Synteza nanowłókien na bazie keratyny w inżynierii biomedycznej

Podsumowanie

Elektroprzędzone nanowłókna mają wysoki stosunek powierzchni do masy, doskonałą integralność mechaniczną oraz wspierają wzrost i proliferację komórek. Te nanowłókna mają szeroki zakres zastosowań biomedycznych. Tutaj wytwarzamy nanowłókna keratynowe/PCL przy użyciu techniki elektroprzędzenia i charakteryzujemy włókna pod kątem możliwych zastosowań w inżynierii tkankowej.

Streszczenie

Electrospinning, ze względu na swoją wszechstronność i potencjał do zastosowań w różnych dziedzinach, jest często używany do produkcji nanowłókien. Produkcja tych porowatych nanowłókien cieszy się dużym zainteresowaniem ze względu na ich unikalne właściwości fizykochemiczne. W tym miejscu omówimy wytwarzanie nanowłókien zawierających keratynę zawierającą nanowłókna poli(ε-kaprolakton) (PCL) (tj. Włókno kompozytowe PCL/keratyna). Keratyna rozpuszczalna w wodzie została po raz pierwszy wyekstrahowana z ludzkich włosów i zmieszana z PCL w różnych proporcjach. Zmieszany roztwór PCL/keratyny przekształcono w błony nanowłókniste za pomocą zaprojektowanego w laboratorium zestawu do elektroprzędzenia. Morfologię włókien oraz właściwości mechaniczne otrzymanego nanowłókna obserwowano i mierzono za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i testera rozciągania. Ponadto za pomocą FTIR badano degradowalność i właściwości chemiczne nanowłókien. Obrazy SEM wykazały jednolitą morfologię powierzchni dla włókien PCL/keratynowych o różnym składzie. Te włókna PCL/keratynowe wykazały również doskonałe właściwości mechaniczne, takie jak moduł Younga i punkt uszkodzenia. Komórki fibroblastów były w stanie przyłączać się i namnażać się, co dowodzi dobrej żywotności komórek. Opierając się na cechach omówionych powyżej, możemy zdecydowanie argumentować, że mieszane nanowłókna polimerów naturalnych i syntetycznych mogą stanowić doskonały rozwój materiałów kompozytowych, które mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań biomedycznych.

Wprowadzenie

Elektroprzędzenie jest uznawane za powszechną metodę uzyskiwania nanowłókien polimerowych. Włókna mogą być wytwarzane w nanoskali, a właściwości włókien można dostosować ¹. Te osiągnięcia i charakterystyka elektroprzędzonych nanowłókien są szczególnie interesujące ze względu na ich zastosowania w inżynierii biomedycznej, zwłaszcza w inżynierii tkankowej. Elektroprzędzone nanowłókna wykazują podobieństwa do macierzy zewnątrzkomórkowej, a tym samym sprzyjają adhezji, migracji i proliferacji komórek². Ze względu na to podobieństwo do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), włókna elektroprzędzone mogą być używane jako materiały wspomagające opatrywanie ran, dostarczanie leków oraz do inżynierii tkanek, takich jak wątroba, kości, serce i mięśnie³.

Do stworzenia włókien elektroprzędzonych do różnych zastosowań inżynierii biomedycznej użyto wielu różnych polimerów pochodzenia syntetycznegoⁱ naturalnego. 4. W ostatnim czasie rośnie zainteresowanie rozwojem nanowłókien kompozytowych poprzez mieszanie polimerów syntetycznych i naturalnych⁴. W tych kompozycjach produkty końcowe zazwyczaj dziedziczą wytrzymałość mechaniczną związaną z polimerem syntetycznym, a jednocześnie przyjmują wskazówki i właściwości biologiczne polimeru naturalnego.

W tym eksperymencie, PCL i keratyna są przedstawione jako syntetyczne i naturalne polimery, które mają być użyte do syntezy kompozytowego nanowłókna. Keratyna to naturalny polimer, który znajduje się we włosach, wełnie i paznokciach. Zawiera wiele reszt aminokwasowych; Godnym uwagi zainteresowaniem jest cysteina^4,5. Idealnie byłoby, gdyby naturalnie występujący polimer był bioodnawialny, biokompatybilny i biodegradowalny. Keratyna posiada wszystkie trzy te cechy, jednocześnie zwiększając proliferację komórek i przywiązanie do biomateriałów, w których została włączona⁶.

Polikaprolakton (PCL) to resorbowalny, syntetyczny polimer, który ma duże znaczenie w inżynierii tkankowej⁴. Polimer ten był wcześniej chwalony za swoją stabilność strukturalną i mechaniczną, jednak brakuje mu powinowactwa komórkowego i wykazuje długie tempo degradacji. Hydrofobowy charakter PCL jest prawdopodobnie odpowiedzialny za brak powinowactwa komórkowego⁷. Jednak PCL rekompensuje swoje ograniczenia tym, że jest wysoce mieszalny z innymi polimerami. Kompozyt PCL/keratyna powinien wykazywać właściwości mechaniczne PCL i uwzględniać właściwości biologiczne keratyny, co czyni go idealnym wyborem do różnych zastosowań biomedycznych.

Protokół

Wszystkie protokoły są zgodne z wytycznymi Biura ds. Zgodności i Etyki Badań Uniwersytetu Stanowego Karoliny Północnej A&T.

1. Chemiczne przygotowanie do ekstrakcji keratyny ⁴

1. Aby przygotować 1000 ml 2% wag./obj. roztworu kwasu nadoctowego (PAS), pod wyciągiem należy dodać 20 ml kwasu nadoctowego do 980 ml wody dejonizowanej (DI).
2. Aby przygotować 1 000 ml 100 mM roztworu zasady Tris (TBS), dodaj 12,2 g zasady Tris do 1 000 ml wody demineralizowanej i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.
3. Przygotować rozcieńczony roztwór kwasu solnego (DHAS) w dygestorium, wlewając 4 ml stężonego kwasu solnego do 30 ml wody demineralizowanej.
4. Zaopatrz się w około 20 g ścinków włosów ludzkich, które nie zostały poddane obróbce chemicznej ani zmienione. Włosy mogą mieć dowolną długość.
5. Umyj włosy dokładnie, ręcznie, ciepłą wodą z mydłem. Do końcowego płukania użyj wody dejonizowanej (DI).
6. Przełóż włosy do dwóch zlewek o pojemności 600 ml i wstaw do piekarnika o temperaturze 80 ºC na 1 godzinę.
7. Odcedź płyn z dna zlewki i wstaw z powrotem do piekarnika, aż włosy całkowicie wyschną.
8. Podziel wysuszone włosy równomiernie między zlewki o pojemności 600 ml, umieszczając 10 g włosów w każdej zlewce. Nie pozwól, aby włosy wypełniły się więcej niż 500 ml.
9. Wlej 500 ml PAS do każdej zlewki, upewniając się, że pokryły wszystkie włosy. Przykryj zlewki parafilmem i przechowuj przez 12 godzin.

2. Przygotowanie roztworu ekstraktu keratynowego

1. Oddziel włosy od PAS za pomocą sita 500 μm. Odpady PAS należy zebrać do osobnego pojemnika. Dokładnie spłucz włosy wodą DI, aby usunąć wszelkie resztki PAS.
2. Umieść spłukane włosy w kolbie o pojemności 500 ml. Wlać 400 ml TBS do kolby, upewniając się, że włosy są pokryte. Umieścić kolbę w kąpieli wstrząsającej nastawionej na 38 °C, 65 obr./min na 1 godzinę.
3. Po upływie 1 godziny wyjąć z kąpieli wstrząsowej i wlać płyn, około 400 ml roztworu do ekstrakcji keratyny (KES), do zlewki o pojemności 1 000 ml.
4. Wlać 400 ml wody demineralizowanej do kolby zawierającej włosy, upewniając się, że włosy są pokryte i umieścić z powrotem w kąpieli wstrząsowej na 1 godzinę. Wyjąć kolbę z kąpieli wstrząsowej i wlać pozostałe 400 ml KES do zlewki o pojemności 1 000 ml z uprzednio zebranym KES. Włosy nie są już potrzebne i można je wyrzucić z kolby i wyrzucić do najbliższego pojemnika na śmieci.

3. Stężenie roztworu ekstraktu keratynowego

1. Napełnić kąpiel destylatora rotacyjnego do górnej linii wodą destylowaną i ustawić na 90 °C. Ustawić prędkość obrotową na 200 obr./min. Włączyć pompę agregatu chłodniczego płynu chłodzącego i ustawić na -10 ºC.
2. Używając pH-metru do monitorowania pH KES, użyj pipety, aby powoli dodawać 1 mM DHAS do KES, aż do osiągnięcia pH 7,0. Mieszaj powoli w miarę dodawania roztworu.
3. Wlać zneutralizowany KES do kolby okrągłodennej o pojemności 500 ml do około jednej czwartej wypełnienia. Uruchom destylator zgodnie z protokołem producenta na 1,25 godziny.
   1. Powtarzaj krok 3.3, aż cała KES zostanie zdestylowana. Upewnij się, że kolba jest szczelnie podłączona.

4. Dializa roztworu ekstraktu keratynowego

1. Wlać roztwór KES równomiernie do 12 oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 14 ml. Odwirować probówki o masie 1 050 x g przez 10 minut.
2. Wlej odwirowany KES do czystej zlewki, upewniając się, że wylałeś z dala od zebranych zanieczyszczeń. Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie KES zostaną odwirowane.
3. Napełnij cylinder z podziałką o pojemności 2,000 ml wodą DI.
4. Przytnij membranę celulozową rurki do dializy na 24 cale i przypnij jeden koniec rurki, aby ją zamknąć.
5. Zanurz rurkę w cylindrze z wodą DI, aby była bardziej elastyczna i łatwiejsza do otwarcia.
6. Otwórz niezaciśnięty koniec membrany celulozowej rurki do dializy i powoli wlej 60 ml odwirowanego roztworu KES do rurki. Użyj innego zacisku, aby zamknąć ten koniec rurki.
7. Umieść rurkę dializacyjną w butli o pojemności 2 000 ml z wodą demineralizowaną i pozostaw na 24 godziny. Zmieniaj wodę dimentalną w butli co 3 do 4 godzin.
8. Po upływie 24 godzin przelej dializowany roztwór KES do zakorkowanych słoików, pamiętając o pozostawieniu miejsca na górze i umieść w zamrażarce w temperaturze -20°C na 24 godziny.

5. Liofilizacja roztworu ekstraktu keratynowego

1. Ustawić liofilizator na -86 ºC.
2. Wyjmij słoiki zawierające zamrożony KES z zamrażarki, zdejmij nakrętki ze słoików i umieść je w ampułkach liofilizatora. Umieść uszczelki na ampułkach i przekręć pokrętło, aby wytworzyć podciśnienie 0,133 mBar. Liofilizuj próbki przez około 48 godzin, aż cała wilgoć zniknie.

6. Przygotowanie roztworów do elektroprzędzenia (10 % wag. roztworu keratynowego)

1. Usuń keratynę w proszku z liofilizatora i zważ ją.
2. Dodaj wodę DI do keratyny w proszku, aby uzyskać 10% wagowo-wagowy roztwór keratyny.

7. Przygotowanie 10% wagowego roztworu PCL

1. Otrzymać PCL (polimer ε-kaprolaktonu, Mn 70 - 90 kDa) i trifluoroetanol (TFE). Przygotować 10% wagowo PCL w TFE, mieszając O/N i otrzymać jednorodną mieszaninę.

8. Przygotowanie roztworu keratyny/PCL

1. Otrzymać uprzednio przygotowany 10% % roztwór PCL i 10% wag. roztwór keratyny. Stopniowo dodawaj keratynę do roztworu PCL, aby uzyskać 10 ml roztworów PCL/keratyny w proporcjach 90:10, 80:20, 70:30 i 60:40.
2. Użyj wirownika, aby uzyskać jednorodną mieszaninę roztworu PCL/keratyny przed elektrowirowaniem.

9. Produkcja elektroprzędzonego włókna PCL/keratynowego

1. Umieścić około 8 ml roztworu PCL/keratyny w jednorazowej strzykawce o pojemności 10 ml wyposażonej w plastikową rurkę o średnicy 0,5 mm. Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej, w której natężenie przepływu jest ustawione na 2,5 ml/h.
2. Przyłóż napięcie do końcówki igły podłączonej do rurki (umieszczonej ~23 cm od bębna zbierającego światłowód i ~30 stopni od poziomu). Przyłóż napięcie 19 - 22 kV do rury i obróć bęben kolektora z prędkością około 200 obr./min.
   1. Owinąć bęben kolektora folią aluminiową przed uruchomieniem próbki. Upewnij się, że folia aluminiowa jest stabilna, nakładając taśmę etykietową na obu końcach.
      Uwaga: Włókna utworzą się na folii aluminiowej (patrz rysunek 2), przechowuj folię pokrytą włóknem w temperaturze RT.

10. Analiza mechaniczna nanowłókien PCL/keratynowych

1. Pociąć próbkę na 60 mm na 8 mm. Upewnij się, że zapisałeś grubość za pomocą mikrometru cyfrowego. Do każdej przygotowanej kompozycji należy użyć pięciu próbek.
2. Podłącz próbkę o wymiarach 60 x 8 mm do testera rozciągania. Użyj specjalnie zaprojektowanego uchwytu na próbkę, aby przymocować próbkę. Umieścić próbkę między uchwytami na próbki, które są wykonane z karty indeksowej za pomocą taśmy dwustronnej. Zastosować czujnik wagowy 10 N o prędkości przemieszczenia 10 mm/min.
   Uwaga: Uchwyt próbki został zaprojektowany tak, aby miał wymiary 62 mm na 40 mm z wewnętrznym okienkiem 50 mm na 38 mm.
3. Rejestruj wartości rozszerzenia i obciążenia za pomocą oprogramowania zgodnie z protokołem oprogramowania.
4. Oblicz naprężenie, dzieląc siłę przez obszar badanej próbki. Następnie oblicz odkształcenie, dzieląc zmianę długości przez długość początkową.
5. Wygeneruj krzywą naprężenie-odkształcenie, wykreślając naprężenie na osi y dla odpowiedniej wartości odkształcenia na osi x.
6. Oblicz moduł Younga z obszaru liniowego, w którym nachylenie jest równe modułowi sprężystości. Określ wytrzymałość na rozciąganie na podstawie wykresu naprężenia i odkształcenia, biorąc 0,2% przesunięcia odkształcenia i rysując linię równoległą do krzywej obszaru liniowego.
7. Przeprowadzić analizę statystyczną danych mechanicznych uzyskanych wcześniej w trzech egzemplarzach, stosując jednoczynnikową analizę wariancji przy użyciu oprogramowania analitycznego⁸. Wartości p <0,05 uznano za istotne statystycznie.

11. Morfologia powierzchni i charakterystyka strukturalna

1. Za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) o parametrach napięcia przyspieszającego 15 kV i prądu 5 μA można obserwować morfologię włókien elektroprzędzonych.
   1. Przed obrazowaniem za pomocą SEM należy wyciąć odcinek włókna o długości 2 cm² i przymocować go do stolika SEM za pomocą taśmy miedzianej. Umieść stolik wewnątrz napylarki i pokryj złotem o natężeniu 15 mA przez 1 minutę i 30 sekund, aby utworzyć warstwę złota o grubości około 11 nm. Załaduj próbkę do komory SEM. Obserwuj próbki włókien.
2. Użyj spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), aby scharakteryzować wiązanie chemiczne między PCL a keratyną. Umieść odcinek 2 cm² elektroprzędzonej membrany z nanowłókien w uchwycie magnetycznym i przed testem przepłucz system suchym powietrzem. Uzyskaj widma dla 200 skanów i przeanalizuj widma za pomocą standardowego oprogramowania zgodnie z protokołem oprogramowania.
3. Wykonaj analizę widma przy użyciu standardowego oprogramowania i użyj trzech egzemplarzy każdego stosunku nanowłókien zgodnie z protokołem producenta.

12. Badanie interakcji komórka-włókno

1. Pokrój włókna na 16 mm² próbki. Użyj biokompatybilnego kleju na bazie silikonu, aby przymocować każdą próbkę do szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm.
2. Przyklej jeden koniec próbki włókna do tylnej części szkiełka nakrywkowego, owiń próbkę wokół szkiełka nakrywkowego, a następnie przyklej wolny koniec próbki również do tylnej części szkiełka nakrywkowego, pozostawiając górną część szkiełka pokrytą tylko próbką włókna.
3. Umieść próbki błonnika w 24-dołkowej płytce. Wysterylizuj próbki, zanurzając je w 80% etanolu na 1 godzinę.
4. Wypłukać etanol z próbek za pomocą wody demineralizowanej. Następnie naniec pipetą 2 ml podłoża podstawowego na próbki, upewniając się, że pokryła całą próbkę. Usuń podłoże po 5 minutach.
5. Użyj komórek fibroblastów 3T3 do wysiewu próbek błonnika. Zawiesić komórki w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej antybiotykami i 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), tak aby na 1 ml DMEM przypadało około 62 000 komórek/^cm2
.
6. Wrzuć 1 ml roztworu DMEM zawierającego komórki 3T3 do każdej płytki dołka, upewniając się, że każda próbka włókna jest pokryta około 62 000 komórek/^cm2. Inkubować płytki basenowe przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Uwaga: Użyj 5% CO₂ , ponieważ ten poziom zwykle może utrzymać pH pożywki komórkowej w zakresie fizjologicznym przez kilka dni.

13. Degradacja matrycy z nanowłókien

1. Pociąć wysuszone membrany z nanowłókien PCL/keratyny na kwadrat o wymiarach około 30 mm x 30 mm.
2. Próbki o średnicy 900 mm² sterylizować 80% alkoholem przez 10 minut inkubacji i dokładnie umyć wodą demineralizowaną. Próbki inkubować w 15 ml PBS o pH 7,5 w temperaturze 37 °C. Bufor należy wymieniać co 3 dni.
3. Wyjmować membrany z roztworu w określonych odstępach czasu, 1 tydzień i 7 tygodni, i płukać wodą demineralizowaną.
4. Umieścić próbki membrany w ampułkach liofilizatora. Umieść uszczelki na ampułkach i przekręć pokrętło, aby wytworzyć próżnię. Liofilizować przez 24 godziny, aż do całkowitego wyschnięcia.
5. Przymocuj wysuszoną próbkę do stolika SEM za pomocą taśmy miedzianej. Umieść stolik wewnątrz napylarki i pokryj złotem pod ciśnieniem 15 mA przez 1 min i 30 sekund.
6. Załaduj próbkę do komory SEM. Obserwuj próbki włókien przy napięciu przyspieszającym 1,5 kV i prądzie 5 μA.

Wyniki

Morfologia włókien
Dla wszystkich składów włókien wykonano obrazy SEM. Patrz Rycina 3. Obraz włókien potwierdza, że są one zorientowane losowo.

Badania mechaniczne
W różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej zazwyczaj wymagane są włókna o wysokiej wytrzymałości mechanicznej. Włókna te powinny zachować odpowiednią wytrzymałość i elastyczność w określonych warun...

Dyskusja

Udało się wyekstrahować keratynę z ludzkich włosów. Kwas nadoctowy działał jako środek utleniający na ludzkie włosy, umożliwiając ekstrakcję keratyny przez Tris Base. Produkcja keratyny w proszku odbywała się na małą skalę ze względu na fakt, że odbywała się wyłącznie w celach badawczych. Procedura ta została już ustalona w przemyśle dla produkcji na dużą skalę. Celem ekstrakcji keratyny na małą skalę była kontrola zanieczyszczenia, zmienności partii i opłacalności.

Ekstrakcja keratyny jest et...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ludzkie włosy			Uzyskany z lokalnego salonu fryzjerskiego w Greensboro
Kwas nadoctowy	Sigma Aldrich
PCL (polimer e-kaprolaktonu)	Sigma Aldrich	502-44-3	Mn 70-90 kDa
Trifluoroetanol (TFE)	Sigma Aldrich	75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder)	Sigma Aldrich		>99.9% krystaliczny
Kwas solny	Fischer Scientific	A144C-212 Lot 093601	Waltham, MA
Kwik-Sil	World Precision Instruments		Sarasota, FL
Membrana celulozowa	Sigma Aldrich		12 - 14 kDa molekularny mikroskop optyczny odcinający
	Olympus BX51M	BX51M	Japonia
Skaningowy mikroskop elektronowy	Hitachi SU8000	SU8000	Japonia
Maszyna stołowa Shimadzu	Ameryka Północna Przyrządy analityczne i pomiarowe Seria AGS-X	Seria AGS-X	Columbia, lekarz medycyny
Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera	Instrument Bruker Tensor 2		Billerica, MA
		Microcal Origin	Northampton, MA
Dyfrakcja rentgenowska (XRD)	Bruker AXS D8 Advance Dyfraktometr		Madison, WI
Fibroblast 3T3  komórka	Amerykańska kolekcja		Manassas,
zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy VA Dulbecco (DMEM	Invitrogen		Grand Island, NY
Spectra max Gemini XPS czytnik mikropłytek		molekularne	Sunnyvale, Kalifornia
Student - test post hoc Newmana-Keulsa			SigmaPlot 12

Oprogramowanie rentgenowski kultur typu tkanki Urządzenia Oprogramowanie