanej: Użyj infection-PBS bez wirusa. Do kontroli azydku sodu: Stosować wirusa rozcieńczonego w zakażeniu-PBS uzupełnionego 0,1% azydkiem sodu.
  6. Przetwarzanie próbek po zakażeniu na lodzie:
    1. W przypadku próbek "0 min" należy postępować zgodnie z krokiem 2.5 i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C do czasu utrwalenia pozostałych próbek.
    2. W przypadku próbek "0 min + STV" probówki wirować w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 μl STV (użyć stężenia określonego w sekcji 3) rozcieńczonym w PBS zawierającym 2% BSA i 0,1% azydku sodu (w celu zapobieżenia internalizacji podczas obchodzenia się z próbką). Inkubować 30 minut na lodzie. Postępuj zgodnie z krokami 2.4-2.5 i przechowuj próbki w temperaturze 4 °C.
    3. W przypadku próbek "30 min" należy wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS zawierającym 2% BSA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Postępować zgodnie z krokiem 2.4-2.5 i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Do kontroli azydku sodu: Stosować PBS uzupełniony 2 % BSA i 0,1 % azydkiem sodu przez 30 minut inkubacji w temperaturze 37 °C.
    4. W przypadku próbek "30 min + STV" wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS zawierającym 2% BSA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 450 x g. Usunąć supernatant i zawiesić osad w 50 μl STV (użyć stężenia określonego w sekcji 3) rozcieńczonym w PBS zawierającym 2% BSA i 0,1% azydku sodu (w celu zapobieżenia internalizacji podczas obchodzenia się z próbką). Inkubować 30 minut na lodzie. Postępuj zgodnie z krokami 2.4-2.5 i przechowuj próbki w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Do kontroli azydku sodu: Stosować PBS uzupełniony 2 % BSA i 0,1 % azydkiem sodu przez 30 minut inkubacji w temperaturze 37 °C.
  7. Wykonaj kroki 2.6-2.8 i przeanalizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Określ procent komórek Cy3-dodatnich w każdej próbce.
  8. Oblicz procent dołączonego wirusa i względną ilość wirusa zinternalizowanego.
    1. Aby obliczyć ilość przyłączonego wirusa, użyj procentu komórek bramkowanych Cy3-dodatnich lub średniej intensywności fluorescencji sygnału Cy3. Dla porównania, ustaw nieleczone komórki na 100% (Rysunek 4B).
      UWAGA: Procent dołączonego wirusa jest opisany przez próbkę "0 min".
    2. Aby obliczyć ilość zinternalizowanego wirusa, należy wziąć stosunek próbki "30 min + STV" do próbki "30 min" (rysunek 5B).
      UWAGA: Jak wspomniano powyżej, można użyć procentu dodatnich komórek bramkowanych Cy3 lub średniej intensywności fluorescencji sygnału Cy3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek opisujący cztery różne warunki eksperymentalne jest pokazany na rysunku 1. Wyniki reprezentatywnego eksperymentu przedstawiono na rysunkach 2-5. W próbce "0 min" biotynylowany wirus jest związany na zimno z komórkami docelowymi, co można uwidocznić za pomocą barwienia STV-Cy3 (ryc. 1 i 2). Po zastosowaniu etapu blokującego (w próbce "0 min + STV") wirus na powierzchni komórki nie może być już wykryty przez barwienie STV-Cy3. W re...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz protokół opisuje prosty sposób pomiaru przyczepiania się i internalizacji wirusa za pomocą cytometrii przepływowej. Pozwala na użycie znakowanego wirusa typu dzikiego, który bardziej naśladuje infekcje wirusowe w porównaniu z użyciem cząstek wirusopodobnych (VLP). Chociaż nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem pomiaru przyczepiania i internalizacji IAV, można go łatwo dostosować do innych wirusów. Ponadto, ponieważ do odczytu stosuje się cytometrię przepływową, barwienie współaktywne można łatwo dodać do pro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (31003A_135278) dla SSt. MOP jest beneficjentem grantu doktorskiego z Funduszu Badawczego AXA. Dziękujemy Patricii Nigg za pomoc w zaprojektowaniu rysunku 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMLife Technologies41966-052
FBSLife Technologies10270-106
Penicylina-StreptomycynaLife Technologies15140-163
PBSLife Technologies14190-169   
BSAVWR Calbiochem126579
HEPESLife Technologies15630-100
D-sacharozaFluka84100
TRISBiosolve BV20092391
EDTAZestaw EZ-LINK
NHS-SS-BIOTIN firmyFisher ScientificW9971E 
Bio Rad Protein Bio AssayProbówki głębinowe Bio Rad500-0006
(mikroprobówki 1,2 ml)Milian82 00 001
PFA  Lucerna chem  Mikroskopia elektronowa nauki15710
probówki ultrawirówkoweHemotec HmbH253070
Triton X-100Fluka93420
STV-Cy3Life Technologies43-4315
STVLife Technologies43-4302
azydek soduFluka71290
neuraminidaza bakteryjna/ sialidazaSigma-AldrichN6514-1UN

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
  2. Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  3. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
  4. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
  5. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
  6. Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329(2011).
  7. Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
  8. Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
  9. Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
  10. Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
  11. Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
  12. Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
  13. Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
  14. Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769(2013).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  16. Macey, M. G. Flow Cytometry Principles and Applications. Macey, M. G. , Humana Press. (2007).
  17. Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

przywieranie wirusainternalizacja wirusabiotynilowany wirusbarwienie streptawidynwi zanie na zimnozmiana temperaturyetap blokowania

Powiązane artykuły