Kwantyfikacja zachowania kierowanego zapachem w wysokiej rozdzielczości u Drosophila melanogaster przy użyciu paradygmatu Flywalk

Summary

Automatyczny system śledzenia Flywalk jest używany do wysokorozdzielczego oznaczania ilościowego zachowania kierowanego zapachem u Drosophila melanogaster.

Abstract

W swoim naturalnym środowisku, owady, takie jak mucha octowa Drosophila melanogaster, są bombardowane ogromną ilością chemicznie odrębnych substancji zapachowych. Aby jeszcze bardziej skomplikować sprawę, zapachy wykrywane przez układ nerwowy owadów zwykle nie są pojedynczymi związkami, ale mieszaninami, których skład i proporcje stężeń są różne. Prowadzi to do niemal nieskończonej ilości różnych bodźców węchowych, które muszą być oceniane przez układ nerwowy.

Aby zrozumieć, które aspekty bodźca zapachowego determinują jego ocenę przez muchę, pożądane jest efektywne zbadanie zachowania kierowanego zapachem w stosunku do wielu zapachów i mieszanin zapachowych. Aby bezpośrednio skorelować zachowanie z aktywnością neuronalną, zachowanie powinno być określone ilościowo w porównywalnych ramach czasowych i w identycznych warunkach bodźca, jak w eksperymentach neurofizjologicznych. Jednak wiele obecnie stosowanych testów biologicznych węchu w neuroetologii Drosophila jest raczej wyspecjalizowanych albo w kierunku wydajności, albo w kierunku rozdzielczości.

Flywalk, zautomatyzowany system dostarczania i śledzenia zapachów, wypełnia lukę między wydajnością a rozdzielczością. Pozwala to na dokładne określenie, kiedy pakiet zapachowy stymulował swobodnie chodzącą muchę, a także na określenie dynamicznej reakcji behawioralnej zwierzęcia.

Introduction

Nadrzędnym celem wszelkich badań neuroetologicznych jest ustalenie związku przyczynowego między stanami aktywności pojedynczych neuronów lub obwodów neuronalnych a zachowaniem organizmu. Aby osiągnąć ten cel, aktywność neuronalna i zachowanie powinny być monitorowane w identycznych warunkach bodźca, a te warunki bodźca powinny być idealnie podobne do tych, które wyewoluował badany układ nerwowy, aby nadać sens. Szczególnie jeśli chodzi o behawioralne testy biologiczne, wymagania te historycznie okazały się dość wymagające w neuroetologii węchowej Drosophila melanogaster.

Po uwolnieniu ze źródła, pióropusze zapachu szybko rozpadają się na cienkie włókna, a głównym czynnikiem wpływającym na rozkład zapachu^jest dyfuzja turbulentna spowodowana ruchem powietrza1. W rezultacie owad poruszający się w kierunku źródła zapachu doświadcza przerywanej stymulacji za pomocą pakietów zapachowych przeplatanych zmiennymi odstępami czystego powietrza. Wykazano, że zarówno owady chodzące, jak i latające - w tym Drosophila - wykorzystują ten przerywany reżim stymulacji do nawigacji poprzez gwałtowne działanie wiatru po napotkaniu pióropusza i głównie poruszanie się przy wietrze bocznym przy braku zapachów ^2-5. Podczas gdy procedury stymulacji w eksperymentach fizjologicznych w dużej mierze naśladują te, których owad może doświadczyć w swoim naturalnym środowisku, dostarczając pojedynczych zaciągnięć zapachów przeplatanych przedłużonymi okresami czystego powietrza lub dynamicznych sekwencji stymulacji ^6-11, wiele behawioralnych testów biologicznych stosowanych w neuroetologii Drosophila, takich jak test pułapkowy, areny na otwartym polu lub labirynt T, opiera się na gradientach zapachu^12-15. Ponieważ jednak gradienty zapachów z definicji są zmienne pod względem stężenia w zależności od odległości od źródła zapachu, określonego zachowania nie można przypisać precyzyjnemu stężeniu zapachu przy użyciu tych paradygmatów. Ponadto nachylenie gradientu zapachu zależy krytycznie od właściwości fizykochemicznych nawaniacza. Gradient wysoce lotnego związku będzie płytszy niż ten utworzony przez mniej lotny związek, a zatem również trudniejszy do śledzenia dla organizmu polegającego na pomiarze różnic stężeń w przestrzeni jako jedynym środku nawigacji^16-20, co może prowadzić do błędnej interpretacji preferencji węchowych, szczególnie w testach wyboru. Efekt ten jest również bardzo szkodliwy podczas badania zachowania wobec mieszanin zapachowych, ponieważ prowadzi do różnych proporcji składników mieszanki w każdym punkcie przestrzeni, a zatem ponownie wyklucza wyraźną korelację między fizjologią a zachowaniem.

Podczas gdy muchy octowe mają tendencję do gromadzenia się na fermentujących owocach, są samotne w swojej nawigacji w kierunku źródeł pożywienia i miejsc składania jaj. Niemniej jednak, zamiast testować poszczególne zwierzęta, wiele paradygmatów behawioralnych stosowanych w neuroetologii Drosophila bada zachowanie kohort much sterowane zapachem, a atrakcyjność jest oceniana jako odsetek much wybierających zapach zamiast bodźca kontrolnego. Te eksperymenty kohortowe w znacznym stopniu przyczyniły się do zrozumienia neuroetologii much, a wiele obserwacji poczynionych przy ich użyciu można potwierdzić w eksperymentach na pojedynczych muchach. Zaobserwowano jednak, że muchy mogą wzajemnie wpływać na decyzje²¹ , a w skrajnych przypadkach ocena zapachu może przejść od obojętności do unikania w zależności od gęstości zaludnienia²². Ponadto wyniki tego rodzaju eksperymentów często dostarczają tylko punktu końcowego sekwencji decyzji behawioralnych, a nie obserwują, co mucha robi, gdy to robi, co byłoby pożądane przy próbie skorelowania zachowania z aktywnością neuronalną. Te eksperymenty kohortowe o raczej niskiej rozdzielczości są skontrastowane z metodami pojedynczych lotów o wysokiej rozdzielczości, takimi jak areny lotów na uwięzi i bieżnie, które pozwalają na bezpośrednią obserwację reakcji behawioralnych w momencie prezentacji bodźca^20,23,24. Niemniej jednak eksperymenty kohortowe są nadal popularne, ponieważ są bardzo wydajne i zapewniają solidne wyniki nawet przy porównywalnie niskich rozmiarach prób, ponieważ zmienność międzyosobnicza i międzypróbna jest częściowo uśredniana ze względu na obserwację populacji w dłuższych okresach czasu. Podczas gdy lot na uwięzi i bieżnia prawdopodobnie stanowią złoty standard w zakresie prezentacji bodźców i rozdzielczości czasowej, używane areny są przeznaczone dla pojedynczych zwierząt i dlatego uzyskanie wielkości próby niezbędnej do analizy statystycznej jest czasochłonne. Ostatnio opracowano kilka innych podejść, które umożliwiają efektywne pozyskiwanie danych behawioralnych o wysokiej rozdzielczości w połączeniu z dobrze zdefiniowanym reżimem bodźców. Obejmują one nienadzorowane śledzenie 3D wielu much octowych w tunelu aerodynamicznym w połączeniu z dokładnym modelem 3D pióropusza zapachu⁵, śledzenie wielu pojedynczych much w komorach wyboru zasilanych strumieniami powietrza z obu stron²⁵ oraz paradygmat Flywalk²⁶.

W Flywalk, 15 pojedynczych much znajduje się w małych szklanych rurkach i jest stale monitorowanych przez kamerę nad głową w warunkach czerwonego światła. Zapachy są dodawane do ciągłego strumienia powietrza o prędkości 20 cm/s i przemieszczają się przez szklane rurki ze stałą prędkością. Strumień powietrza jest nawilżany poprzez przepuszczenie go przez butelki o pojemności 250 ml zawierające wodę destylowaną (nawilżacze) przed wejściem do systemu dostarczania zapachów. Pozycje much są rejestrowane w kwadratowym obszarze zainteresowania (ROI) obejmującym większość długości rurek zapachowych (ale z wyłączeniem zewnętrznych krawędzi rurek (około 5 mm z każdej strony), gdzie muchy nie mogą poruszać się dalej z wiatrem lub z wiatrem) w czasie prezentacji zapachu (Rysunek 1A, B). Tożsamości much są utrzymywane na stałym poziomie przez system śledzenia przez cały czas trwania eksperymentu na podstawie ich pozycji Y (tj. limitów szklanej rurki). Stymulacja zapachu odbywa się za pomocą wieloskładnikowego urządzenia stymulacyjnego, które pozwala na prezentację do 8 pojedynczych zapachów i wszystkich możliwych ich mieszanin^26,29 (ryc. 1B). Przebieg eksperymentu jest kontrolowany przez komputer regulujący system dostarczania zapachów oraz zbierający informacje o temperaturze i wilgotności (komputer 1, rysunek 1C). Komputer ten steruje również rejestratorem danych (rozpocznij/zatrzymaj nagrywanie) na drugim komputerze, który w sposób ciągły śledzi pozycje lotu z prędkością 20 klatek na sekundę (komputer 2). Pozycje much, stan zaworu zapachowego (tj. punkt czasowy otwarcia zaworu), identyfikator zapachu, temperatura i wilgotność wokół cykli stymulacji zapachu są rejestrowane na komputerze 2. W ten sposób informacje o zapachu i pozycji muchy są synchronizowane i eksportowane jako pliki .csv, które mogą być dalej przetwarzane i analizowane za pomocą niestandardowych procedur analizy. Ponieważ cały system jest sterowany komputerowo, podczas sesji eksperymentalnej nie jest konieczna interwencja człowieka.

Protocol

Szczegóły budowy i techniczne Flywalk zostały opisane gdzie^{indziej 26} (w przypadku jakichkolwiek problemów z ustanowieniem tej konfiguracji, więcej informacji można uzyskać od MK). W tym miejscu skupiamy się na szczegółowych instrukcjach dotyczących obchodzenia się z paradygmatem, które pomogą uzyskać wiarygodne wyniki.

1. Obsługa muchy

1. Tył leci w kulturach o niskiej i średniej gęstości na pożywce^{spożywczej 27} w reżimie 12 godzin: 12 godzin światło: ciemność w temperaturze 23-25 °C i wilgotności względnej 70%. W tym celu pozwól 20-30 nowo pojawiającym się dorosłym muchom rozmnażać się w dużej fiolce z jedzeniem przez 1 tydzień, a następnie odrzuć dorosłe muchy i poczekaj na pojawienie się potomstwa.
2. Zbierz 30-40 nowo wynurzonych (w wieku <24 godziny) dorosłych much i leżakuj je w nowej fiolce zawierającej pożywkę²⁷ przez 3-5 dni.
3. Dwadzieścia cztery godziny przed rozpoczęciem eksperymentu behawioralnego: Przenieś wszystkie 30-40 wcześniej zebranych much w wieku 3-5 d (patrz 2.2) do nowej fiolki zawierającej wilgotną gumową zatyczkę piankową lub wilgotną bibułkę za pomocą aspiratora.
   UWAGA: Nie znieczulać much za pomocą CO₂ .

2. Przygotowanie konfiguracji Flywalk

1. Używaj butelek o pojemności 250 ml jako nawilżaczy. Napełnij nawilżacze 100 ml wody destylowanej.
2. Przygotować fiolki z zapachami.
   1. Przygotować 500 μl ^10-3 rozcieńczeń czystego zapachu octanu etylu, maślanu etylu, octanu izopentylu i 2,3-butanodionu w rozpuszczalniku oleju mineralnym.
   2. Podłącz dwa kulowe zawory zwrotne na każdą fiolkę zapachu. Należy pamiętać, że zawory zwrotne pozwalają tylko na jednokierunkowy przepływ powietrza. Dlatego zawory zwrotne należy podłączyć w taki sposób, aby powietrze mogło dostać się do fiolki z jednej strony i pozostawić ją po drugiej stronie.
   3. Zdjąć pokrywkę probówki reakcyjnej PCR o pojemności 200 μl. Pobrać pipetę 100 μl każdego rozcieńczenia zapachu do oddzielnej probówki reakcyjnej i umieścić probówki w oddzielnych fiolkach o zapachu. Przygotuj również jedną fiolkę zapachową zawierającą tylko rozpuszczalnik olej mineralny.
   4. Szczelnie zamknij fiolki z zapachem, zamykając je za pomocą zatyczek ze stali nierdzewnej i gumowych uszczelek.
   5. Podłącz 5 fiolek zapachowych (4 zawierające zapachy i 1 zawierającą olej mineralny) do systemu dostarczania zapachów. Upewnij się, że łączysz je we właściwym kierunku przepływu. Niewłaściwe połączenie nie tylko zagrozi planowanemu eksperymentowi, ale może również zanieczyścić system dostarczania.
3. Sprawdź, czy nie ma wycieków, uszczelniając wylot komory mieszania urządzenia stymulacyjnego. Upewnij się, że wszystkie przepływy powietrza przed urządzeniem stymulacyjnym stopniowo spadają teraz do zera. Jeśli nie, sprawdź, czy nie ma wycieków, które można teraz zidentyfikować po syczącym dźwięku powietrza opuszczającego system.
4. Ostrożnie przenieś 15 pojedynczych much do 15 pojedynczych szklanych probówek za pomocą aspiratora i zamknij szklane rurki po obu stronach za pomocą odpowiednich adapterów.
   Uwaga: Ponieważ system musi być hermetycznie zamknięty, aby eksperymenty zakończyły się sukcesem, upewnij się, że adaptery ściśle przylegają do szklanych rurek i pamiętaj, że szklane rurki mogą pęknąć na tym etapie. Uważaj, aby uniknąć obrażeń, nosząc rękawice i okulary ochronne.
5. Podłącz szklane rurki do zestawu Flywalk i od tego momentu odczekaj co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem eksperymentu, aby muchy mogły przyzwyczaić się do nowego środowiska.
6. Po podłączeniu szklanych rurek: sprawdzić odczyt przepływomierzy cyfrowych znajdujących się za nimi na komputerze 1, jeśli 16 przepływów powietrza po szklanych rurkach sumuje się do przepływu powietrza wchodzącego do systemu. Sprawdź również na komputerze 1, czy wilgotność wynosi od 60% do 80%.
7. Zaprojektuj protokół bodźca kontrolujący sekwencję i czas bodźców zapachowych prezentowanych muchom. Aby uzyskać np. opisane dane, należy przedstawić 4 zapachy i kontrolę (olej mineralny) pojedynczo oraz wszystkie możliwe trójskładnikowe i ćwiartkowe mieszaniny zapachów jednocześnie po 40 razy każdy. Ustaw czas trwania impulsu na 500 ms w odstępie między bodźcami wynoszącym 90 sekund i losowo zlosuj sekwencję bodźców.
8. Włączyć źródło światła (klaster LED; λ = 630). Upewnij się, że zapewnisz wystarczającą ilość światła do wydajnego śledzenia bez zwiększania temperatury wewnątrz szklanych rurek.
9. Ustaw obszar zainteresowania systemu śledzenia, przeciągając ramkę w poprzek monitorowanego obszaru w taki sposób, aby uwzględnić wszystkie 15 szklanych rurek i wykluczyć około 5 mm krawędzi rurek.
10. Ustaw 14 równoległych linii separacji między poszczególnymi rurkami w systemie śledzenia, zmieniając ich pozycje Y w odpowiednim skrypcie, aby umożliwić identyfikację poszczególnych much przez cały czas trwania eksperymentu. Upewnij się, że ustawiasz je w taki sposób, aby zawsze była jedna szklana rurka między dwiema takimi liniami oddzielającymi, ponieważ tylko jedna mucha będzie śledzona między dowolnym zestawem dwóch linii.
11. Upewnij się, że ustawiłeś parametry kamery w taki sposób, aby muchy były niezawodnie śledzone w szklanych rurkach. Jeśli muchy zostaną zgubione na krawędziach obszaru zainteresowania, zwiększ jasność lub wzmocnienie oprogramowania śledzącego. Unikaj drgań mechanicznych układu śledzącego. Śledź za pomocą komercyjnego oprogramowania zgodnie z protokołem producenta.
12. Rozpocznij eksperyment od uruchomienia protokołu bodźca. Rejestruj współrzędne XY much z prędkością 20 kl./s (klatek na sekundę) i loguj się w połączeniu ze stanem zaworu zapachowego w plikach tekstowych.

3. Analiza danych

UWAGA: Następujące kroki w analizie danych są zautomatyzowane za pomocą specjalnie napisanych procedur zaprogramowanych w R. Ponieważ kroki te mają kluczowe znaczenie dla uzyskania miarodajnych wyników, analiza zostanie jednak przedstawiona w sposób krok po kroku. Surowe dane do analizy to pliki .csv zawierające zsynchronizowane informacje o stanie zaworu zapachowego, liczbie impulsów w eksperymencie i 15 pozycjach x lotu w cm na wspólnej osi czasu dla jednego cyklu stymulacji zapachu. Niestandardowy kod do analizy danych może być dostarczony na żądanie.

1. Otwórz plik .csv, znajdź punkt czasowy otwarcia zaworu oznaczony zmianą w kolumnie reprezentującej stan zaworu.
2. Obliczać funkcję liniową położenia zapachu formularza
   f(t) = s*t + i
   Gdzie T jest czasem w cyklu stymulacji, S jest prędkością wiatru (tutaj 20 cm/s), a przecięcie I można obliczyć na podstawie punktu czasowego, w którym zapach dostaje się do rur w pozycji 0 (otwarcie zaworu plus opóźnienie).
3. Znajdź punkt czasowy, w którym pozycja x zapachu i muchy przecina się dla każdej muchy i ustaw ten punkt czasu na 0. Uwaga: W ten sposób pozycje muchy są dostosowane do indywidualnego spotkania z zapachem.
4. Wyklucz muchy siedzące na samych obrzeżach obszaru zainteresowania.
5. Oblicz prędkość na podstawie pozycji X, dzieląc przemieszczenie wzdłuż osi x przez przedział czasu (100 ms) i powtórz procedurę dla każdego cyklu stymulacji.
6. Aby uzyskać przebiegi czasowe prędkości, jak pokazano na rysunku 2E, należy obliczyć średnią prędkość i przebieg w czasie dla każdej muchy i zapachu, a na tej podstawie średni przebieg w czasie dla danego zapachu.
7. Aby uzyskać przemieszczenie netto, jak pokazano na rysunku 3C, należy obliczyć przemieszczenie netto w ciągu 4 sekund po impulsie zapachu dla każdego zdarzenia śledzenia, a następnie średnie przemieszczenie netto na muchę i zapach.

4. Procedura czyszczenia

1. Czyste szklane rurki
   1. Usuń muchy i adaptery ze szklanych rurek i namocz szklane rurki w detergencie.
   2. Opłucz szklane rurki pod bieżącą wodą destylowaną i wysusz je sprężonym powietrzem.
   3. Podgrzewać szklane rurki w temperaturze 200 °C przez 8 godzin.
2. System dostarczania czystych zapachów
   1. Usuń wszystkie fiolki i rurki zapachowe z centralnej komory mieszania.
   2. Wyjmij adaptery przewodów z komory mieszania.
   3. Wyczyść komorę mieszania, przepłukując ją laboratoryjnym roztworem czyszczącym i rozpuszczalnikami (np. etanolem, acetonem). Wykonaj te czynności pod maską laboratoryjną.
   4. Osuszyć komorę mieszania za pomocą sprężonego powietrza i podgrzewać ją w temperaturze 200 °C przez 8 godzin.
3. Wyczyść fiolki zapachowe i zawory zwrotne
   1. Wyjmij stalową zatyczkę (wyrzuć gumową uszczelkę) i zawory zwrotne z fiolek zapachowych i zanurz wszystkie elementy w laboratoryjnym roztworze czyszczącym.
   2. Poddaj je sonizacji składników w kąpieli ultradźwiękowej i przepłucz je wodą destylowaną.
   3. Wyczyść wszystkie elementy z wyjątkiem zaworów zwrotnych etanolem i acetonem. Wykonaj te czynności pod maską laboratoryjną.
   4. Wysuszyć elementy za pomocą sprężonego powietrza i podgrzewać je w temperaturze 200 °C przez 8 godzin.
   5. Wyczyść zawory zwrotne od wewnątrz, przepłukując je etanolem i acetonem za pomocą strzykawki (należy wziąć pod uwagę kierunek przepływu). Wykonaj te czynności pod kapturem laboratoryjnym, nosząc okulary laboratoryjne. Ponieważ aceton atakuje części gumowe, należy natychmiast osuszyć zawory zwrotne, przepłukując je sprężonym powietrzem.
   6. Usuń resztki zapachów, pulsując powietrzem przez zawory zwrotne przez kilka dni. Na tym etapie czyszczenia należy użyć inkubatora w temperaturze 60 °C i 1 sekundy włączenia powietrza / 1 sekundy wyłączenia powietrza.

Results

Ponieważ muchy mogą swobodnie rozprzestrzeniać się w swoich szklanych rurkach między impulsami zapachu, a impuls zapachu przemieszcza się przez szklane rurki ze stałą prędkością, muchy napotykają zapach w różnym czasie, w zależności od ich pozycji x w czasie stymulacji. W rezultacie, początek trajektorii pod wiatr wywołany impulsem o długości 500 ms atrakcyjnego rozcieńczenia octanu etylu w proporcji ^10-3 jest opóźniony o około 1 sekundę w przypadku much na końcu ich szklanych rurek z wiatrem w porównaniu z mu...

Discussion

Chociaż na pierwszy rzut oka system Flywalk wydaje się dość wyrafinowany, po skonfigurowaniu i uruchomieniu jest łatwy w użyciu i daje bardzo solidne wyniki. Aby podkreślić spójność wyników uzyskanych za pomocą testu biologicznego, można powiedzieć, że przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki zostały uzyskane prawie 2 lata po niektórych wynikach pokazanych w poprzednim badaniu²⁹ ze zmodyfikowaną konfiguracją przy użyciu nowego oprogramowania śledzącego i źródła światła. Niemniej jednak odpowiedzi atraktantow...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Konfiguracja Flywalk	Niestandardowe		szczegóły dostępne na żądanie
urządzenie stymulujące	Niestandardowe		szczegóły dostępne na żądanie
Klaster LED	Niestandardowe		szczegóły dostępne na żądanie
Kamera internetowa HD Pro C920	Logitech, Lozanna, Szwajcaria
2 Komputery
Flywalk Ponownie załadowane oprogramowanie v1.0	Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Oprogramowanie Labview 11.0	National Instruments, Austin, Teksas
Standardowy pokarm dla much	Niestandardowe
standardowe fiolki na muchy	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Niemcy
Standardowe fiolki na muchy	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Niemcy
aspirator	Niestandardowe
olej mineralny	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
zapachy	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
200 µ l Probówki reakcyjne PCR	Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Niemcy