Artykuł metodologiczny

Odzyskiwanie fluorescencji po połączeniu kropli w celu zmierzenia dwuwymiarowej dyfuzji monowarstwy fosfolipidowej

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53376

⸱

15 października 2015

 ,  ,  , 
1Department of Bio and Brain Engineering, KAIST, 2Information and Electrical Research Institute, KAIST

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy nową technikę pomiaru bocznej dyfuzji gatunków powierzchniowo czynnych na granicy płyn-płyn poprzez połączenie monowarstwy kropelki z płaską monowarstwą.

Streszczenie

Wprowadzamy nową metodę pomiaru dyfuzyjności bocznej monowarstwy środka powierzchniowo czynnego na granicy płyn-płyn, zwaną odzyskiwaniem fluorescencji po połączeniu (FRAM). FRAM przyjmuje te same zasady, co technika odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP), szczególnie do pomiaru odzysku fluorescencji po wybielaniu określonego obszaru, ale FRAM wykorzystuje koalescencję kroplową zamiast fotowybielania cząsteczek barwnika w celu wywołania gradientu potencjału chemicznego cząsteczek barwnika. Nasza technika ma kilka zalet w porównaniu z FRAP: wymaga jedynie mikroskopu fluorescencyjnego, a nie mikroskopu konfokalnego wyposażonego w lasery o dużej mocy; jest zasadniczo wolny od doboru barwników fluorescencyjnych; I ma znacznie większą swobodę w definiowaniu mierzonej powierzchni dyfuzji. Co więcej, FRAM potencjalnie zapewnia drogę do badania mieszania lub wzajemnej dyfuzji dwóch różnych środków powierzchniowo czynnych, gdy monowarstwy na powierzchni kropli i na płaskiej granicy faz powietrze/woda są przygotowywane z różnymi gatunkami, niezależnie.

Wprowadzenie

Fosfolipidy są głównymi składnikami błon komórkowych i błon organelli, a płynność tych warstw błonowych często wpływa na funkcje komórkowe poprzez zmianę aktywności białek błonowych1–3. Na przykład homeostazę lipidów błonowych osiąga się poprzez regulację płynności błony, która jest wykrywana przez białka błonowe, a nieprawidłowy poziom płynności powoduje poważne choroby, takie jak stłuszczenie wątroby i cholestaza4. Ponadto płynność monowarstwy fosfolipidowej na granicy faz płynu powietrze-pęcherzyki płucne ma ważne implikacje dla jego funkcji. Wysoka płynność monowarstwy fosfolipidowej surfaktantu płucnego ułatwia rozprowadzanie warstwy podczas wdechu, natomiast niska płynność umożliwia pozostawanie warstwy w pęcherzykach płucnych podczas wydechu5,6. Dlatego ważne jest, aby oszacować płynność warstw fosfolipidowych, aby zrozumieć ich rolę.

Bezpośrednią miarą płynności jest lepkość, a lepkość warstw fosfolipidowych została zmierzona za pomocą koloidów o rozmiarach mikronowych7, igieł magnetycznych8,9 i mikroguzików magnetycznych6,10,11. Jednak techniki te są ograniczone do stosunkowo sztywnych warstw i nie mogą mierzyć warstw o mniejszej lepkości. W takich przypadkach dyfuzyjność byłaby alternatywą dla ilościowego określenia płynności warstw fosfolipidowych. Przez kilkadziesiąt lat opracowywano różnorodne techniki pomiaru właściwości dyfuzyjnych warstw fosfolipidowych, takie jak metoda wygaszania fluorescencji12, gradient pola pulsacyjnego NMR13 i spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS)14. Jedną z najbardziej reprezentatywnych metod jest odzysk fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)15,16. Ze względu na prostotę procedury pomiarowej i związanych z nią teorii, przeprowadzono kilka badań nad właściwościami dyfuzyjnymi warstw fosfolipidowych przy użyciu FRAP17–19. Jednak FRAP zwykle wymaga drogiej konfiguracji mikroskopu konfokalnego z laserem o dużej mocy.

Tutaj prezentujemy nową technikę pomiaru bocznej dyfuzji monowarstw fosfolipidowych, określaną jako odzyskiwanie fluorescencji po połączeniu (FRAM). Kluczowa różnica między FRAP a FRAM polega na tym, że etap fotowybielania jest zastąpiony przez koalescencję kroplową. Połączenie kropli pokrytej monowarstwą niefluorescencyjną z monowarstwą znakowaną fluorescencyjnie pozostawia okrągłą ciemną plamę na jasnej płaskiej monowarstwie, ustanawiając w ten sposób ten sam stan początkowy z etapem fotowybielania. Następnie obserwujemy odzysk fluorescencji w ciemnym zabarwieniu z czasem, aby zmierzyć dyfuzyjność boczną. Ta nowa "wybielanie" krokowa koalescencja kropli zapewnia znaczące korzyści w porównaniu z FRAP: FRAM wymaga jedynie mikroskopu fluorescencyjnego, a nie drogiego mikroskopu konfokalnego z laserem o dużej mocy, który jest niezbędny do FRAP. Ponadto FRAM posiada szeroki wybór barwników fluorescencyjnych, ponieważ nie obejmuje procesu fotowybielania. Wreszcie, dwie różne monowarstwy, monowarstwa kropelkowa i monowarstwa płaska, mogą być przygotowane niezależnie, co pozwala na pomiar interdyfuzji, podczas gdy FRAP mierzy tylko samodyfuzję monowarstw.

FRAM dostarcza szeroki zakres pomiarów dyfuzji od materiałów o wysokiej lepkości do materiałów prawie nielepkich. Zasadniczo FRAM może mierzyć maksymalną dyfuzyjność 106 μm2 / s, która jest porównywalna z istniejącymi technikami, gdy dyfuzja zachodzi na obszarze 100 μm na 100 μm w czasie procesu koalescencji kroplowej (~ 10 ms). Co więcej, powolny proces dyfuzji można łatwo zmierzyć, chyba że monowarstwy są stałe. FRAM może być stosowany do wszelkiego rodzaju materiałów powierzchniowo czynnych, o ile dostępne są odpowiednie cząsteczki znakowane fluorescencyjnie.

Protokół

Uwaga: Przed użyciem acetonu i chloroformu, które są rakotwórcze, należy zapoznać się z kartami charakterystyki materiałów (MSDS).

1. Przygotowanie monowarstwy fosfolipidowej na płaskim styku powietrze-woda

  1. Tworzenie monowarstwy fosfolipidowej
    1. Przygotowanie roztworu fosfolipidów
      1. Oczyść fiolkę o pojemności 4 ml z nakrętką powlekaną politetrafluoroetylenem, używając acetonu, etanolu i wody dejonizowanej co najmniej trzy razy, a następnie dokładnie przedmuchaj fiolkę azotem, aby usunąć wodę.
      2. Rozpuść 1 mg fosfolipidu (np. dioleoylphosphatidylcholine, DOPC) w 1 ml chloroformu w fiolce, aby uzyskać stężenie 1 mg/ml. Ze względów bezpieczeństwa wykonaj tę procedurę w dygestorium. W razie potrzeby zastosuj niższe lub wyższe stężenia roztworu fosfolipidów.
      3. Dodaj fosfolipidy znakowane barwnikiem (np. Rhodamine dipalmitoylphosphatidylethanolamine, Rhodamine DPPE) w ilości poniżej 1 mol % roztworu fosfolipidów, aby umożliwić wizualizację monowarstwy fosfolipidowej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Ze względów bezpieczeństwa wykonaj tę procedurę w dygestorium.
      4. Owiń fiolkę taśmą z politetrafluoroetylenu, aby zapobiec odparowywaniu rozpuszczalnika, i przechowuj próbkę w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    2. Osadzanie fosfolipidów na granicy faz powietrze-woda
      1. Oczyść szalkę Petriego (o średnicy 55 mm i wysokości 12 mm) etanolem i wodą dejonizowaną co najmniej trzy razy.
      2. Napełnij szalkę Petriego 10 ml wody dejonizowanej, aby stworzyć granicę faz powietrze-woda.
      3. Za pomocą mikrosyringi rozprowadź kilka mikrolitrów roztworu fosfolipidów na czystej granicy faz, aby uzyskać pożądane ciśnienie powierzchniowe, i odczekaj co najmniej 30 min przed rozpoczęciem eksperymentu, aby rozpuszczalnik całkowicie odparował.
        Uwaga: Jeśli wymagana jest precyzyjna kontrola ciśnienia powierzchniowego, zamiast szalki Petriego można zastosować korytko Langmuira.
  2. Pomiar ciśnienia powierzchniowego
    1. Zmierz ciśnienie powierzchniowe monowarstwy fosfolipidowej za pomocą tensiometru z płytką Wilhelmy’ego. Jeśli jako płytkę Wilhelmy’ego stosowany jest papier filtracyjny, odczekaj co najmniej 30 min, aż zostanie on wystarczająco zwilżony. Szczegółowy protokół dostępny jest w pracy Kuhn et al.20.
    2. Dostosuj ilość osadzonych fosfolipidów, aby precyzyjnie kontrolować ciśnienie powierzchniowe. Dodaj 4 µl roztworu DOPC (1 mg/ml) na obszar granicy faz o powierzchni 30,25 cm2, jeśli wymagane jest ciśnienie powierzchniowe rzędu ~ 5 mN/m.
      Uwaga: Jeśli papier filtracyjny nie jest całkowicie zwilżony, ciśnienie powierzchniowe gwałtownie zmienia się podczas pierwszych 30 min eksperymentu z powodu zmiany masy papieru filtracyjnego.
  3. Minimalizacja przepływu konwekcyjnego monowarstwy
    1. Użyj aparatu w kształcie stożka zawierającego 3 mm zbiornik z dwoma cienkimi kanałami, połączonymi z szeroką sekcją szalki Petriego, aby stłumić przepływ konwekcyjny monowarstwy, który może zakłócać obrazowanie morfologii i pomiar ciśnienia powierzchniowego.
    2. Przed osadzeniem fosfolipidów na granicy faz powietrze-woda upewnij się, że poziomy wody wewnątrz i na zewnątrz aparatu w kształcie stożka są zgodne, aby zapewnić swobodne przemieszczanie się fosfolipidów po całym obszarze.

2. Przygotowanie monowarstwy fosfolipidowej na zakrzywionej powierzchni kropli

  1. Wyciąganie kapilary szklanej za pomocą wyciągarki mikropipet
    1. Umieść kapilarę szklaną (o.d. 1 mm, i.d. 0.78 mm, długość 100 mm) w uchwycie kapilarnym wyciągarki mikropipet.
    2. Zaprojektuj program wyciągania kapilar z odpowiednimi wartościami parametrów (Heat: Ramp, Pull: 60, Vel: 70, Delay: 70 oraz Pressure 200) i wykonaj wyciąganie kapilar zgodnie z zaprojektowanym programem i protokołem producenta.
      Uwaga: Do utworzenia kropli o średnicy 100 µm przy przyłożeniu ciśnienia ~ 10 kPa konieczny jest koniec kapilary o średnicy kilku mikrometrów. Jeśli końcówka kapilary jest zbyt mała, do uzyskania kropli wymagane jest znacznie wyższe ciśnienie, > 600 kPa, natomiast przy zbyt dużej średnicy końcówki kapilary trudno jest kontrolować wielkość kropli.
  2. Absorpcja fosfolipidów na powierzchni kropli
    Uwaga: Aby utworzyć monowarstwę fosfolipidową na zakrzywionym interfejsie kropli, stosuje się roztwór fosfolipidów bez znaczników barwnikowych, aby uzyskać kontrast intensywności względem płaskiej monowarstwy przygotowanej zgodnie z procedurą 1. Dopuszczalne jest zastosowanie zarówno procedury 2.2.1, jak i 2.2.2. Jeśli wymagana jest precyzyjna kontrola ciśnienia powierzchniowego na powierzchni kropli, zdecydowanie zaleca się procedurę 2.2.2. W przeciwnym razie przydatna jest procedura 2.2.1, która jest znacznie prostsza niż procedura 2.2.2.
    1. Proces powlekania fosfolipidami końcówki kapilary
      1. Oczyść szkiełko przedmiotowe za pomocą acetonu, etanolu i wody dejonizowanej co najmniej trzy razy.
      2. Umieść zwężoną kapilarę na oczyszczonym szkiełku przedmiotowym i przechyl ją, aby ułatwić kontakt końcówki kapilary ze szkiełkiem.
      3. Za pomocą szklanej strzykawki nanieś kilka kropli roztworu fosfolipidów (1 mg/ml) na końcówkę kapilary przylegającą do szkiełka przedmiotowego i odczekaj co najmniej 30 min do całkowitego odparowania rozpuszczalnika.
        Uwaga: Podczas procedury 2.2.1.3 zdecydowanie zaleca się dociskanie końcówki kapilary do szkiełka przedmiotowego, ponieważ obwód końcówki jest zbyt mały, aby utrzymać kroplę fosfolipidów na samym końcu kapilary wyłącznie dzięki siłom kapilarnym.
    2. Przygotowanie roztworu pęcherzyków
      1. Oczyść fiolkę i usuń z niej wodę, zgodnie z opisem w procedurze 1.1.1.1.
      2. Osusz 2 ml roztworu fosfolipidów (1 mg/ml), delikatnie nadając strumień azotu, a następnie pozostaw fiolkę w eksyكاتهrze przez 1 h w RT, aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika. Ze względów bezpieczeństwa procedurę tę należy przeprowadzać w dygestorium.
      3. Dodaj 2 ml wody dejonizowanej do fiolki z wysuszonymi lipidami i inkubuj fiolkę w piecu w temperaturze 60 °C przez 1 h.
      4. Kilkakrotnie wstrząśnij fiolką, a następnie poddaj sonikacji (częstotliwość HF: do 40 kHz, moc: 370 W) przez 30 min w celu uzyskania pęcherzyków.
      5. Przeprowadź procesy ekstruzji oraz zamrażania i rozmrażania, aby uzyskać monodyspersyjne pęcherzyki jednowarstwowe. Szczegółowy protokół przygotowania pęcherzyków opisany jest w pracy Mayer et al.21.
        Uwaga: Ciśnienie powierzchniowe interfejsu kropli jest precyzyjnie kontrolowane poprzez regulację czasu oczekiwania po utworzeniu kropli zawierającej monodyspersyjne pęcherzyki jednowarstwowe. Przed przystąpieniem do eksperymentu, korzystając z metody wiszącej kropli22, należy zmierzyć zmianę ciśnienia powierzchniowego w czasie.
  3. Tworzenie kropli zawierającej monowarstwę fosfolipidową na zakrzywionej powierzchni
    1. Napełnij zwężoną kapilarę 10 µl wody dejonizowanej z procedury 2.2.1. Alternatywnie użyj 10 µl roztworu pęcherzyków z procedury 2.2.2.
    2. Podłącz kapilarę do automatycznego mikroinjektora, aby zapewnić ciśnienie niezbędne do utworzenia kropli.
    3. Zamocuj kapilarę podłączoną do mikroinjektora w mikromanipulatorze, aby precyzyjnie kontrolować jej pozycję.
    4. Przygotuj mikroskop w świetle przechodzącym (Mikroskop 1, obiektyw: 10X NA 0.3) do obrazowania widoku bocznego kapilary za pomocą kamery CCD. Mikroskop 1 umożliwia w ten sposób obserwację dokładnej pozycji kropli wzdłuż osi z oraz oszacowanie jej wielkości.
    5. Za pomocą mikromanipulatora przesuń końcówkę w pozycję, w której widok boczny jest dobrze widoczny w Mikroskopie 1, a następnie przyłóż zmienne ciśnienie (~ 100 hPa) przez końcówkę kapilary, aż do utworzenia kropli o odpowiedniej wielkości (~100 µm średnicy).
      Uwaga: Zaleca się stosowanie automatycznego mikroinjektora i mikromanipulatora, jeśli wymagana jest precyzyjna kontrola wielkości i położenia kropli. Możliwe jest również użycie urządzeń manualnych.

3. Obrazowanie powrotu fluorescencji po łączeniu kropel

Uwaga: Podstawowe zasady tego protokołu są identyczne z zasadami techniki FRAP, z wyjątkiem procesu koalescencji kropli. Szczegółowy protokół oraz powiązane teorie FRAP są dostępne w publikacjach A. Lopez et al.15 oraz D. Axelrod et al.16.

  1. Monitorowanie i kontrolowanie położenia kropli
    1. Przygotuj zestaw mikroskopu odwróconego (Mikroskop 2, obiektyw: 10X NA 0.3, soczewka tubusowa: ogniskowa 17 cm), który umożliwia korzystanie zarówno z mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednim zestawem filtrów dla Rhodamine-DPPEs (pobudzenie przy 560 nm, emisja przy 583 nm), jak i mikroskopu w polu jasnym. Użyj kamery CCD do wizualizacji widoku z góry kropli w trybie mikroskopu fluorescencyjnego oraz w trybie mikroskopu w polu jasnym.
    2. Przenieś kroplę powleczoną fosfolipidami do płaskiego interfejsu powietrze-woda wzdłuż osi z, korzystając z mikromanipulatora, ale nie łącz jeszcze kropli z interfejsem. Użyj Mikroskopu 1 do wizualizacji widoku bocznego kropli.
    3. Zlokalizuj kroplę w centrum widoku z góry płaskiej monowarstwy, korzystając z mikromanipulatora. Użyj trybu mikroskopu w polu jasnym Mikroskopu 2 do wizualizacji widoku z góry płaskiej monowarstwy.
  2. Łączenie kropli z płaskim interfejsem powietrze-woda
    1. Przesuwaj kroplę dalej w kierunku płaskiego interfejsu, aż do momentu połączenia się kropli z interfejsem, korzystając z mikromanipulatora. Jeśli proces łączenia przebiegł pomyślnie, w trybie fluorescencyjnym Mikroskopu 2 zaobserwuje się ciemny obszar o okrągłym kształcie otoczony białym tłem.
    2. Zarejestruj serię obrazów fluorescencyjnych w zależności od czasu po połączeniu kropli, korzystając z trybu fluorescencyjnego Mikroskopu 2. Zastosuj częstotliwość klatek wyższą niż skala czasowa dyfuzji monowarstwy. W monowarstwie DOPC pełna dyfuzja do 200 µm ciemnego obszaru trwa kilka minut.

4. Wyznaczanie współczynnika dyfuzji za pomocą analizy obrazu

Uwaga: Aby wyznaczyć współczynnik dyfuzji z serii obrazów, zbudowano dostosowany program do analizy obrazu, zgodnie z opisem poniżej. Szczegółowy kod źródłowy tego programu jest dostępny na stronie internetowej JoVE.

  1. Wykrywanie kolistego obszaru zainteresowania
    1. Wykrywanie środka obszaru zainteresowania
      1. Uzyskaj serię obrazów fluorescencyjnych zarejestrowanych podczas procesu regeneracji, które zawierają ciemny kolisty obszar i białe tło, a pierwszy obraz z serii ustaw jako obraz referencyjny. Tutaj RD jest promieniem ciemnego obszaru na obrazie referencyjnym.
      2. Przeprowadź splot obrazu referencyjnego z białym kołem o jednorodnej intensywności w całym obszarze. Do splotu użyj wbudowanej funkcji „conv2”, zgodnie z kodem źródłowym dostosowanego programu w linii 124. Tutaj promień białego koła jest nieco mniejszy od RD.
      3. Znajdź pozycję wskazującą wartość minimalną w obliczeniach splotu i ustaw tę pozycję jako środek obszaru zainteresowania na obrazie referencyjnym.
    2. Wyznaczanie promienia obszaru zainteresowania
      1. Przeprowadź splot obrazu referencyjnego z białym kołem o jednorodnej intensywności w całym obszarze, którego pozycja środka została wyznaczona w procedurze 4.1. Tutaj RS jest promieniem białego koła. Użyj iteracji takiej jak „for” lub „while” wraz z równaniem koła, aby stworzyć białe koło, zgodnie z kodem źródłowym dostosowanego programu od linii 102 do 109.
      2. Przeprowadź splot obrazu referencyjnego z innym białym kołem o nieco większym promieniu (5%–10%), RL, niż RS. Użyj tej samej metody co w procedurze 4.1.2.1, aby stworzyć koło zgodnie z kodem źródłowym dostosowanego programu od linii 113 do 120.
      3. Oblicz różnicę wartości pomiędzy dwoma obliczeniami splotu z punktów 4.1.2.1 i 4.1.2.2.
      4. Powtórz powyższe procedury dla wartości RS od RD/2 do RS = 2RD, zwiększając zarówno RS, jak i RL o jeden piksel. Stwórz iterację obejmującą cały kod źródłowy od procedury 4.1.2.1 do 4.1.2.3 w celu powtórzenia procesu.
      5. Znajdź promień RS, który wskazuje maksymalną różnicę wartości pomiędzy dwoma obliczeniami splotu. Użyj wbudowanej funkcji „max”, aby znaleźć promień wskazujący maksymalną różnicę wartości, zgodnie z kodem źródłowym dostosowanego programu w liniach 148 do 149. Ten RS wskazuje zatem promień ciemnego obszaru na obrazie referencyjnym.
  2. Obliczanie intensywności ułamkowej
    1. Ustaw koło o pozycji środka i promieniu wyznaczonym w procedurze 4.1 jako obszar zainteresowania.
    2. Oblicz średnie intensywności obszaru zainteresowania w serii obrazów fluorescencyjnych w funkcji czasu. Przeprowadź splot każdej klatki z obszarem zainteresowania i podziel wynik przez powierzchnię obszaru zainteresowania, aby obliczyć średnią intensywność. Szczegóły znajdują się w kodzie źródłowym dostosowanego programu dostępnym na stronie internetowej JoVE.
    3. Oblicz intensywność ułamkową zdefiniowaną poniższym równaniem, gdzie F(t) jest średnią intensywnością w kole będącym obszarem zainteresowania w funkcji czasu, Fi to intensywność początkowa w kole, a Fo to intensywność białego tła.
      f(t) = (F(t) – Fi)/(Fo – Fi)      (Równanie 1).
  3. Dopasowanie intensywności ułamkowej do teorii FRAP
    1. Dopasuj intensywność ułamkową do poniższego równania, gdzie τ jest charakterystycznym czasem dyfuzji, a I0, I1 są zmodyfikowanymi funkcjami Bessela, używając programu do dopasowania danych, i wyznacz τ
      Równanie zaniku wykładniczego, f(t)=Ce^(-2πt/τ), z funkcjami Bessela I₀ i I₁.      (Równanie 2).
    2. Wyznacz współczynnik dyfuzji na podstawie zależności τ = a2/4D, gdzie D jest współczynnikiem dyfuzji, a a jest promieniem ciemnego obszaru.
      Uwaga: Podczas procesu dopasowania można przesunąć profil intensywności ułamkowej wzdłuż osi czasu, jeśli proces regeneracji rozpoczął się już przed rejestracją obrazów.

Wyniki

Seria obrazów fluorescencyjnych została uzyskana w czasie trwania procesu regeneracji po połączeniu kropli pokrytej monowarstwą DOPC z płaską monowarstwą DOPC, jak przedstawiono na Rysunku 1. Monowarstwa DOPC na płaskim interfejsie powietrze-woda została domieszkowana niewielkimi ilościami Rhodamine-DPPE, co umożliwiło wizualizację tła o jasnym kolorze oraz ciemnego obszaru nowo dodanego do płaskiego interfejsu. W tych warunkach zaobserwowano proces regeneracji przy stałym ciśnieniu powierzchniowym 23 mN/m. Dopasowanie równania 1 do zmiany ułamkowej intensywności w funkcji czasu przedstawiono na Rysunku 2. Wartość R2 dla tego dopasowania wynosi 0,999, a model ten pozostaje skuteczny również przy niższych lub wyższych ciśnieniach powierzchniowych. Współczynnik dyfuzji monowarstwy DOPC uzyskany z tego dopasowania wyniósł 27,54 µm2/sec przy ciśnieniu powierzchniowym 23 mN/m.

W celu dalszej walidacji metody FRAM zmierzono współczynniki dyfuzji monowarstw DOPC oraz dipalmitoylofosfatydylocholiny (DPPC) w zależności od ciśnienia powierzchniowego. Jak pokazano na Rysunku 3, FRAM rejestruje gwałtowny spadek współczynnika dyfuzji monowarstwy DPPC przy ciśnieniu powierzchniowym ok. 9 mN/m, gdzie zachodzi przejście fazowe LC (ciecz skondensowana) – LE (ciecz rozszerzona)10, a wartości współczynników dyfuzji są zgodne z wcześniejszymi pomiarami przeprowadzonymi przez Peters et al.19. Ponadto w monowarstwie DOPC zaobserwowano wykładniczy spadek współczynnika dyfuzji wraz ze wzrostem ciśnienia powierzchniowego, a tendencja ta jest niemal identyczna z pomiarami wykonanymi przez Caruso et al.12.

Eksperyment z monowarstwą lipidową; proces znakowania fluorescencyjnego; schemat, wyniki mikroskopii poklatkowej.
Rysunek 1. (A) Schematyczna ilustracja techniki FRAM (fluorescence recovery after merging – powrót fluorescencji po połączeniu). W momencie połączenia kropli pokrytej monowarstwą lipidową z płaskim interfejsem powietrze-woda, monowarstwa lipidowa bez lipidów znakowanych fluorescencyjnie zostaje wprowadzona do płaskiej fluorescencyjnej monowarstwy lipidowej. (B) Obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego z zaznaczeniem czasu podczas procesu powrotu monowarstwy DOPC przy ciśnieniu powierzchniowym 23 mN/m (pasek skali = 100 µm). Ciemny obszar monowarstwy DOPC zostaje w pełni uzupełniony w wyniku procesu dyfuzji w ciągu kilku minut. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres intensywności ułamkowej; krzywa danych zależna od czasu pokazująca wyniki procesu łączenia w ciągu 80 sekund.
Rysunek 2. Intensywność ułamkowa w funkcji czasu. Czarne kółka i szara kropkowana linia wskazują odpowiednio wartości intensywności ułamkowych uzyskane z analizy obrazu (procedury 4.1 i 4.2) oraz dopasowanie równania 1 do intensywności ułamkowych w czasie, przedstawione w procedurze 4.3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykres współczynnika dyfuzji w funkcji ciśnienia powierzchniowego; analiza DPPC, DOPC; wizualizacja danych naukowych.
Rysunek 3. Współczynniki dyfuzji monowarstw DOPC (trójkąt) i DPPC (pusty kwadrat) w funkcji ciśnienia powierzchniowego. Linie w kolorze jasnoszarym i ciemnoszarym wskazują wartości współczynnika dyfuzji zgłoszone wcześniej odpowiednio przez Peters et al. oraz Caruso et al. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Jeong et al.23. Przedruk za zgodą Jeong et al. Langmuir. 30(48), 14369-14374. Copyright 2014 American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

FRAM ma wiele wspólnych zasad z FRAP, zwłaszcza do pomiaru odzysku fluorescencji po wybielaniu określonego obszaru, ale FRAM wykorzystuje proces łączenia kropli z płaską powierzchnią międzyfazową w celu utworzenia wybielonego obszaru, zamiast stosowania intensywnego światła. Proces łączenia jest więc najważniejszym krokiem w FRAM, a w szczególności kształt ciemnej plamy na płaskiej monowarstwie po połączeniu kropli decyduje o dokładności pomiaru dyfuzyjności. W szczególności, w oparciu o obecną metodę, ustawiamy tylko okrąg o promieniu R jako obszar zainteresowania, aby obliczyć średnią intensywność ciemnej plamy, pokazanej w procedurze 4, a jeśli występuje zbyt duże odchylenie od okrągłego kształtu, zakłóciłoby to precyzyjny pomiar współczynnika dyfuzji. Dlatego konieczne jest uzyskanie ciemnego obszaru w kształcie koła, ale nieokrągłe kształty powstają czasami z kilku powodów. Po pierwsze, jeśli na szalce Petriego występuje przepływ konwekcyjny, kształt ciemnego obszaru wydłuża się wzdłuż kierunku przepływu. Jak wspomniano w procedurze 1.3, aparat w kształcie stożka pomaga stłumić przepływ konwekcyjny, a wydłużenie to zostałoby zminimalizowane. Po drugie, jeśli końcówka kapilary dotyka płaskiego interfejsu podczas procesu łączenia, ciemny obszar tworzy się o różnych kształtach, ponieważ koniec kapilarny przerywa proces łączenia. Uzyskując kroplę, która zwisa tylko z samego końca naczynia włosowatego, można zapobiec tej przerwie. W szczególności hydrofobowa obróbka naczynia włosowatego pomaga kropelce usiąść na samym końcu naczynia włosowatego. Dlatego powyższe rozwiązywanie problemów i modyfikacje pozwalają nam na dokładniejszy pomiar właściwości dyfuzji.

Ten dobrze rozwiązywalny proces rozwiązywania problemów pozwala zatem FRAM mieć kilka istotnych zalet w porównaniu z FRAP. Po pierwsze, FRAM wymaga prostszego sprzętu w porównaniu do FRAP. W przypadku FRAM wystarczy użyć prostego mikroskopu fluorescencyjnego, zamiast drogiego mikroskopu konfokalnego z laserem dużej mocy, którego długość fali musi być zgodna z widmem absorpcyjnym barwnika. Ponadto konieczne jest użycie dodatkowej aparatury w celu dostosowania wielkości do bielonego obszaru w FRAP, podczas gdy FRAM łatwo kontroluje wielkość obszaru poprzez regulację wielkości kropli lub ciśnienia powierzchniowego na powierzchni kropli. Po drugie, możliwe jest stosowanie różnych gatunków barwników w FRAM. FRAP wykorzystuje wyłącznie cząsteczki barwnika, których proces bielenia jest znacznie szybszy niż proces dyfuzji. Jeśli dyfuzja barwników zachodzi podczas procesu bielenia, trudno jest dokładnie oszacować właściwości dyfuzji. FRAM nie wymaga jednak procesu wybielania barwników, co umożliwia stosowanie różnych rodzajów barwników w obrazowaniu fluorescencyjnym. Ponadto FRAP wymaga dodatkowych laserów dużej mocy i zestawów filtrów do zmiany gatunków barwników, podczas gdy konieczna jest tylko wymiana zestawów filtrów w FRAM. Wreszcie, ponieważ monowarstwy na powierzchni kropli i płaskiej granicy faz mogą być tworzone niezależnie, umożliwiając w ten sposób badanie wzajemnej dyfuzji lub mieszania między dwiema różnymi monowarstwami lipidowymi poprzez łączenie monowarstwy typu A z monowarstwą typu B, podczas gdy FRAP mierzy tylko samodyfuzję monowarstwy.

Pomimo tych zalet, proces łączenia kropli z płaską powierzchnią powietrzno-wodną może potencjalnie ograniczyć tę technikę ze względu na kilka problemów, które mogą być niepokojące, takich jak niedopasowanie ciśnienia powierzchniowego między dwiema monowarstwami, skala czasowa procesu łączenia oraz wzrost ciśnienia powierzchniowego płaskiej monowarstwy po połączeniu kropel. Kwestie te nie wpływają jednak znacząco na pomiar dyfuzji z następujących powodów. Po pierwsze, nawet jeśli ciśnienie powierzchniowe w dwóch różnych monowarstwach jest znacznie różne, proces równoważenia jest zakończony na bardzo wczesnym etapie procesu odzyskiwania. Na przykład, jeśli ciśnienie powierzchniowe monowarstwy na powierzchni kropli jest wyższe niż ciśnienie monowarstwy na płaskim granicy faz powietrze-woda, ciemny obszar rozszerza się, aż ciśnienie powierzchniowe się zrównoważy. Ponieważ proces ten jest zakończony w ciągu 10 ms, ciśnienie powierzchniowe zostanie zrównoważone, zanim znacząco wpłynie na proces dyfuzji. Po drugie, jeśli skala czasowa procesu łączenia jest wystarczająco szybka, nie ogranicza to w ogóle pomiaru dyfuzji. Na szczęście typowy proces scalania również odbywa się w ciągu 10 ms. Wreszcie, nawet wielokrotne łączenie kropel na płaskim interfejsie nie zwiększa nacisku powierzchniowego, ponieważ powierzchnia koryta jest znacznie większa niż powierzchnia kropli. Zgodnie z rozmiarami koryta i kropel, opisanymi w protokole, powierzchnia na cząsteczkę zwiększa się o mniej niż 0,015% przez połączenie kropli. W związku z tym wzrost ciśnienia powierzchniowego spowodowany zmianą pola powierzchni na cząsteczkę jest mniejszy niż 0,1%, co jest nieistotne, ponieważ jest znacznie mniejszy niż typowy błąd ciśnienia powierzchniowego, mierzony za pomocą tensjometru płytkowego Wilhelmy'ego.

Podsumowując, wprowadziliśmy nową metodę pomiaru właściwości dyfuzji bocznej monowarstwy fosfolipidowej poprzez połączenie monowarstwy kropelkowej z płaskim interfejsem. Technika ta wymaga stosunkowo prostego sprzętu, a także umożliwia stosowanie różnego rodzaju gatunków barwników. FRAM ma zatem potencjalne zastosowanie do pomiaru dyfuzji dowolnych czynników powierzchniowo czynnych, w tym fosfolipidów, kopolimerów blokowych, białek, a nawet nanocząstek na granicy faz płyn-płyn. Ponadto spodziewamy się, że FRAM zapewni nowy sposób badania wzajemnej dyfuzji lub mieszania między dwoma różnymi środkami powierzchniowo czynnymi.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez finansowany przez KAIST projekt K-Valley RED&B na rok 2014 oraz Program Badań Podstawowych prowadzony przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonOCI corporationAceton 3.8L Extra Pure Purity: ≥ 99.5%, Przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS).
EtanolOCI corporationEtanol 3,8L Extra Pure Purity: ≥ 94%, Przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS).
Dioleoylfosfatydylocholina, DOPCAvanti Polar Lipids850375CPrzed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS). Chloroform jest rakotwórczy.
ChloroformLiChrosolvChloroform ultraczysty (A3633)Czystość: ≥ 99,8%, Przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS). Rakotwórcze
rodaminy DPPEAvanti Polar Lipids810158C, 810158PUnikaj bezpośredniej ekspozycji na światło, aby zapobiec fotowybielaniu
Tensjometr płytkowy Wilhelmy'egoR& Technologia ultracienkich filmów organicznych KTensjometr Wilhelmy'egohttp://www.rieglerkirstein.de/index.htm
Ściągacz do mikropipetInstrument SutterP-1000
MikrowtryskiwaczEppendorfFemtojet
MikromanipulatorEppendorfMikromanipulator 5171
1Soczewka obiektywu: OlympusSoczewka obiektywu: UPlanFl 10xSoczewka obiektywu: 10X NA 0.3
Mikroskop 2Soczewka obiektywu: Olympus, Tubus Soczewka: ThorlabsSoczewka obiektywu: UPlanFl 10xSoczewka obiektywu: 10X NA 0.3, tubus soczewki: ogniskowa 17 cm
CCD do mikroskopu 1JaiCV 950
CCD do mikroskopu 2AndoriXon3 EMCCD
Zestaw filtrówTechnologia ChromaZestaw katalogowy 49004: ET545, T565, ET605Preparat odpowiedni do cząsteczek barwnika
SonicatorDAIHAN ScientificWiseclean WUC-D06H
Mikroskop Kamera

Bibliografia

  1. Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  2. Christon, R., Even, V., Daveloose, D., Léger, C. L., Viret, J. Modification of fluidity and lipid—protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).
  3. Stubbs, C. D., Smith, A. D. The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).
  4. Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
  5. Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).
  6. Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a, Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).
  7. Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion. Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101(2014).
  8. Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a, Schwartz, D. K. Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers. Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).
  9. Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. Active interfacial shear microrheology of aging protein films. Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).
  10. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
  11. Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers. Nature Commun. 2 (5), 312(2011).
  12. Caruso, F., et al. Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements. J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).
  13. Filippov, A., Orädd, G., Lindblom, G. The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers. Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).
  14. Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).
  15. Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D. Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).
  16. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  17. Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory. Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).
  18. Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).
  19. Peters, R., Beck, K. Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).
  20. Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H. Physical Methods of Chemistry. Crawley, J. N., et al. 1, Part 3B, 651-653 (1972).
  21. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).
  22. Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces. J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).
  23. Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces. Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika FRAMpomiar ciśnienia powierzchniowegokoalescencja kroplimikroskopia fluorescencyjnamieszanie monowarstw lipidowychpomiar współczynnika dyfuzjigranica powietrze-woda
Odzyskiwanie fluorescencji po połączeniu kropli w celu zmierzenia dwuwymiarowej dyfuzji monowarstwy fosfolipidowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.