Przednie nogi i trąbka Drosophila zawierają bogaty repertuar smakowych neuronów czuciowych. W tym artykule przedstawiono metodę wykorzystującą obrazowanie wapnia do pomiaru fizjologicznych odpowiedzi neuronów czuciowych w przedniej nodze i trąbce żywych much po egzogennym zastosowaniu feromonu smakowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych Drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W przeciwieństwie do ssaków, owady takie jak Drosophila mają wiele organów smakowych. Neurony chemosensoryczne na nogach, trąbce, skrzydłach i pokładełku Drosophila wyrażają receptory smakowe1,2, kanały jonowe3-6 i receptory jonotropowe7, które są zaangażowane w wykrywanie lotnych i nielotnych sygnałów czuciowych. Neurony te mają bezpośredni kontakt z degustantami, takimi jak żywność, szkodliwe substancje i feromony, a zatem wpływają na wiele złożonych zachowań, takich jak karmienie, składanie jaj i krycie. Zapisy elektrod i obrazowanie wapnia są szeroko stosowane u owadów w celu ilościowego określenia reakcji neuronalnych wywoływanych przez te degustatory. Jednak elektrofizjologia wymaga specjalistycznego sprzętu, a uzyskanie pomiarów z jednego czujnika smaku może być technicznie trudne w zależności od typu, rozmiaru i położenia ogniwa. Ponadto rozdzielczość pojedynczego neuronu u Drosophila może być trudna do osiągnięcia, ponieważ Taste Sensilla zawiera więcej niż jeden typ neuronów chemosensorycznych. Opisana tutaj metoda obrazowania wapnia na żywo pozwala na pomiar odpowiedzi pojedynczych neuronów smakowych u żywych muszek. Metoda ta jest szczególnie przydatna do obrazowania odpowiedzi neuronalnych na feromony lipidowe i inne typy ligandów, które mają niską rozpuszczalność w rozpuszczalnikach na bazie wody.
Wprowadzenie
Zwierzęta polegają na informacjach węchowych i smakowych, aby pośredniczyć w podejmowaniu decyzji niezbędnych do przetrwania i reprodukcji. Zrozumienie, w jaki sposób sygnały chemosensoryczne są wykrywane i przetwarzane przez układ nerwowy, wymaga identyfikacji receptora (receptorów) czuciowego i odpowiadających im ligandów chemicznych. Drosophila wykrywają oszałamiającą różnorodność lotnych i nielotnych związków i są doskonałym modelem do badania mechanizmów fizjologicznych leżących u podstaw chemosensacji. Podczas gdy narządy węchowe postrzegają lotne cząsteczki, narządy smakowe są wyspecjalizowane w wykrywaniu związków o niskiej lotności. W tym miejscu prz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbek
- Skrzyżuj linię drivera Gal43,22 z muchami UAS-GCaMP5G19 (w1118;P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Hoduj potomstwo w temperaturze 25 °C.
Uwaga: Uzyskanie much z wieloma kopiami transgenów Gal4 lub UAS-GCaMP może pomóc w zwiększeniu intensywności sygnału fluorescencyjnego. Wcześniejsza wersja transgenu UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) wykazywała bardzo słabą intensywność fluorescencji podczas ekspresji pod kontrolą drivera Gr68a-Gal4.- Zbierz i rozdziel według płci nowo wyklute osobniki dorosłe i hoduj je w temperaturze 25 °C.
....
- Zbierz i rozdziel według płci nowo wyklute osobniki dorosłe i hoduj je w temperaturze 25 °C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wskaźnik wapnia GCaMP został wykazany genetycznie przy użyciu driverów Gr68a-Gal4 lub ppk23-Gal4. Każdy driver znakuje odmienne populacje neuronów przedniej nogi oraz nie neuronalnych komórek podporowych (Ryc. 3A-C). Reakcje specyficzne dla ligandu w odpowiedzi na lipofilny feromon CH503 zaobserwowano w komórkach Gr68a-Gal4 i ppk23-Gal4 wykazujących GCaMP (Ryc. 3D). Względna zmiana intensywności fluorescencji sygnału GCaMP5G (ΔF/F)) wzrastała .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisujemy tutaj metodę wykonywania obrazowania wapnia na żywo neuronów obwodowych Drosophila w 2 różnych narządach zmysłów. Wywołane Ca2+ odpowiedzi fluorescencyjne GCaMP w neuronach Gr68a indukowane przez ligand feromonowy CH503 były zależne od dawki i ilościowe. Możliwe było również dostrzeżenie różnych wzorców reakcji neuronalnych, takich jak reakcje fazowe i toniczne.
Uważa się, że neurony wykazujące odpowiedzi fazowe umożliwiają szybką adaptację do ciągłych bodźców. Te.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie ma sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 dla J.Y.Y.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Gr68a-Gal4 | Prezent od H. Amreina (Texas A& M Health Science Center, TX, USA) i J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Prezent od K. Scotta (Uniwersytet Kalifornijski, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila | |
| Szkiełko nakrywkowe Stock Center 0,17 mm (szkiełko nakrywkowe Gold-Seal) | Usługi mikroskopii elektronowej | 63790-10 | |
| Lakier do paznokci, "twardy jak paznokcie czysty" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | ||
| Pędzel | malarski z cienką końcówką | ||
| Taśma | Szkocka marka | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Etanol, klasa laboratoryjna | Merck | 10094 | |
| Heksan, klasa HPLC | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | ||
| Receptura PBST | opisana w sekcji protokołu | ||
| CH503 | Synteza opisana w Mori et al., 2010 | ||
| Kamera sCMOS (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | Mikroskop C11578-22U | |
| (Ti-Eclipse) | Głowica | dyskiem Ni-E Ni-E | |
| Yokogawa | CSU-X1-A1 Aquistion | ||
| Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji | software open source | http://fiji.sc/Fiji |
Bibliografia
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
