RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/<em>Aspergillus</em> Pathosystem

Ren&#233;e S. Arias; Phat M. Dang; Victor S. Sobolev

doi:10.3791/53398

Research Article

Kontrola aflatoksyn w orzeszkach ziemnych za pośrednictwem RNAi: metoda analizy produkcji mikotoksyn i ekspresji transgenów w patosystemie orzeszków ziemnych/aspergillus

DOI: 10.3791/53398

December 21, 2015

Renée S. Arias¹, Phat M. Dang¹, Victor S. Sobolev¹

¹National Peanut Research Laboratory,United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service

Cite Watch Download PDF Download Material list

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

Pokazujemy metodę analizy aflatoksyn i ekspresji transgenów w nasionach orzeszków ziemnych, które zawierają sygnały interferencji RNA do wyciszania genów syntezy aflatoksyn u grzyba Aspergillus flavus. Kontrola mikotoksyn w roślinach za pośrednictwem RNAi nie została wcześniej zgłoszona.

Abstract

Organizacja Narodów Zjednoczonych ds. Wyżywienia i Rolnictwa szacuje, że 25% upraw żywności na świecie jest skażonych aflatoksynami. Oznacza to, że każdego roku 100 milionów ton żywności jest niszczonych lub kierowanych do spożycia przez ludzi innych niż ludzie. Aflatoksyny są silnymi czynnikami rakotwórczymi normalnie gromadzonymi przez grzyby Aspergillus flavus i A. parasiticus w zbożach, orzechach, roślinach okopowych i innych produktach rolnych. Wyciszenie pięciu genów syntezy aflatoksyny przez interferencję RNA (RNAi) w roślinach orzeszków ziemnych wykorzystano do kontrolowania akumulacji aflatoksyny po inokulacji A. flavus. Wcześniej nie istniała żadna metoda analizy skuteczności RNAi w indywidualnych zdarzeniach transgenicznych orzeszków ziemnych, ponieważ zwykle dają one niewiele nasion, a tradycyjne metody dużych eksperymentów polowych w warunkach sprzyjających aflatoksynom nie były opcją. Na polu prawdopodobieństwo znalezienia naturalnie zanieczyszczonych nasion wynosi często od 1/100 do 1/1000. Ponadto zanieczyszczenie aflatoksynami nie jest równomiernie rozłożone. Nasza metoda wykorzystuje kilka nasion na zdarzenie transgeniczne, z małymi cząstkami przetworzonymi do PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (RT-PCR) lub sekwencjonowania małego RNA oraz do analizy akumulacji aflatoksyn za pomocą ultra-sprawnej chromatografii cieczowej (UPLC). Linie orzeszków ziemnych 288-72 i 288-74 wykazujące ekspresję RNAi wykazały do 100% redukcji (p≤0,01) aflatoksyny B₁ i B₂ w porównaniu z kontrolą, która zgromadziła do 14 000 ng^.^g-1 aflatoksyny_B1po zaszczepieniu aflatoksyną A. flavus. Dla porównania, maksymalna całkowita ilość aflatoksyn dopuszczona do spożycia przez ludzi w Stanach Zjednoczonych wynosi 20 ng^.^G-1. Protokół ten opisuje zastosowanie kontroli aflatoksyn za pośrednictwem RNAi w transgenicznych nasionach orzeszków ziemnych oraz metody jej oceny. Wierzymy, że jego zastosowanie w hodowli orzeszków ziemnych i innych roślin uprawnych przyniesie szybki postęp w tej ważnej dziedzinie nauki, medycyny i żywienia człowieka oraz znacząco przyczyni się do międzynarodowych wysiłków na rzecz kontroli aflatoksyn i potencjalnie innych mikotoksyn w głównych uprawach spożywczych.

Introduction

Około 4,5 miliarda ludzi jest chronicznie narażonych na aflatoksyny ¹, najpotężniejsze czynniki rakotwórcze znane w przyrodzie ². Te mikotoksyny zanieczyszczają 25% upraw spożywczych na świecie ³ , w tym kukurydzę, maniok, ryż, orzechy, zboża i przyprawy. ⁴. Aflatoksyny powodują zahamowanie wzrostu u dzieci ⁵, upośledzają układ odpornościowy ⁶, są obecne w 58% raków wątrobowokomórkowych w biopsjach u ludzi ^7,8 i zabijają setki ludzi podczas okresowych wybuchów aflatoksykozy ^9,10. Aflatoksyny to mikotoksyny pochodzące z poliketydów, normalnie wytwarzane przez Aspergillus flavus i A. parasiticus; aflatoksyny B₁ i B₂ są wytwarzane przez A. flavus, podczas gdy A. parasiticus wytwarza również G₁ i G₂. Strukturę chemiczną tych związków oraz chromatogram przedstawiający ich rozdzielenie przez UPLC przedstawiono na rysunku 1.

Rysunek 1. Aflatoksyny i wstawka RNAi. U góry: struktura chemiczna (po lewej) i przykład chromatogramu (po prawej) czterech najpowszechniejszych aflatoksyn pochodzących z poliketydów: B₁, B₂, G₁ i G₂, wytwarzanych przez Aspergillus parasiticus, A. flavus wytwarza B₁ i B₂. U dołu: Schemat fragmentów genów w konstrukcie RNAi p5XCAPD używanym do transformacji orzeszków ziemnych, liczby pod strzałkami to numery dostępu do fragmentów genu w genomie Aspergillus flavus; PIV2: intron ziemniaczany; bp: pary zasad; RT_5X_1 i RT_5X_2: Miejsca starterów PCR w czasie rzeczywistym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Straty ekonomiczne w eksporcie z powodu aflatoksyn w samych orzeszkach ziemnych przekraczają 450 milionów dolarów amerykańskich, jeśli są obliczane na podstawie 4 ng^.Limit ^g-1 aflatoksyny dopuszczonej do spożycia przez ludzi w Unii Europejskiej ¹¹. Aflatoksyny są znane od 60 lat ¹²; Jednakże, mimo że opracowano wiele praktyk rolniczych w celu złagodzenia ich skutków, w tym stosowanie innych szczepów grzybów ^13,14, nie istnieje spójna metoda zwalczania, a odporne odmiany roślin nie są dostępne. Badanie plazmy rozrodczej roślin pod kątem odporności na aflatoksyny jest szczególnie trudne, ponieważ nawet w warunkach sprzyjających inwazji patogenów akumulacja mikotoksyn jest nieprzewidywalna i nie przebiega zgodnie z normalnym rozkładem. W związku z tym eksperymenty zwykle wymagają dużych obszarów sadzenia, setek nasion i wielu próbek o wadze 100-1700 g, aby zmniejszyć zmienność danych ^15,16.

Interferencja RNA została odkryta w 1998 roku ¹⁷; a korzyści z "wyciszania" są obecnie badane w wielu nowych zastosowaniach, np. w terapiach dla ludzi przeciwko przerzutowemu rakowi piersi ¹⁸, rakowi wątroby ¹⁹, białaczce szpikowej ²⁰ oraz w ochronie roślin przed owadami ²¹ i nicieniami ²². W roślinach sygnały interferencyjne RNA mogą przemieszczać się z komórki do komórki, przy czym małe interferujące RNA (siRNA) i RNA o dużej masie cząsteczkowej są odpowiedzialne za ogólnoustrojowe potranskrypcyjne wyciszanie genów ^23,24, nawet wewnątrz patogenów grzybowych, które są w bliskim kontakcie z gospodarzem roślinnym ²⁵. Skuteczność RNAi w wyciszaniu genów grzybów i patogenów za pośrednictwem roślin została opisana w kilku patosystemach roślinnych, dla których wizualne badanie objawów w nadziemnych częściach roślin (liściach) umożliwiło kwantyfikację choroby, tj. Lęgniowce Bremia w sałacie ²⁶, Puccinia w pszenicy ²⁷ i Fusarium w bananie ²⁸. Znacznie trudniej jest ocenić skuteczność RNAi w zwalczaniu mikotoksyn w roślinach, szczególnie aflatoksyn w orzeszkach ziemnych, ponieważ liście nie wykazują objawów infekcji, zaatakowane organy (nasiona) znajdują się pod kilkucentymetrową warstwą gleby, wystąpienie infekcji jest nieprzewidywalne i tylko analiza chemiczna może określić obecność aflatoksyn. Ponadto każde zdarzenie transgeniczne w orzeszkach ziemnych zwykle wytwarza niewiele nasion (4-6 na roślinę); W związku z tym tradycyjne testy na cechę akumulacji aflatoksyn na dużych poletkach polowych, trwające całe sezony upraw i przy użyciu setek nasion nie są wykonalne. Opisano tutaj metodę analizy w czasie krótszym niż jeden tydzień nasion orzeszków ziemnych RNAi pod kątem obecności transgenu i cechy akumulacji bez aflatoksyn, przy użyciu tylko kilku nasion.

Protocol

1. Konstrukt molekularny i transformacja orzeszków ziemnych

Połącz fragmenty DNA pięciu genów A. flavus, AFL2G_07223 (aflS lub aflJ), AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07228 (aflC/pksA/pksL1), AFL2G_07731 (pes1) i AFL2G_05027 (pompa wypływu aflatoksyny, aflep). W tym celu należy użyć następujących starterów i ultramerów: DIR-1, Short-Dir1-R, DIR-2-inverted, Short-Dir2-R, DirAll-Nco-Rv i DirAll-BamEco-Fw, Tabela 1.
1. Wykonać podwójną nić DIR-1 w 5 cyklach PCR (reakcja 25 μl; 95 °C 2 min, a następnie 5 cykli 94 °C 45 sekund, 55 °C 30 sekund, 68 °C 15 sekund) przy użyciu polimerazy DNA zgodnie z instrukcjami producenta i starterem Short-Dir1-R, aby pozostawić 3' zwis CCCGT. Powtórz te kroki, aby wykonać odwróconą podwójną nić DIR-2 za pomocą startera Short-Dir2-R, aby pozostawić 3-calowy zwis ACGGG komplementarny do DIR-1.
2. Zliżuj dwa fragmenty 199 pz za pomocą ligazy DNA T4 zgodnie z instrukcjami producenta. PCR amplifikować otrzymany fragment o długości 393 pz, jak wskazano w 1.1.1, używając starterów DirAll-cacc-Fw i DirAll-Nco-Rv (Tabela 1), a następnie sklonować produkt przy użyciu standardowych technik do pENTR1A w celu wytworzenia plazmidu p2 + 4ENTR.
3. Rekombinuj p2 + 4ENTR w pCAPD ²⁹ (akcesja NCBI: KC176455.1) przy użyciu mieszanki enzymów LR klonazy II zgodnie z instrukcjami producenta w celu wytworzenia plazmidu p5XCAPD i przekształć go w Escherichia coli DH5α przy użyciu standardowych technik, a następnie częściowego sekwencjonowania. Uwaga: Pełna wstawka RNAi jest pokazana w tabeli 1.
Przekształć szczep Agrobacterium C58C1 ³⁰ za pomocą plazmidu p5XCAPD, jak wcześniej zgłoszono³⁰, i użyj powstałej bakterii do przekształcenia roślin orzeszków ziemnych w następujący sposób:
1. Hoduj w temperaturze 30 °C Agrobacterium zawierające p5XCAPD, użyj do tego 50 ml bulionu LB uzupełnionego 500 μg ^ml-1 streptomycyny, 25 μg ^ml-1 gentamycyny, 10 μg ^ml-1 kanamycyny i wstrząśnij kulturą z prędkością 250 obr./min, aż osiągniesz 1 OD₂₆₀.
2. Zebrać komórki Agrobacterium przez odwirowanie (6 000 x g) przez 10 minut, ponownie zawiesić w 50 ml AB minimalnej ^{pożywce 31} ze 100 μM acetosyringonem na 1 godzinę i umieścić w zawiesinie bakteryjnej eksplantaty z 10-14-dniowych siewek Exp27-1516, linii hodowli orzeszków ziemnych typu rozłogowego. Po 30 minutach osuszyć eksplantaty na bibule 3MM i umieścić je na pożywce do indukcji pędów (SIM) [sól MS ³², 3% sacharozy, 20 μM benzyloaminopuryna (BAP), 10 μM tidiazuron (TDZ), pH 5,8, 0,3% gumy gellan] bez antybiotyków w ciemności przez trzy dni.
3. Wykonaj selekcję i regenerację tkanek zgodnie z raportem z dnia ³³. Przenieś tkanki do SIM (500 μM cefotaksym i 100 μM kanamycyna) w celu utworzenia pędów, z transferami co dwa tygodnie przez 2 miesiące. Następnie umieszczać pędy rozprężne na pożywce wydłużającej pędy (SEM) [5 μM BAP, 1 μM kwasu giberelinowego (GA₃)], co dwa tygodnie przez kilka miesięcy.
4. Umieść pojedyncze pędy o wielkości 2 cm w podłożu do indukcji korzeni (RIM) [1/2 MS, 1,5% sacharozy, 5 μM kwasu α-naftalenooctowego (NAA), 2,5 μM kwasu indolowo-masłowego (IBA)], a następnie zaaklimatyzuj sadzonki i przenieś je do szklarni.

2. Identyfikacja roślin orzeszków ziemnych zawierających RNAi w celu wyciszenia genów syntezy aflatoksyn

Użyj mini zestawu roślinnego w stacji roboczej robota z 200 μl elucji zgodnie z instrukcjami producenta, aby wyekstrahować DNA z młodych liści roślin orzeszków ziemnych, które zostały poddane procesowi transformacji (jak opisano wcześniej) za pomocą konstruktu RNAi p5XCAPD (Figura 1), który ma jako szkielet plazmid pCAPD ²⁹ do wyciszania genów.
Przebadaj próbki DNA za pomocą PCR zagnieżdżonego w jednej probówce (STN-PCR), jak opisano wcześniej ³⁴, aby wykryć wybieralny marker NPTII i wstawkę RNAi z p5XCAPD. Rozmnażaj klonalnie z kawałków (3-4 węzły) roślin z dodatnim wynikiem PCR, aby wyprodukować wystarczającą ilość nasion do testowania w tym pierwszym pokoleniu.
1. Stosować cztery 2-krotne rozcieńczenia DNA (50-100 ng ^μl-1 przed rozcieńczeniem) we wszystkich reakcjach STN-PCR. W przypadku NPTII należy stosować zewnętrzne startery PCAPD 5714F: 5'-AGGCTATTCGGCTATGACTG-3' i PCAPD 6446R: 5'-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3' oraz wewnętrzne startery PCAPD 5730F: 5'-ACTGGGCACAACAGACAATC-3' i PCAPD 6249R: 5'-ATATTCGGCAAGCAGGCATC-3'.
2. Do wykrywania insertu RNAi w reakcjach STN-PCR należy stosować startery zewnętrzne 35S-PDSFw: 5'-CCTAACAGAACTCGCCGTAA-3' i DirAll-Nco-Rv: 5'-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3', oraz startery wewnętrzne Probe_5027_Fw: 5'-gtatttgtgaccatgtttctg-3' i Probe_7228_Rv: 5'-GGACGGATAGTAAACTGCGG-3'.
Zbierać strąki orzeszków ziemnych z roślin z dodatnim wynikiem testu STN-PCR oraz z roślin kontrolnych uprawianych w tych samych warunkach. KROK KRYTYCZNY: Upewnij się, że rośliny kontrolne są uprawiane w tych samych warunkach i w tej samej porze roku, co rośliny RNAi. Wydmuchaj strąki wodą myjką ciśnieniową o niskiej intensywności lub zeskrob je ręcznie, aby usunąć egzokarp, określ kolor mezokarpu, umieszczając strąki na tablicy do dojrzewania i oddziel strąki w grupy (żółte, pomarańczowe, brązowe i czarne) ³⁵ (ryc. 2).

Rysunek 2. Przygotowanie strąków orzeszków ziemnych do analizy. Po lewej: Różne rozmiary orzeszków ziemnych spotykane podczas zbiorów, ponieważ orzeszki ziemne są rośliną o nieokreślonym wzroście; Środek: umieszczanie orzeszków ziemnych w metalowym koszu w celu usunięcia egzokarpu pod ciśnieniem wody; Po prawej: grupy dojrzałości według koloru mezokarpu na tablicy o profilu orzecha ziemnego (żółty, pomarańczowy, brązowy i). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Konfiguracja eksperymentalna

Usuń łuski, oddzielnie przetwarzaj żółte i brązowe nasiona. Oblicz liczbę nasion do wykorzystania w doświadczeniu zgodnie z tabelą 2. Należy zauważyć, że co najmniej trzy kawałki nasion (1 kawałek nasion = pół liścienia) na linię orzeszków ziemnych i datę pobierania próbek są wymagane do przeprowadzenia analizy statystycznej i zmniejszenia błędu standardowego.

Nazwa Sekwencja DIR-1 5'-
GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGGGTGTGCT
CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCGTATTTG
TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTCATCTCTCTACAGCC
ATTCCCCAGATCACGGACGAATCCCCTGCATCTACGCGCCGCATC
ACTTGGGGTACCCGT-3' Krótki-Kierunek1-R 5'-Phos-TACCCCAAGTGATGCGTGCGCG-3' DIR-2-odwrócony 5'- GGTTATTGGGTGCAGAATGGTAAACCACCCAACAGTACGCGAAATG
TCAATTCCAGAGTCCCAAACCTCCCTACCGTGGTGGACGGATAG
TAAACTGCGGAGCTTGGGAACAAAATCCGCTGTCTGATCGCCGAAG
AGAAAGAGTTGCCTTGATTGAGCCGCATCGAGGACAGGTTGTGTTG
CTGTTGATAGACGGG-3' Krótki-Kierunek2-R 5'-Phos-CTATCAACAGCAACACAACC-3' DirAll-cacc-Fw 5'-CACCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3' DirAll-Nco-Rv 5'-ATGCCATGGGGTTATTGGGCAGAATGG-3' DirAll-BamEco-fw 5'-ATGGGATCCGAATTCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3' Kompletna wstawka RNAi 5'- GCCAGCTCAAAAGTGGATGCACCAAGGAGAAACCGGGGTGTGCT
CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTC/GTATTTG
TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTCATCTCTCTACAGCC
ATTCCCCAGATCACGGACGAAT/CCCCTGCATCTACGCCCGCAT
CACTTGGGGTACCCGTCTATCAACAGCAACACAACCTGTCCTCGAT
GCG/GCTCAATCAAGGCAACTTTCTCTTCGGCGATCAGACAGCG
GATTTTTTTTTCCCCAAGCTCCGCAGTTTACTATCCGTCCA/GGCCACGG
TAGGGAGGTTTGGGACTCTGGAATTGACATTTCGCGTACTGTTGGG
TGGTTTACCATTCTGCACCCAATAACC-3'

Tabela 1. Oligonukleotydy i ultramery używane do budowy RNAi konstruują p5XCAPD. Phos: fosforylowany koniec 5'; "/" oddziela pięć użytych fragmentów genu; Pełna wstawka RNAi: sekwencja używana jako 2 odwrócone powtórzenia w celu utworzenia p5XCAPD.

Umieść całe nasiona orzeszków ziemnych w jednej warstwie, tak aby pokryły dno sterylnej zlewki. Dodaj 75% roztwór etanolu/wody (v/v), aby przykryć nasiona, a następnie dodaj równą objętość tego samego roztworu. Inkubować w temperaturze otoczenia przez 30 sekund, a następnie spłukać sterylną wodą dejonizowaną (SDW).
Dodać 2% podchlorynu do zlewki zawierającej nasiona poddane działaniu etanolu w następujący sposób: dodać tyle 2% roztworu podchlorynu, aby przykryć nasiona, następnie dodać równą objętość tego samego roztworu i inkubować przez 5 minut. ETAP KRYTYCZNY: Dokładnie spłukać trzy razy objętością SDW równą 5-krotnej objętości użytego podchlorynu (Rysunek 3).

Rysunek 3. Konfiguracja eksperymentalna. Góra: Sterylizacja powierzchniowa nasion orzeszków ziemnych przed i po podchlorynie, usuwanie okrywy nasiennej (testa); Środek: usunięcie zarodka i bliskie przyjrzenie się zarodkowi, a następnie przecięcie liścienia na pół; Na dole: połówki liścieni w sterylnej wodzie destylowanej, osuszanie na sterylnym bibule chłonnym, wgniecenia na agarze wodnym i umieszczanie połówek liścieni (przeciętą stroną do góry) na powierzchni agaru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Pozostaw wysterylizowane powierzchniowo nasiona do wchłonięcia zanurzone w SDW na 2 godziny. Umieść nasiona na sterylnej szalce Petriego, usuń okrywy nasienne kleszczami, oddziel liścienie i za pomocą skalpela usuń zarodki. Uwaga: Zarodki można wyrzucić lub wykorzystać do regeneracji nowych roślin.
Przetnij każdy lień na pół za pomocą skalpela. Aby uniknąć odwodnienia, trzymaj pokrojone kawałki nasion w sterylnej wodzie, aż wszystkie nasiona zostaną przetworzone.
Przygotować szalki Petriego zawierające sterylny agar wodny (1,5% agaru/wody; w/v), po jednej na każde trzy kawałki nasion. Wykonaj małe wgniecenia w agarze za pomocą kleszczyków, krótko osusz nadmiar wody z kawałków nasion na sterylnych ręcznikach papierowych, a następnie umieść kawałki nasion (przycięte do góry) na płytkach z wodą/agarem.
Ze świeżej kultury aflatoksynennej Aspergillus flavus NRRL 3357 w pożywce agarowej Czapek uprawianej w temperaturze 25 °C przez 10 dni przygotować zawiesinę 50 000 zarodników na μl SDW, policzoną za pomocą hemocytometru.
Umieść 2 μl zawiesiny zarodników na przeciętych powierzchniach każdego połówki liścienia, unikając spływania po bokach, aby upewnić się, że zarodniki zostaną wystawione na działanie tkanki nasiennej, która zawiera RNAi (ryc. 4).

Rysunek 4. Inokulacja i inkubacja do analizy aflatoksyn. U góry: Pół liścienia, inokulacja zawiesiną zarodników i wzrost grzybni Aspergillus flavus na połowie liścienia po 24 godzinach inkubacji. Na dole: po lewej: inkubacja 48 godzin na 1,5% agarze ; Centrum: inkubacja przez 72 godziny na 1,5% agarze ; Po prawej: Przykład nieprawidłowej konfiguracji eksperymentalnej, inkubacja przez 72 godziny na 0,5% agarze Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Inkubować szalki Petriego zawierające zaszczepione i niezaszczepione połówki liścieni w temperaturze 30 °C w ciemności do momentu pobrania próbek.

4. Pobieranie próbek do analizy aflatoksyn i ekspresji genów

Próbki należy pobrać trzykrotnie po 24, 48 i 72 godzinach (opcjonalnie 96 godzinach) inkubacji, zarówno do analizy RT-PCR, jak i do analizy aflatoksyny, przy czym każda kontrpróba składa się z jednej części (połowy liścienia). Próbki należy pobierać losowo z różnych płytek w każdym dniu pobierania próbek. Za pomocą chusteczki delikatnie usuń agar i nadmiar zarodników grzybów przed umieszczeniem kawałków nasion w fiolkach lub probówkach.
W celu analizy aflatoksyn należy umieścić każdą kontrpróbę (jedną część) w szklanej fiolce z nakrętką o pojemności 4 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Uwaga: Biorąc pod uwagę stabilność chemiczną aflatoksyn, próbki mogą być przechowywane w tym stanie przez kilka miesięcy (w obecnych doświadczeniach zwykle 1-2 miesiące).
W przypadku RT-PCR umieścić każdą replikę (jedną sztukę) w już przygotowanych probówkach do mielenia o pojemności 2 ml zawierających dwa koraliki ze stali nierdzewnej (o średnicy 2,5 mm) i trzy kulki cyrkonowe (o średnicy 2 mm).
Natychmiast zamrozić (najlepiej w ciekłym azocie) wszystkie próbki i przechowywać je w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia.

5. Analiza aflatoksyn w poszczególnych cząstkach półliścienia

Do tej analizy należy użyć próbek zaszczepionych A. flavus. Doprowadź próbki do temperatury otoczenia przez około 30 minut, dodaj cztery objętości (zwykle 2-3 ml; w/v) metanolu (zachowaj zapis do późniejszych obliczeń), zamknij nakrętki i inkubuj O/N (~16 godzin) w ciemności bez mieszania.
Umieścić frytę w pasującej minikolumnie propylenowej o pojemności 1,5 ml, dodać 200 mg zasadowego Al₂_O3 i przykryć kolejną frytą, jak opisano poprzednio ³⁶; następnie umieścić fiolkę z automatycznym podajnikiem próbek o ultra wysokiej wydajności do produkcji płynów chomatografów (UPLC) pod kolumną wystarczająco blisko, aby uniknąć możliwego odparowania eluatu.
W jednorazowej szklanej probówce (nie używać plastiku) umieścić 0,5 ml ekstraktu metanolowego otrzymanego w kroku 4.1, dodać 0,5 ml acetonitrylu, wymieszać pipetą i nanieść 0,5 ml mieszaniny do kolumny przygotowanej w kroku 4.2. Pozwolić na grawitacyjną elucję do fiolki z automatycznym samplerem (nie wywierać nacisku). Elucja trwa zwykle 2-4 minuty, natychmiast zamknij fiolkę za pomocą nakrętki kompatybilnej z UPLC z przegrodami. Przechowywać fiolki w temperaturze otoczenia i analizować je tego samego dnia na UPLC.
W celu oddzielenia aflatoksyn należy umieścić fiolki z autosamplerem zawierające eluaty próbek i fiolki z autosamplerem z wzorcami aflatoksyn (B₁ i B₂ w przypadku stosowania A. flavus) w przyrządzie UPLC wyposażonym w pasujący menedżer rozpuszczalników czwartorzędowych UPLC, menedżer próbek UPLC, detektor fluorescencyjny UPLC i kolumnę C₁₈ 2,1 mm x 50 mm, 1,7 μm.
1. Użyć izokratycznej fazy ruchomej złożonej z mieszaniny woda/MeOH/_CH3CN (64:23:13, v/v/v) o natężeniu przepływu 0,30 ml ^min-1. Otrzymać chromatogramy zapewniające ustabilizowaną separację linii podstawowej w celu dokładnego obliczenia stężenia aflatoksyny, zgodnie z instrukcjami producenta ³⁷.
2. Potwierdzić tożsamość aflatoksyn, uzyskując ich dane spektralne mas i porównując je z danymi opublikowanymi ³⁸. Należy użyć spektrometru masowego z pułapką jonową wyposażonego w interfejs ESI i odpowiednie oprogramowanie zgodnie z instrukcjami producenta.
Oznaczyć stężenia aflatoksyn przez odniesienie do krzywych kalibracyjnych otrzymanych przez wstrzyknięcie różnych ilości odpowiednich wzorców handlowych aflatoksyn B₁, B₂, G₁ i G₂, zgodnie z sugestią producenta UPLC i oznaczeniem w oprogramowaniu ³⁷.
Umieść kawałki nasion już wyekstrahowane metanolem w indywidualnych szklanych fiolkach do liofilizacji O/N (~16 godzin) w celu określenia ich suchej masy. Następnie oblicz stężenie aflatoksyny w ng^.^g-1 suchej masy części materiału siewnego.
W celu analizy danych należy przekonwertować wyniki aflatoksyny na logarytm (ng^.^g-1 +1), po którym następuje test Tukeya dla porównań średnich.

6. Ekspresja genów, przetwarzanie próbek metodą RT-PCR

Pobrać probówki mielące o pojemności 2 ml zawierające próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C i natychmiast (bez rozmrażania) zmielić je w homogenizatorze w młynku perełkowym z prędkością 3 100 obr./min przez 40 sekund, a następnie przystąpić do ekstrakcji RNA za pomocą Trizolu zgodnie z instrukcjami producenta.
Przygotuj cDNA z każdej próbki, używając 1 μg RNA i równych ilości oligo dT i losowych heksamerów, rozcieńczyć cDNA w stosunku 1:8 i użyć 2 μl na reakcję w RT-PCR (jak opisano wcześniej ³⁹).
1. Do wykrywania ekspresji wstawki RNAi należy stosować startery: RT_5X_1_105F: 5'GGTGGCATTGGACCGTCTTG-3', RT_5X_1_232R: 5'-CGCATCGAGGACAGGTTGTG-3'; oraz RT_5X_2_95F: 5'-CCATGTTTCTGGTGGCATTG-3', RT_5X_2_229R: 5'-ATCGAGGACAGGTTGTGTTG-3'.
2. Do wykrywania ekspresji selektywnego markera NPTII należy użyć starterów: RT_NPTII_1_6871F: 5'-CTCGCTCGATGCGATGTTTC-3', RT_NPTII_1_7004R: 5'-GCAGGATCTCTTGTCATCTC-3'. Do standaryzacji należy użyć genu porządkowego Actin i starterów: Actin-Fw: CACATGCCATCCTTCGATTG; Actin-Rv: CCAAGGCAACATATGCAAGCT ⁴⁰.
Analizuj wyniki metodą Delta-delta CT ⁴¹ znormalizowaną dla ekspresji aktyny. Przedstaw wyniki jako zwiększenie krotności w stosunku do kontrolki.

Representative Results

Plazmid p5XCAPD został stworzony jako pochodna pCAPD 29 i używany do przekształcania roślin orzeszków ziemnych; ten wektor przenosi odwrócone powtórzenia pięciu małych fragmentów, 70-80 pz każdy, genów syntezy aflatoksyny A. flavus oddzielonych intronem (Rysunek 1). Do budowy wykorzystano fragmenty AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07223 (aflS lub aflJ), AFL2G_05027 (pompa wypływu aflatoksyny), AFL2G_07228 (aflC/pksA/pksL1) i AFL2G_07731 (pes1), numery na rysunku 1 odpowiadają adnotacji genomu A. flavus w BROAD Institute, Cambridge, MA, oraz w literaturze 42. W sumie 99 linii orzeszków ziemnych zostało zregenerowanych po przejściu przez proces transformacji, 50 było PCR dodatnich na NPTII wykrytych przez STN-PCR, a 33 linie były dodatnie PCR i wyprodukowały nasiona. Tylko siedem dodatnich linii PCR zostało klonalnie rozmnożonych i przetestowanych niniejszą metodą pod kątem akumulacji aflatoksyny, wszystkie siedem wykazało od 60% do 100% mniej akumulacji aflatoksyny niż kontrola. Tutaj pokazujemy wyniki dwóch z tych siedmiu linii. Ponieważ poszczególne zdarzenia transgeniczne zwykle wytwarzają niewiele nasion, opracowano metodę pozwalającą na użycie minimalnej liczby nasion przy jednoczesnym zachowaniu możliwości przeprowadzenia parametrycznej analizy statystycznej. Schemat blokowy przygotowania próbki i konfiguracji doświadczalnej przedstawiono na rysunku 5 i w tabeli 1. Chociaż pierwsza generacja nasion transgenicznych jest zazwyczaj hemizygotyczna, oczekuje się, że ruch międzykomórkowy i ogólnoustrojowy małych interferujących RNA (siRNA) generowanych przez interferencję RNA powinien powodować wyciszenie syntezy aflatoksyny w całej roślinie.

Rysunek 5. Schematyczny schemat metody analizy skuteczności RNAi w wyciszaniu genów syntezy aflatoksyn Aspergillus w nasionach orzeszków ziemnych. Graficzne przedstawienie przepływu pracy podczas przetwarzania próbek orzeszków ziemnych do ekspresji genów lub analizy aflatoksyn. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

RNAi linie orzechów ziemnych 288-72 i 288-74 wykazały obecność wybranego producenta NPTII podczas testowania przez STN-PCR, skrawki żelu są pokazane na rysunku 6 (na górze), oryginalne zdjęcia są dostępne u autorów na życzenie. Plazmid pCAPD nie był stosowany jako kontrola przemiany, ponieważ koduje odwrócone powtórzenia dwóch genów: Cmr (oporność na chloramfenikol) i CcdB (toksyna) o nieznanym wpływie na rośliny. Jako kontrolę ujemną zastosowano linię orzeszków ziemnych 288-9 z ujemnym wynikiem PCR i inne, które przeszły proces regeneracji i były hodowane w takich samych warunkach jak linie RNAi.

Rysunek 6. Wykrywanie transgeników i ekspresja insercji RNAi w czasie rzeczywistym. U góry: Pojedyncza probówka, zagnieżdżona detekcja PCR transgenicznych linii orzeszków ziemnych RNAi-288-72 i RNAi-288-74, rośliny dodatnie. Kontrole: W (woda), PP (roślina dodatnia), MM (mieszanka główna), p (plazmid p5XCAPD); frakcje 1/2 1/4 1/8 1/16 reprezentują 2-krotne rozcieńczenie DNA. Dół: Wykrywanie ekspresji wstawki RNAi metodą Real-Time PCR (zestawy starterów: RT_5X_1, RT_5X_2, jak na rysunku 1, na niedojrzałych (żółtych) i dojrzałych (brązowych) liścieniach linii transgenicznych w inkubacji 24 i 48 godzin; szara linia: CT = 1. Histogramy reprezentują średnie i słupki błędu standardowego (T) trzech próbek biologicznych z trzema kontrpróbami technicznymi. Względna kwantyfikacja insercji RNAi została znormalizowana w odniesieniu do genu porządkowego aktyny jako wewnętrznej kontroli i porównawczej ekspresji fałdowania transgenu obliczonej zgodnie z opisem w 5.2.2 i 5.3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby przetestować skuteczność kontroli potencjału akumulacji aflatoksyn za pośrednictwem RNAi gospodarza roślinnego, na powierzchnię cięcia półliścieni, z których usunięto zarodki i jądra, zastosowano świeżo zebrane konidia Aspergillus flavus NRRL 3357 (Ryc. 3, 4). ZA. Flawiusz NRRL 3357, dla którego genom został zsekwencjonowany i był podstawą do zaprojektowania p5XCAPD, został uprzejmie dostarczony przez dr Horna z USDA-ARS-NPRL. Wynikającą z tego inwazję połówki liścienia przez grzyby po 24, 48 i 72 godzinach w temperaturze 30 °C przedstawiono na rysunku 4. Próbki zaszczepionych półlistni pobrano w 24, 48, 72, 96 godzinach inkubacji i przeanalizowano pod kątem czterech głównych aflatoksyn B1, B2, G1 i G2 przy użyciu UPLC i potwierdzono LC-MS; Wyniki przedstawiono na rysunku 6. Stężenia aflatoksyn oznaczono przy użyciu opublikowanej metody z modyfikacjami 36. Po 96 godzinach inkubacji liścienie zaczynają się rozpadać z powodu infekcji grzybiczej. Linia RNAi 288-72 wykazywała istotnie niższe poziomy aflatoksyn niż kontrola we wszystkich terminach pobierania próbek u niedojrzałych liścieni i w większości terminów pobierania próbek u dojrzałych. Linia RNAi 288-74 wykazała istotnie niższe poziomy aflatoksyn w większości terminów pobierania próbek. Poziomy istotności testu Tukeya są oznaczone gwiazdkami na grafice przedstawionej na rysunku 7.

Rysunek 7. Aflatoksyny B1 i B2 w półliściach orzechów ziemnych po inkubacji (24, 48, 72 i 96 godzin) z Aspergillus flavus. Kontrola: nasiona linii nietransgenicznej 288-9; RNAi: nasiona RNAi-288-72 i RNAi-288-74, transgeniczne dla RNAi p5XCAPD w celu wyciszenia pięciu genów syntezy aflatoksyny. A) aflatoksyna B1 w dojrzałych nasionach (brązowa); B) dojrzałe nasiona aflatoksyny B2; (C) aflatoksyna B1 w niedojrzałych nasionach (żółta) i (D) aflatoksyna B2 w niedojrzałych nasionach. Przedstawione są wartości średnie wraz z odpowiadającymi im słupkami błędu standardowego (T) dla zduplikowanych próbek biologicznych. Różnice istotne statystycznie Test Tukeya *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ogólnie, RNAi-288-72 wykazał podczas całego eksperymentu (24 do 96 godzin inkubacji) 94%-100% redukcję aflatoksyny B2 i 90%-100% redukcję aflatoksyny B1 w porównaniu do kontroli. RNAi-288-74 wykazał 63%-100% redukcję aflatoksyny B2 i 60%-100% redukcję aflatoksyny B1, ryc. 7.

Startery używane do wykrywania ekspresji wstawki RNAi metodą PCR w czasie rzeczywistym są pokazane na rysunku 1. Liścienie z nasion orzeszków ziemnych analizowano bez zarodków, aby usunąć ich naturalne mechanizmy obronne i być w stanie wykryć potencjalny wpływ RNAi na obszar najbardziej narażony na inwazję grzybów, liścienie. Ekspresja insercji RNAi wykryta w niedojrzałych liścieniach (żółtych) linii 288-74 przez zestaw starterów RT_5X_1 była czterokrotnie wyższa od progu CT = 1 kontroli ujemnej, a przez zestaw starterów RT_5X_2 była 19-krotnie wyższa od progu, wszystko to przy 24 godzinach inkubacji. Co najmniej trzy z pięciu kolejnych fragmentów genów używanych w transformacji orzeszków ziemnych, 5027, 7223 i 7228 (odpowiednio aflep, aflS / aflJ i aflC / pksA) wykryto za pomocą RT-PCR (Figura 1, 6). Ekspresja wstawki RNAi nie została wykryta w dojrzałych liścieniach po 24 godzinach ani na dojrzałych lub niedojrzałych liścieniach po 48 godzinach inkubacji, ryc. 6 (na dole).

Linia orzechów ziemnych Czas próbkowania Próbki do RT-PCR Próbki do analizy aflatoksyn (inokulowane) Liczba nasion (niezaszczepiony) rep 1 Powtórz 2 Powtórzenie 3 Powtórzenie 1 Powtórz 2 Powtórzenie 3 RNAi (żółty) 24 godz. 1 1 1 1 1 1 4.5 48 godz. 1 1 1 1 1 1 72 godz. 1 1 1 1 1 1 Kontrola 24 godz. 1 1 1 1 1 1 4.5 (żółty) 48 godz. 1 1 1 1 1 1 72 godz. 1 1 1 1 1 1

Tabela 2. Przykład konfiguracji małych próbek do analizy ekspresji genów i akumulacji aflatoksyn w nasionach orzeszków ziemnych RNAi. Pełna analiza ekspresji i aflatoksyn dla jednej grupy dojrzałości (tj. żółtej), z trzema okresami pobierania próbek (24, 48 i 72 godziny), w trzech egzemplarzach, wymagałaby 4,5 nasion, z których każda liczba w tabeli reprezentuje połowę liścienia.

Discussion

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają żadnych konfliktów interesów.

Disclosures

Acknowledgements

Ta praca otrzymała wsparcie finansowe od projektu USDA-ARS CRIS 6604-21000-004-00D, projektu CRIS 6604-42000-008-00D oraz umowy programu USAID Feed-the-Future numer 58-0210-3-012. Dziękujemy Valerie Orner, LaTanyi Johnson, Josephowi Powellowi i Kathy Gray za ich pomoc techniczną. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tym artykule służy wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa USA.

Materials

186005221

Startery, oligonukleotydy	DNA Technologies, Coralville, IA, USA	n/a
Dneasy Plant Mini Kit	Qiagen, Walencja, CA	69106
Czapek Dox agar medium	Oxoid, firmy Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	CM0095
Agar	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	BP 1423
Zamrażarka -80 ° C	n/a	nie dotyczy
Tlenek glinu, Al₂O₃	Fisher Scientific	A941
SPE Zbiorniki 1,5 ml	Grace Davison Discovery Scientific	210011
Fryty do 1,5 ml SPE	Grace Davison Discovery Scientific	211401
Fiolki do automatycznego pobierania próbek	Waters Corporation, Milford, Massachusetts
Przyrząd do ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) firmy Waters Acquity; UPLC-Klasa H Czwartorzędowy menedżer rozpuszczalników; Menedżer próbek UPLC; UPLC Detektor fluorescencyjny (FLR); UPLC BEH C18 2.1 mm x 50 mm, 1,7 kolumna mm	Waters Corporation, Milford, MA
Spektrometr masowy pułapki jonowej Finnigan LCQ Advantage MAX, z oprogramowaniem Xcalibur w wersji 1.4	Thermo Electron Corp., San Jose, CA
Standardy aflatoksyny, B₁, B₂, G₁ oraz G₂	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A6636; A9887; A0138; A0263
Systat Software 12.2	SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA
Odczynnik Trizol	Invitrogen, CA	15596-018
SuperScript III Synteza pierwszej nici Super Mix	Invitrogen, CA	11752-050
ABI 7500 Real-Time PCR	Lifetechnologies, Grand Island, Nowy Jork	4406984
Luria Broth-Miller	Fisher Scientific	R453642
pENTR1A	Invitrogen, CA	A10462
LR Clonase II Mieszanka enzymów	Invitrogen, CA	11791-020
T4 Ligaza DNA	NEB Biolabs	M0202L
Gelrite	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1919
Acetosyringone	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D134406
Stacja robocza robota QIAcube	Qiagen, Walencja, CA	9001292
Antybiotyki: kanamycyna, cefotaksym, gentamycyna; streptomycyna	Goldbio, St. Louis, MO	cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; paciorkowce: S-150-50
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen, CA	11304-029

References

Williams, J. H., et al. Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions. The American Journal of Clinical Nutrition. 80, 1106-1122 (2004).
American Association for Cancer Research: AACR. An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20. Cancer Research. 40, 1-12 (1980).
Turner, P. C. The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth. Scientifica. , (2013).
Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells. Toxins (Basel). 5, 1447-1461 (2013).
Gong, Y. Y., et al. Determinants of aflatoxin exposure in young children from Benin and Togo, West Africa: the critical role of weaning. International Journal of Epidemiology. 32, 556-562 (2003).
Eaton, D. L., Groopman, J. D. . The toxicology of aflatoxins: human health, veterinary, and agricultural significance. , (1994).
Murugavel, K. G., et al. Prevalence of aflatoxin B1 in liver biopsies of proven hepatocellular carcinoma in India determined by an in-house immunoperoxidase test. Journal of Medical Microbiology. 56, 1455-1459 (2007).
Wang, J. S., et al. Hepatocellular carcinoma and aflatoxin exposure in Zhuqing Village, Fusui County, People's Republic of China. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 10, 143-146 (2001).
Azziz-Baumgartner, E., et al. Case-control study of an acute aflatoxicosis outbreak, Kenya, 2004. Environmental Health Perspectives. 113, 1779-1783 (2005).
Lye, M. S., Ghazali, A. A., Mohan, J., Alwin, N., Nair, R. C. An outbreak of acute hepatic encephalopathy due to severe aflatoxicosis in Malaysia. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 53, 68-72 (1995).
Villers, P. Aflatoxins and safe storage. Frontiers in Microbiology. 5, 158 (2014).
Kensler, T. W., Roebuck, B. D., Wogan, G. N., Groopman, J. D. Aflatoxin: A 50-year odyssey of mechanistic and translational toxicology. Toxicological Sciences. 120, S28-S48 (2011).
Dorner, J. W., Cole, R. J., Wicklow, D. T. Aflatoxin reduction in corn through field application of competitive fungi. Journal of Food Protection. 62, 650-656 (1999).
Cotty, P. J., Bhatnagar, D. Variability among atoxigenic Aspergillus flavus strains in ability to prevent aflatoxin contamination and production of aflatoxin biosynthetic-pathway enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2248-2251 (1994).
Whitaker, T. B. Standardisation of mycotoxin sampling procedures: an urgent necessity. Food Control. 14, 233-237 (2003).
Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots. Peanut Science. 31, 59-63 (2004).
Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
Rafael, D., et al. EMT blockage strategies: Targeting Akt dependent mechanisms for breast cancer metastatic behaviour modulation. Current Gene Therapy. , (2015).
Li, G., Chang, H., Zhai, Y. P., Xu, W. Targeted silencing of inhibitors of apoptosis proteins with siRNAs: a potential anti-cancer strategy for hepatocellular carcinoma. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention: APJCP. 14, 4943-4952 (2013).
Koldehoff, M. Targeting bcr-abl transcripts with siRNAs in an imatinib-resistant chronic myeloid leukemia patient: challenges and future directions. Methods in Molecular Biology. 1218, 277-292 (2015).
Zhang, J., et al. Pest control. Full crop protection from an insect pest by expression of long double-stranded RNAs in plastids. Science. 347, 991-994 (2015).
Ajjappala, H., Chung, H. Y., Sim, J. S., Choi, I., Hahn, B. S. Disruption of prefoldin-2 protein synthesis in root-knot nematodes via host-mediated gene silencing efficiently reduces nematode numbers and thus protects plants. Planta. 241, 773-787 (2015).
Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annual Review of Genetics. 41, 305-330 (2007).
Vazquez, F., Hohn, T. Biogenesis and biological activity of secondary siRNAs in plants. Scientifica. , (2013).
Tinoco, M. L. P., Dias, B. B. A., Dall'Astta, R. C., Pamphile, J. A., Aragao, F. J. L. In vivo trans-specific gene silencing in fungal cells by in planta expression of a double-stranded RNA. BMC Biology. 8, (2010).
Govindarajulu, M., Epstein, L., Wroblewski, T., Michelmore, R. W. Host-induced gene silencing inhibits the biotrophic pathogen causing downy mildew of lettuce. Plant Biotechnology Journal. , (2014).
Yin, C., Jurgenson, J. E., Hulbert, S. H. Development of a host-induced RNAi system in the wheat stripe rust fungus Puccinia striiformis f. sp. tritici. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24, 554-561 (2011).
Ghag, S. B., Shekhawat, U. K., Ganapathi, T. R. Host-induced post-transcriptional hairpin RNA-mediated gene silencing of vital fungal genes confers efficient resistance against Fusarium. wilt in banana. Plant Biotechnology Journal. 12, 541-553 (2014).
Filichkin, S. A., et al. Efficiency of gene silencing repeats vs. transitive RNAi in Arabidopsis: direct inverted vectors. Plant Biotechnology Journal. 5, 615-626 (2007).
Sciaky, D., Montoya, A. L., Chilton, M. D. Fingerprints of Agrobacterium Ti Plasmids. Plasmid. 1, 238-253 (1978).
Clark, D. J., Maaloe, O. DNA Replication and Division Cycle in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 23, 99-112 (1967).
Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plantarum. 15, 473-497 (1962).
Srinivasan, T., Kumar, K. R. R., Kirti, P. B. Establishment of efficient and rapid regeneration system for some diploid wild species of Arachis. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 101, 303-309 (2010).
Gomes, A. L. V., et al. Single-tube nested PCR using immobilized internal primers for the identification of dengue virus serotypes. Journal of Virology Methods. 145, 76-79 (2007).
Williams, E. J., Drexler, J. S. A non-destructive method for determining peanut pod maturity. Peanut Science. 8, 134-141 (1981).
Sobolev, V. S., Dorner, J. W. Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography. Journal of AOAC International. 85, 642-645 (2002).
Biselli, S., Hartig, L., Wegner, H., Hummert, C. Analysis of Fusarium. toxins using LC-MS-MS: Application to various food and feed matrices. LC GC North America. 23, 404-413 (2005).
Arias, R. S., Sobolev, V. S., Orner, V. A., Dang, P. M., Lamb, M. C. Potential involvement of Aspergillus flavus laccases in peanut invasion at low water potential. Plant Pathology. 63, 353-363 (2014).
Dang, P. M., Chen, C. Y., Holbrook, C. C. Evaluation of five peanut (Arachis hypogaea) genotypes to identify drought responsive mechanisms utilising candidate-gene approach. Functional Plant Biology. 40, 1323-1333 (2013).
Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C-T method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
Amaike, S., Keller, N. P. Aspergillus flavus. Annual Review of Phytopathology. 49, 107-133 (2011).
Nowara, D., et al. HIGS: Host-induced gene silencing in the obligate biotrophic fungal pathogen Blumeria graminis. Plant Cell. 22, 3130-3141 (2010).
Woloshuk, C. P., et al. Molecular characterization of aflR, a regulatory locus for aflatoxin biosynthesis. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2408-2414 (1994).
Price, M. S., et al. The aflatoxin pathway regulator AflR induces gene transcription inside and outside of the aflatoxin biosynthetic cluster. FEMS Microbiology Letters. 255, 275-279 (2006).
Ehrlich, K. C., Montalbano, B. G., Cotty, P. J. Sequence comparison of aflR from different Aspergillus. species provides evidence for variability in regulation of aflatoxin production. Fungal Genetics and Biology. 38, 63-74 (2003).
McDonald, T., Brown, D., Keller, N. P., Hammond, T. M. RNA silencing of mycotoxin production in Aspergillus and Fusarium species. Molecular Plant Microbe Interactions. 18, 539-545 (2005).
Abdel-Hadi, A. M., Caley, D. P., Carter, D. R., Magan, N. Control of aflatoxin production of Aspergillus flavus. and Aspergillus parasiticus. using RNA silencing technology by targeting aflD. (nor-1) gene. Toxins (Basel). 3, 647-659 (2011).
Swartz, M. E. Ultra performance liquid chromatography (UPLC): An introduction: Separation Science Redefined. LCGC North America. , 8-14 (2005).
Maghuly, F., Khan, M. A., Fernandez, E. B., Druart, P., Watillon, B., Laimer, M. Stress regulated expression of the GUS-marker gene (uidA) under the control of plant calmodulin and viral 35S promoters in a model fruit tree rootstock: Prunus incisa x serrula. Journal of Biotechnology. 135, 105-116 (2008).
de Mesa, M. C., Santiago-Doménech, N., Pliego-Alfaro, F., Quesada, M. A., Mercado, J. A. The CaMV 35S promoter is highly active on floral organs and pollen of transgenic strawberry plants. Plant Cell Reports. 23, 32-38 (2004).
Sunilkumar, G., Mohr, L., Lopata-Finch, E., Emani, C., Rathore, K. S. Developmental and tissue-specific expression of CaMV 35S promoter in cotton as revealed by GFP. Plant Molecular Biology. 50, 463-474 (2002).
Groenenboom, M. A. C., Maree, A. F. M., Hogeweg, P. The RNA silencing pathway: The bits and pieces that matter. PLoS Computational Biology. 1, 155-165 (2005).
Zhao, D., Song, G. Q. High-throughput sequencing as an effective approach in profiling small RNAs derived from a hairpin RNA expression vector in woody plants. Plant Science: an International Journal of Experimental Plant Biology. 228, 39-47 (2014).
Kamthan, A., Chauduri, A., Kamthan, M., Datta, A. Small RNAs in plants: recent development and application for crop improvement. Frontiers in Plant Science. 6, 208 (2015).
Manda, A., Bodapati, P. N., Rachaputi, N. C., Wright, G., Fukai, S. . Aflatoxins and their relationship with sugars in peanut (Arachis hypogaea L). , (2004).
Uppala, S. S. . Factors affecting pre-harvest aflatoxin contamination of peanut (Arachis hypogaea L). , (2011).
Sobolev, V. S. Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56, 1949-1954 (2008).
Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55, 2195-2200 (2007).
Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57, 62-68 (2009).
Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts. Mycopathologia. 105, 117-128 (1989).
Sobolev, V. S. Production of phytoalexins in peanut (Arachis hypogaea) seed elicited by selected microorganisms. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 1850-1858 (2013).
Basha, S. M. M., Cherry, J. P., Young, C. T. Changes in free amino acids, carbohydrates, and proteins of maturing seeds from various peanut (Arachis hypogaea L.) cultivars. Cereal Chemistry. 53, 586-596 (1976).
Lansden, J. A. Aflatoxin inhibition and fungistasis by peanut tannins. Peanut Science. 9, 17-20 (1982).
Yen, G. C., Duh, P. D., Tsai, C. L. Relationships between antioxidant activity and maturity of peanut hulls. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 41, 67-70 (1993).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video

Kontrola aflatoksyn w orzeszkach ziemnych za pośrednictwem RNAi: metoda analizy produkcji mikotoksyn i ekspresji transgenów w patosystemie orzeszków ziemnych/<em>aspergillus</em>