Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Summary

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Abstract

Transport białek błonowych na poziomie pojedynczego białka nadal unika szczegółowej analizy, jeśli translokowany substrat nie jest elektrogeniczny. Poczyniono znaczne wysiłki w tej dziedzinie, ale techniki umożliwiające zautomatyzowaną, wysokoprzepustową analizę transportu w połączeniu z bezrozpuszczalnikowymi technikami dwuwarstwowymi lipidów wymaganymi do analizy transporterów błonowych są rzadkie. Ta klasa transporterów ma jednak kluczowe znaczenie dla homeostazy komórek, a zatem jest kluczowym celem w opracowywaniu leków i metodologiach w celu uzyskania nowych informacji, które są rozpaczliwie potrzebne.

Prezentowany tutaj manuskrypt opisuje stworzenie i obsługę nowego biochipa do analizy procesów transportu za pośrednictwem białek błonowych w rozdzielczości pojedynczego transportera. Biochip składa się z mikrownęk otoczonych nanoporami, który jest wysoce równoległy w swojej konstrukcji i może być produkowany w klasie przemysłowej i ilości. Liposomy zawierające białka można bezpośrednio nakładać na powierzchnię chipa, tworząc samoorganizujące się dwuwarstwy lipidowe obejmujące pory przy użyciu technik SSM (stałe błony lipidowe na podłożu). Części membrany rozciągające się na porach są wolnostojące, zapewniając interfejs do translokacji substratu do lub z przestrzeni wnęki, po której można śledzić wielospektralny odczyt fluorescencyjny w czasie rzeczywistym. Ustanowienie standardowych procedur operacyjnych (SOP) pozwala na proste ustanowienie dwuwarstw lipidowych zawierających białka na powierzchni chipa praktycznie każdego białka błonowego, które można funkcjonalnie odtworzyć. Jedynym warunkiem wstępnym jest stworzenie fluorescencyjnego systemu odczytu dla nieelektrogenicznych substratów transportowych.

Aplikacje do badań przesiewowych o wysokiej zawartości są możliwe dzięki użyciu zautomatyzowanych odwróconych mikroskopów fluorescencyjnych, rejestrujących wiele chipów równolegle. Duże zbiory danych mogą być analizowane za pomocą ogólnodostępnego, specjalnie zaprojektowanego oprogramowania analitycznego. Trójkolorowy, wielospektralny odczyt fluorescencyjny pozwala ponadto na bezstronną dyskryminację danych w różnych klasach zdarzeń, eliminując wyniki fałszywie dodatnie.

Technologia chipów jest obecnie oparta na powierzchniach SiO₂, ale możliwa jest również dalsza funkcjonalizacja przy użyciu powierzchni chipów pokrytych złotem.

Introduction

Analiza białek błonowych stała się coraz bardziej interesująca w badaniach podstawowych i farmaceutycznych w ciągu ostatnich 20 lat. Rozwój nowych leków zależy od identyfikacji i szczegółowej charakterystyki nowych celów, które obecnie są jednym z czynników ograniczających. Fakt, że około 60% wszystkich celów leków to białka^błonowe1, sprawia, że opracowanie technik wyjaśniających ich funkcję ma kluczowe znaczenie.

W przeszłości techniki badania kanałów elektrogenicznych i transporterów były rozwijane w wielu ^2-4. Z kolei podłoża nieelektrogeniczne stanowią trudniejsze zadanie. Są one jednak szczeg....

Protocol

1. Przygotowanie dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUV)

1. Wyczyść kolbę okrągłodenną (objętość 10 ml) azotem gazowym, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu. Przepłukać kolbę okrągłodenną alkoholem etylowym.
   Uwaga: Resztkowy etanol może być tolerowany i nie przeszkadza w kolejnych krokach.
2. Umyj szklaną strzykawkę o pojemności 1 ml 4x chloroformem, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Dodać 4 ml SoyPC20 (25 mg/ml w chloroformie) do kolby okrągłodennej i domieszkować roztwór lipidów dodatkowym DOPE^ATTO390 do końcowego stężenia 0,1 mol%,
   Uwaga: Zamiast DOPE^ATTO390 można również stosować inne ....

Results

Membrany poszerzające pory można łatwo tworzyć na powierzchni nanostrukturalnego chipa w sposób samoorganizujący się. Jednak proces leżący u podstaw jest nadal delikatny i ma na niego wpływ wiele parametrów, takich jak wielkość liposomów, monodyspersyjność populacji liposomów, blaszkowatość, stężenie lipidów i soli oraz chemiczne właściwości powierzchni. Większość z tych parametrów została dokładnie scharakteryzowana i ustandaryzowana w powyższym protokole. Inne parametry powinny być jedn.......

Discussion

Przedstawiona technika pozwala na wysoce równoległą analizę transportu białek błonowych. Zrekonstytuowane systemy białek błonowych mogą być bezpośrednio nakładane na biochip, co teoretycznie umożliwia adaptację każdego transportera błonowego lub kanału. Analiza transportu jest ograniczona jedynie przez ustanowienie systemu odczytu fluorescencyjnego, albo poprzez bezpośrednią zmianę fluorescencji (translokacja fluoroforów lub substratów znakowanych fluorescencyjnie), albo pośrednią zmianę fluorescencji (barwniki wrażliwe .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
2-(trimetyloamonio)etylo] metanetiosulfonian	Toronto Research Chemicals Inc.	T792900	MTSET; hydrolizowany wodą. Przechowywać w suchej objętości w temperaturze -80 °C. Zużyć natychmiast (30 minut) po rozpuszczeniu w buforze.
Strzykawka gazoszczelna 1 ml	Hamilton	#1001
Kolba okrągła 10 ml	Koraliki szklane Schott Duran
2,7 mm	Roth	N032.1
2-Propanole	Roth	9866.5
30 cm Rurka przedłużająca Luer-Lock	Sarstedt	744304
Aceton	Roth	5025.5
Bio-Koraliki SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920	należy aktywować przed pierwszym użyciem
CaCl2 Dihydrat	Roth	HN04.3
Calcein	Sigma	C0875	przechowywać w ciemności w temperaturze -20 ° C
Odczynnik chloroformowy klasy	VWR Chemicals	22711324
DOPEATTO390	ATTO-TEC	AD 390-165	przechowywać w ciemności w temperaturze -20 ° C
Absolut	etanolu Sigma-Aldrich	32205
Injekt Strzykawka jednorazowa	Braun	460 60 51V
Injekt-F Strzykawka jednorazowa	Braun	91 66 017V
Klipsy do kecka	Schott	KC29
L-&alfa;-Fosfatydylocholina, 20% (sojowa)	Avanti Polar Lipids	5416016	przechowywać w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze -20 &; C
NaCl 99,5% rocznie	Roth	3957.2
Nanopore E100 wafel/chipy	Mikromotoryka (Moguncja/Niemcy)		dostępne na zamówienie
Nucleopore Track-Etch Membrane 0,4 i mikro; m	Whatman	800282
Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)	life Technologies	D-7173	przechowywać w ciemności przy -20 stopniach; C
Oy647	Luminartis (Mü nster / Niemcy)	OY-647-T-1mg	przechowywać w ciemności w temperaturze -20 & deg; C
Filtracja strzykawką Rotilabo, niesterylna, wielkość porów 0,22 i mikro; m	Roth	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	materiał kolumny do chromatografii wykluczającej rozmiar
Silastic MDX4-4210	Dow Corning		do mocowania wiórów na szklanym wsporniku nakrywkowym
lepki-Slide 8-dołkowa	ibidi	80828	do montażu na szkiełkach szklanych (uchwyt na wióry)
Zawór trójdrożny niebieski	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan 99,9% Ultra Jakość	Roth	5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0,2 i mikro; m Filtr membranowy z azotanu celulozy	Roth	NH69.1
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
>Equipment
Bü chi 461 kąpiel wodna	Bü chi
Bü chi Rotavapor RE 111	Bü
Cary Eclipse	Varian
LiposoFast Mini Extruder	Avestin
Pompa membranowa	Vaccubrand	15430
Nanosight Mikroskop śledzący nanocząstki	Malvern / Nanosight	LM 14C
Mikroskop NyONE	Synentec		dostępny na zamówienie
Sterowanie pompą	Vaccubrand	CVC 2II
Wanna Sonorex RK100H	Brandelin elektroniczna	31200001107477
Pompa próżniowa RC5	Vaccubrand	1805400204
Łaźnia wodna W13	Haake	002-9910
Myjka plazmowa PDC-37G	Harrick Plasma	PDC-37G
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Software
ImageJ	Open Source	http://imagej.nih.gov/ij/	naukowe oprogramowanie do przetwarzania obrazów
NanoCalcFX	Freeware	http://sourceforge.net/projects/nanocalc/	oprogramowanie do analizy/oceny danych dla ogromnych zestawów danych kinetycznych transportu
Oprogramowanie analityczne NTA 2.3 Oprogramowanie do	Nanosight		do śledzenia nanocząstek mikroskop
NTA 2.3 Temperature Comms	Nanosight		oprogramowanie do kontroli temperatury do mikroskopu śledzącego nanocząstki