Artykuł metodologiczny

Kontrola aflatoksyn w orzeszkach ziemnych za pośrednictwem RNAi: metoda analizy produkcji mikotoksyn i ekspresji transgenów w patosystemie orzeszków ziemnych/aspergillus

DOI:

10.3791/53398

⸱

21 grudnia 2015

 ,  , 
1National Peanut Research Laboratory, United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy metodę analizy aflatoksyn i ekspresji transgenów w nasionach orzeszków ziemnych, które zawierają sygnały interferencji RNA do wyciszania genów syntezy aflatoksyn u grzyba Aspergillus flavus. Kontrola mikotoksyn w roślinach za pośrednictwem RNAi nie została wcześniej zgłoszona.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organizacja Narodów Zjednoczonych ds. Wyżywienia i Rolnictwa szacuje, że 25% upraw żywności na świecie jest skażonych aflatoksynami. Oznacza to, że każdego roku 100 milionów ton żywności jest niszczonych lub kierowanych do spożycia przez ludzi innych niż ludzie. Aflatoksyny są silnymi czynnikami rakotwórczymi normalnie gromadzonymi przez grzyby Aspergillus flavus i A. parasiticus w zbożach, orzechach, roślinach okopowych i innych produktach rolnych. Wyciszenie pięciu genów syntezy aflatoksyny przez interferencję RNA (RNAi) w roślinach orzeszków ziemnych wykorzystano do kontrolowania akumulacji aflatoksyny po inokulacji A. flavus. Wcześniej nie istniała żadna metoda analizy skuteczności RNAi w indywidualnych zdarzeniach transgenicznych orzeszków ziemnych, ponieważ zwykle dają one niewiele nasion, a tradycyjne metody dużych eksperymentów polowych w warunkach sprzyjających aflatoksynom nie były opcją. Na polu prawdopodobieństwo znalezienia naturalnie zanieczyszczonych nasion wynosi często od 1/100 do 1/1000. Ponadto zanieczyszczenie aflatoksynami nie jest równomiernie rozłożone. Nasza metoda wykorzystuje kilka nasion na zdarzenie transgeniczne, z małymi cząstkami przetworzonymi do PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (RT-PCR) lub sekwencjonowania małego RNA oraz do analizy akumulacji aflatoksyn za pomocą ultra-sprawnej chromatografii cieczowej (UPLC). Linie orzeszków ziemnych 288-72 i 288-74 wykazujące ekspresję RNAi wykazały do 100% redukcji (p≤0,01) aflatoksyny B1 i B2 w porównaniu z kontrolą, która zgromadziła do 14 000 ng.g-1 aflatoksynyB1 po zaszczepieniu aflatoksyną A. flavus. Dla porównania, maksymalna całkowita ilość aflatoksyn dopuszczona do spożycia przez ludzi w Stanach Zjednoczonych wynosi 20 ng.G-1. Protokół ten opisuje zastosowanie kontroli aflatoksyn za pośrednictwem RNAi w transgenicznych nasionach orzeszków ziemnych oraz metody jej oceny. Wierzymy, że jego zastosowanie w hodowli orzeszków ziemnych i innych roślin uprawnych przyniesie szybki postęp w tej ważnej dziedzinie nauki, medycyny i żywienia człowieka oraz znacząco przyczyni się do międzynarodowych wysiłków na rzecz kontroli aflatoksyn i potencjalnie innych mikotoksyn w głównych uprawach spożywczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Około 4,5 miliarda ludzi jest chronicznie narażonych na aflatoksyny 1, najsilniejsze znane w naturze substancje rakotwórcze 2. Mikotoksyny te zanieczyszczają 25% upraw żywności na świecie 3, w tym kukurydzę, maniok, ryż, orzechy, zboża i przyprawy 4. Aflatoksyny powodują zahamowanie wzrostu u dzieci 5, upośledzają układ odpornościowy 6, występują w 58% przypadków raka wątroby w biopsjach ludzkich 7,8 i powodują śmierć setek osób podczas okresowych wybuchów aflatoksykozy 9,10. Aflatoksyny są pochodnymi poliketydów mikotoksynami, zwykle produkowanymi przez Aspergillus flavus i A. parasiticus; aflatoksyny B1 i B2 są produkowane przez A. flavus, natomiast A. parasiticus produkuje również G1 i G2. Struktura chemiczna tych związków oraz chromatogram przedstawiający ich rozdział metodą UPLC są ukazane na Rysunku 1.

figure-introduction-1
Rysunek 1. Aflatoksyny i wkładka RNAi. Góra: struktura chemiczna (po lewej) i przykład chromatogramu (po prawej) czterech najczęstszych pochodnych poliketydowych aflatoksyn: B1, B2, G1 i G2, produkowanych przez Aspergillus parasiticus; A. flavus produkuje B1 i B2. Dół: Schemat fragmentów genów w konstrukcie RNAi p5XCAPD wykorzystanym do transformacji arakiidowca; numery pod strzałkami to numery dostępowe fragmentów genów w genomie Aspergillus flavus; PIV2: intron ziemniaka; bp: pary zasad; RT_5X_1 i RT_5X_2: miejsca przyłączania starterów do Real-Time PCR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Straty ekonomiczne w eksporcie spowodowane obecnością aflatoksyn w samych orzeszkach ziemnych przekraczają 450 milionów dolarów amerykańskich, jeśli obliczyć je na podstawie limitu 4 ng.g-1 aflatoksyny dopuszczalnej do spożycia przez ludzi w Unii Europejskiej 11. Aflatoksyny są znane od 60 lat 12; jednak, mimo opracowania wielu praktyk rolniczych mających na celu łagodzenie ich wpływu, w tym stosowania innych szczepów grzybów 13,14, nie istnieje spójna metoda kontroli, a odmiany roślin odporne nie są dostępne. Badanie plazmy zarodkowej roślin pod kątem odporności na aflatoksyny jest szczególnie trudne, ponieważ nawet w warunkach sprzyjających inwazji patogenu akumulacja mikotoksyn jest nieprzewidywalna i nie wykazuje rozkładu normalnego. W związku z tym eksperymenty zazwyczaj wymagają dużych obszarów upraw, setek nasion oraz wielokrotnych próbek o masie 100-1 700 g w celu zmniejszenia zmienności danych 15,16.

Interferencja RNA została odkryta w 1998 roku 17, a korzyści z tzw. „wyciszania” są obecnie badane w wielu nowych zastosowaniach, np. w terapiach przeciwko przerzutowemu rakowi piersi 18, rakowi wątroby 19, białaczkach szpikowych 20 oraz w ochronie roślin przed owadami 21 i nicieniami 22. W roślinach sygnały interferencji RNA mogą przemieszczać się z komórki do komórki, przy czym małe interferujące RNA (siRNA) oraz RNA o wysokiej masie cząsteczkowej odpowiadają za systemowe posttranskrypcyjne wyciszanie genów 23,24, nawet wewnątrz grzybowych patogenów będących w bliskim kontakcie z rośliną żywicielem 25. Skuteczność RNAi w zapośredniczonym przez rośliny wyciszaniu genów patogenów grzybowych opisano w kilku patosystemach roślinnych, w których wizualna ocena objawów w nadziemnych częściach roślin (liściach) pozwoliła na kwantyfikację choroby, tj. w przypadku oomyceta Bremia w sałacie 26, Puccinia w pszenicy 27 i Fusarium w bananowcu 28. Znacznie trudniejsza jest ocena skuteczności RNAi w kontrolowaniu mikotoksyn w roślinach, w szczególności aflatoksyn w arachidziach, ponieważ liście nie wykazują objawów infekcji, zainfekowane organy (nasiona) znajdują się pod kilkoma centymetrami gleby, występowanie infekcji jest nieprzewidywalne, a obecność aflatoksyn można stwierdzić jedynie za pomocą analizy chemicznej. Ponadto każde zdarzenie transgeniczne u arachidzi zazwyczaj daje niewiele nasion (4-6 na roślinę); dlatego tradycyjne testowanie cechy braku akumulacji aflatoksyn na dużych poleach doświadczalnych, trwające całe sezony upraw i wymagające setek nasion, nie jest wykonalne. Opisano tutaj metodę analizy nasion arachidzi poddanych RNAi w czasie krótszym niż tydzień pod kątem obecności transgenu oraz cechy braku akumulacji aflatoksyn, przy użyciu zaledwie kilku nasion.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konstrukt molekularny i transformacja arakiidowca

  1. Połącz fragmenty DNA pięciu genów A. flavus: AFL2G_07223 (aflS lub aflJ), AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07228 (aflC/pksA/pksL1), AFL2G_07731 (pes1) oraz AFL2G_05027 (pompa usuwająca aflatoksynę, aflep). W tym celu zastosuj następujące primery i ultamery: DIR-1, Short-Dir1-R, DIR-2-inverted, Short-Dir2-R, DirAll-Nco-Rv oraz DirAll-BamEco-Fw, Tabela 1.
    1. Utwórz dwuniciowy fragment DIR-1 poprzez 5 cykli PCR (reakcja 25 μl; 95 °C przez 2 min, następnie 5 cykli: 94 °C przez 45 s, 55 °C przez 30 s, 68 °C przez 15 s), używając polimerazy DNA zgodnie z instrukcją producenta i prymera Short-Dir1-R, aby pozostawić nawis 3' CCCGT. Powtórz te kroki, aby utworzyć dwuniciowy fragment DIR-2-inverted, używając prymera Short-Dir2-R, aby pozostawić nawis 3' ACGGG komplementarny do DIR-1.
    2. Zliguj dwa fragmenty o długości 199 bp za pomocą ligazy DNA T4 zgodnie z instrukcją producenta. Przeprowadź amplifikację PCR otrzymanego fragmentu o długości 393 bp w sposób opisany w punkcie 1.1.1, używając prymerów DirAll-cacc-Fw i DirAll-Nco-Rv (Tabela 1), a następnie sklonuj produkt za pomocą standardowych technik do pENTR1A, aby otrzymać plazmid p2+4ENTR.
    3. Rekombinuj p2+4ENTR do pCAPD 29 (numer dostępu NCBI: KC176455.1), używając mieszaniny enzymów LR clonase II zgodnie z instrukcją producenta, aby otrzymać plazmid p5XCAPD, a następnie wprowadź go do Escherichia coli DH5α za pomocą standardowych technik, po czym wykonaj częściowe sekwencjonowanie. Uwaga: Pełny wkład RNAi przedstawiono w Tabeli 1.
  2. Wprowadź plazmid p5XCAPD do szczepu Agrobacterium C58C1 30 zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami30, a otrzymane bakterie wykorzystaj do transformacji roślin arachidowca w następujący sposób:
    1. Hoduj w temperaturze 30 °C Agrobacterium zawierające p5XCAPD w 50 ml pożywki LB-Broth uzupełnionej o 500 μg ml-1 streptomycyny, 25 μg ml-1 gentamycyny i 10 μg ml-1 kanamycyny; inkubuj kulturę przy wytrząsaniu 250 rpm do osiągnięcia 1 OD260.
    2. Zabierz komórki Agrobacterium poprzez wirowanie (6 000 x g) przez 10 min, resuspenduj w 50 ml minimalnej pożywki AB 31 z dodatkiem 100 μM acetosyringonu przez 1 h, a następnie umieść w zawiesinie bakteryjnej eksplanty z 10-14 dniowych siewek Exp27-1516 (linia hodowlana arachidowca typu runner). Po 30 min osusz eksplanty na papierze filtracyjnym 3MM i umieść je w ciemności przez trzy dni na pożywce indukcyjnej pędów (SIM) [sole MS 32, 3% sacharozy, 20 μM benzyloaminopuryny (BAP), 10 μM thidiazuronu (TDZ), pH 5.8, 0.3% gumy gellan] bez antybiotyków.
    3. Przeprowadź selekcję tkanek i regenerację zgodnie z wcześniejszymi opisami 33. Przenieś tkanki na pożywkę SIM (500 μM cefotaksymu i 100 μM kanamycyny) w celu formowania pędów, z przeniesieniami co dwa tygodnie przez 2 miesiące. Następnie umieść rozwijające się pędy na pożywce wydłużającej pędy (SEM) [5 μM BAP, 1 μM kwasu giberelinowego (GA3)] w odstępach dwutygodniowych przez kilka miesięcy.
    4. Umieść pojedyncze pędy o wielkości 2 cm w pożywce indukcyjnej korzeni (RIM) [1/2 MS, 1.5% sacharozy, 5 μM kwasu α-naftaleno-octowego (NAA), 2.5 μM kwasu indolomaślanowego (IBA)], a następnie aklimatyzuj siewki i przenieś je do szklarni.

2. Identyfikacja roślin arakiidowych wykorzystujących RNAi do wyciszania genów syntezy aflatoksyn

  1. Użyć zestawu mini do izolacji DNA z roślin w stacji roboczej z elucją 200 μl zgodnie z instrukcją producenta w celu wyekstrahowania DNA z młodych liści roślin araKISZOWYCH, które poddano procesowi transformacji (jak opisano wcześniej) konstruktem RNAi p5XCAPD (Rysunek 1), który posiada plazmid pCAPD 29 jako szkielet do wyciszania genów.
  2. Przeskanować próbki DNA za pomocą jednorurkowej zagnieżdżonej PCR (STN-PCR) zgodnie z wcześniejszym opisem 34 w celu wykrycia markera selekcyjnego NPTII oraz insertu RNAi z p5XCAPD. Rozmnożyć klonalnie rośliny z wynikiem dodatnim w PCR z sadzonek (3-4 węzły), aby uzyskać wystarczającą liczbę nasion do testów w tej pierwszej generacji.
    1. We wszystkich reakcjach STN-PCR zastosować cztery dwukrotne rozcieńczenia DNA (50-100 ng μl-1 przed rozcieńczeniem). Dla NPTII użyć starterów zewnętrznych PCAPD 5714F: 5'-AGGCTATTCGGCTATGACTG-3' i PCAPD 6446R: 5'-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3' oraz starterów wewnętrznych PCAPD 5730F: 5'-ACTGGGCACAACAGACAATC-3' i PCAPD 6249R: 5'-ATATTCGGCAAGCAGGCATC-3'.
    2. Do wykrywania insertu RNAi w reakcjach STN-PCR użyć starterów zewnętrznych 35S-PDSFw: 5'-CCTAACAGAACTCGCCGTAA-3' i DirAll-Nco-Rv: 5'-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3' oraz starterów wewnętrznych Probe_5027_Fw: 5'-gtatttgtgaccatgtttctg-3' i Probe_7228_Rv: 5'-GGACGGATAGTAAACTGCGG-3'.
  3. Zebrać strąki araKISZOWYCH z roślin z wynikiem dodatnim w STN-PCR oraz z roślin kontrolnych uprawianych w tych samych warunkach. KROK KRYTYCZNY: Upewnić się, że rośliny kontrolne są uprawiane w tych samych warunkach i w tym samym sezonie co rośliny RNAi. Wymyć strąki strumieniem wody za pomocą myjki ciśnieniowej o niskiej intensywności lub zeskrobać ręcznie, aby usunąć egzokarpię, określić kolor mezokarpii, kładąc strąki na tablicy dojrzałości i rozdzielić strąki na grupy (żółte, pomarańczowe, brązowe i czarne) 35 (Rysunek 2).

figure-protocol-1
Rycina 2. Przygotowanie strąków orzeszków ziemnych do analizy.  Po lewej: Różne rozmiary orzeszków ziemnych występujące podczas zbiorów, ponieważ roślina ta charakteryzuje się nieograniczonym wzrostem; Środek: umieszczanie orzeszków w metalowym koszu w celu usunięcia egzokarpu za pomocą ciśnienia wody; Po prawej: grupy dojrzałości określone na podstawie koloru mezokarpu na tablicy profilowej orzeszków (żółty, pomarańczowy, brązowy i czarny). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

3. Układ eksperymentalny

  1. Usuń łupiny, a żółte i brązowe nasiona przetwórz oddzielnie. Oblicz liczbę nasion do wykorzystania w eksperymencie zgodnie z Tabelą 2. Należy pamiętać, że do przeprowadzenia analizy statystycznej i zmniejszenia błędu standardowego wymagane jest minimum trzy fragmenty nasion (1 fragment nasion = połowa kotyledonu) na linię orzeszka ziemnego i datę pobrania próbek.
NazwaSekwencja 
DIR-15'-
GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT
CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCGTATTTG
TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC
ATTCCCCAGATCACGGACGAATCCCCTGCATCTACGCGCACGCATC
ACTTGGGGTACCCGT-3'
Short-Dir1-R5'-Phos-TACCCCAAGTGATGCGTGCGCG-3'
DIR-2-odwrócony5'- GGTTATTGGGTGCAGAATGGTAAACCACCCAACAGTACGCGAAATG
TCAATTCCAGAGTCCCAAACCTCCCTACCGTGGCCTGGACGGATAG
TAAACTGCGGAGCTTGGGAACAAAATCCGCTGTCTGATCGCCGAAG
AGAAAGAGTTGCCTTGATTGAGCCGCATCGAGGACAGGTTGTGTTG
CTGTTGATAGACGGG-3'
Krótki-Dir2-R5'-Phos-CTATCAACAGCAACACAACC-3'
DirAll-cacc-Fw5'-CACCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3'
DirAll-Nco-Rv5'-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3'
DirAll-BamEco-Fw5'-ATGGGATCCGAATTCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3'
Kompletna wstawka RNAi5’- GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT
CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTC/GTATTTG
TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC
ATTCCCCAGATCACGGACGAAT/CCCCTGCATCTACGCGCACGCAT
CACTTGGGGTACCCGTCTATCAACAGCAACACAACCTGTCCTCGAT
GCG/GCTCAATCAAGGCAACTCTTTCTCTTCGGCGATCAGACAGCG
GATTTTGTTCCCAAGCTCCGCAGTTTACTATCCGTCCA/GGCCACGG
TAGGGAGGTTTGGGACTCTGGAATTGACATTTCGCGTACTGTTGGG
TGGTTTACCATTCTGCACCCAATAACC-3’

Tabela 1. Oligonukleotydy i ultramery użyte do budowy konstruktu RNAi p5XCAPD. Phos: fosforylowany koniec 5’; „/” oddziela pięć użytych fragmentów genu; Complete RNAi insert: sekwencja użyta jako 2 powtórzenia inwertykowane w celu utworzenia p5XCAPD.

  1. Umieść całe nasiona arałszczyku w jednej warstwie tak, aby pokrywały dno sterylnego zlewki.  Dodaj roztwór 75% etanolu w wodzie (v/v), aby przykryć nasiona, a następnie dodaj taką samą objętość tego samego roztworu.  Inkubuj w temperaturze otoczenia przez 30 sec, a następnie opłucz sterylną wodą dejonizowaną (SDW).
  2. Dodaj 2% podchlorynian do zlewki zawierającej nasiona traktowane etanolem w następujący sposób: dodaj odpowiednią ilość 2% roztworu podchlorynianu, aby pokryć nasiona, następnie dodaj taką samą objętość tego samego roztworu i inkubuj przez 5 min. KROK KRYTYCZNY: Opłucz dokładnie trzy razy objętością SDW równą 5-krotności objętości użytego podchlorynianu (Rysunek 3).

figure-protocol-2
Rysunek 3. Układ eksperymentalny. Góra: Sterylizacja powierzchniowa nasion arahiszji przed i po zastosowaniu podchlorynu, usuwanie łupin nasiennych (testa); Środek: usuwanie zarodka i zbliżenie zarodka, następnie przecięcie liścica na pół; Dół: połówki liściców w sterylnej wodzie destylowanej, osuszanie na sterylnym papierze chłonnym, przygotowanie wgłębień w agarze wodnym i umieszczanie połówek liściców (przeciętą stroną do góry) na powierzchni agaru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Pozostaw sterylizowane powierzchniowo nasiona do nasiąknięcia w SDW przez 2 hr. Umieść nasiona na sterylnym rachunku Petriego, usuń łupiny za pomocą pęsety, rozdziel zalążnie i za pomocą skalpela wyjmij zarodki. Uwaga: Zarodki można zutylizować lub wykorzystać do regeneracji nowych roślin.
  2. Przeciąć każdy zalążnię na pół za pomocą skalpela. Aby uniknąć odwodnienia, przechowywać przecięte fragmenty nasion w sterylnej wodzie aż do przetworzenia wszystkich nasion.
  3. Przygotować rachunki Petriego zawierające sterylną wodną agar (1,5% agar/woda; w/v), jeden dla każdych trzech fragmentów nasion. Wykonać małe wgłębienia w agarze za pomocą pęsety, krótko osuszyć nadmiar wody z fragmentów nasion na sterylnych ręcznikach papierowych, a następnie umieścić fragmenty nasion (przeciętą stroną do góry) na płytkach z wodnym agarem.
  4. Z młodej kultury aflatoksygiennego Aspergillus flavus NRRL 3357 na podłożu agarowym Czapeka, hodowanej w temperaturze 25 °C przez 10 dni, przygotować zawiesinę zawierającą 50 000 zarodników na μl SDW, policzonych za pomocą komory hematometrycznej.
  5. Nanieść 2 μl zawiesiny zarodników na przecięte powierzchnie każdego fragmentu połowy zalążni, unikając spływania po bokach, aby upewnić się, że zarodniki mają kontakt z tkanką nasion zawierającą RNAi (Rysunek 4).

figure-protocol-3
Rycina 4. Inokulacja i inkubacja w analizie aflatoksyn. Góra: Połówka liścienia, inokulacja zawiesiną zarodników oraz wzrost grzybni Aspergillus flavus na połówce liścienia po 24 h inkubacji.  Dół:  lewa: inkubacja przez 48 h na agarze 1,5%; środek: inkubacja przez 72 h na agarze 1,5%; prawa: przykład błędnego ustawienia eksperymentalnego, inkubacja przez 72 h na agarze 0,5%.   Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Inkubować szalki Petri z zaszczepionymi i niezaszczepionymi połowami liści zasłonowych w temperaturze 30 °C w ciemności do momentu pobrania próbek.

4. Pobieranie próbek do analizy aflatoksyn i ekspresji genów

  1. Pobrać próbki w trzech powtórzeniach po 24, 48 i 72 h (opcjonalnie 96 h) inkubacji, zarówno do analizy RT-PCR, jak i oznaczania aflatoksyn; każda powtórka powinna stanowić jeden fragment (połowę liścienca). Próbki należy pobierać losowo z różnych płytek w każdym terminie pobierania. Za pomocą chusteczki delikatnie usunąć agar i nadmiar zarodników grzyba przed umieszczeniem fragmentów nasion w fiolkach lub probówkach.
  2. Do analizy aflatoksyn każdą powtórkę (jeden fragment) umieścić w szklanej fiolce z nakrętką o pojemności 4 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Uwaga: Ze względu na stabilność chemiczną aflatoksyn, próbki mogą być przechowywane w tych warunkach przez kilka miesięcy (w obecnych eksperymentach zazwyczaj od 1 do 2 miesięcy).
  3. Do analizy RT-PCR każdą powtórkę (jeden fragment) umieścić w przygotowanych wcześniej probówkach do homogenizacji o pojemności 2 ml, zawierających dwie kulki ze stali nierdzewnej (śr. 2,5 mm) i trzy kulki z cyrkonu (śr. 2 mm).
  4. Wszystkie próbki natychmiast zamrozić (najlepiej w ciekłym azocie) i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu procesu analizy.

5. Analiza aflatoksyn w poszczególnych fragmentach połowy liścica

  1. Do analizy wykorzystać próbki zaszczepione A. flavus. Próbki doprowadzić do temperatury otoczenia przez około 30 min, dodać cztery objętości (zazwyczaj 2-3 ml; w/v) metanolu (zapisać wartość do późniejszych obliczeń), zamknąć nakrętki i inkubować przez noc (O/N, ~16 h) w ciemności, bez mieszania.
  2. Umieścić fryt w dopasowanej minikolumnie z propylenu o pojemności 1,5 ml, dodać 200 mg zasadowego Al2O3 i zamknąć drugą frytą zgodnie z wcześniejszym opisem 36; następnie pod kolumną umieścić fiolkę do autopróbnika chromatografu cieczowego ultra wysokiej wydajności (UPLC) na tyle blisko, aby zapobiec ewentualnemu odparowaniu eluatu.
  3. W jednorazowej szklanej probówce (nie używać plastikowych) umieścić 0,5 ml ekstraktu metanolowego otrzymanego w kroku 4.1, dodać 0,5 ml acetonitrylu, wymieszać pipetą i nanieść 0,5 ml mieszaniny na kolumnę przygotowaną w kroku 4.2. Pozostawić eluat do spłynięcia do fiolki autopróbnika pod wpływem grawitacji (nie stosować ciśnienia). Elucja trwa zazwyczaj 2-4 min; natychmiast zamknąć fiolkę za pomocą kompatybilnej z UPLC nakrętki z septą. Fiolki przechowywać w temperaturze otoczenia i przeanalizować tego samego dnia za pomocą UPLC.
  4. W celu rozdzielenia aflatoksyn umieścić fiolki autopróbnika zawierające eluaty próbek oraz fiolki z wzorcami aflatoksyn (B1 i B2 w przypadku użycia A. flavus) w urządzeniu UPLC wyposażonym w odpowiedni menedżer rozpuszczalników czwórnicowych (Quaternary Solvent Manager), menedżera próbek (Sample Manager), detektor fluorescencyjny oraz kolumnę C18 2,1 mm x 50 mm, 1,7 µm.
    1. Zastosować izokratyczną fazę ruchomą składającą się z mieszaniny woda/MeOH/CH3CN (64:23:13, v/v/v) przy szybkości przepływu 0,30 ml min-1. Uzyskać chromatogramy zapewniające stabilne rozdzielenie linii bazowej dla dokładnego obliczenia stężenia aflatoksyn, zgodnie z instrukcjami producenta 37.
    2. Potwierdzić tożsamość aflatoksyn poprzez uzyskanie ich danych spektrometrycznych i porównanie ich z danymi opublikowanymi 38. Użyć spektrometru mas z pułapką jonową wyposażonego w interfejs ESI oraz odpowiedniego oprogramowania zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Wyznaczyć stężenia aflatoksyn w odniesieniu do krzywych kalibracyjnych uzyskanych poprzez wstrzyknięcie różnych ilości odpowiednich komercyjnych wzorców aflatoksyn B1, B2, G1 i G2, zgodnie z sugestią producenta UPLC i obliczeniami programu 37.
  6. Fragmenty nasion, które zostały już poddane ekstrakcji metanolem, umieścić w oddzielnych szklanych fiolkach i liofilizować przez noc (O/N, ~16 h) w celu wyznaczenia ich masy suchej. Następnie obliczyć stężenie aflatoksyn w ng.g-1 suchej masy fragmentu nasion.
  7. Do analizy danych przekształcić wyniki stężeń aflatoksyn na log (ng.g-1 +1), a następnie przeprowadzić test Tukeya w celu porównania średnich.

6. Ekspresja genów, obróbka próbek do RT-PCR

  1. Wyjmij 2 ml probówek do rozcierania zawierające próbki z zamrażarki do -80 °C i bezzwłocznie (bez rozmrażania) rozcieraj je w homogenizatorze kulowym przy 3 100 rpm przez 40 sec, a następnie przystąp do ekstrakcji RNA przy użyciu Trizol zgodnie z instrukcją producenta.
  2. Przygotuj cDNA z każdej próbki, wykorzystując 1 μg RNA oraz równe ilości oligo dT i randomowych heksamerycznie, wykonaj rozcieńczenie cDNA w stosunku 1:8 i użyj 2 μl na reakcję w RT-PCR (jak opisano wcześniej 39).
    1. Do wykrywania ekspresji wstawki RNAi użyj starterów: RT_5X_1_105F: 5'GGTGGCATTGGACCGTCTTG-3', RT_5X_1_232R: 5'-CGCATCGAGGACAGGTTGTG-3'; oraz RT_5X_2_95F: 5'-CCATGTTTCTGGTGGCATTG-3', RT_5X_2_229R: 5'-ATCGAGGACAGGTTGTGTTG-3'.
    2. Do wykrywania ekspresji markera selekcyjnego NPTII użyj starterów: RT_NPTII_1_6871F: 5'-CTCGCTCGATGCGATGTTTC-3', RT_NPTII_1_7004R: 5'-GCAGGATCTCCTGTCATCTC-3'. Do standaryzacji wykorzystaj gen referencyjny Actin oraz startery: Actin-Fw: CACATGCCATCCTTCGATTG; Actin-Rv: CCAAGGCAACATATGCAAGCT 40.
  3. Przeanalizuj wyniki metodą Delta-delta CT 41 zestandaryzowaną względem ekspresji Actin. Przedstaw wyniki jako krotność wzrostu w stosunku do kontroli.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazmid p5XCAPD został stworzony jako pochodna pCAPD 29 i wykorzystany do transformacji roślin arachidowca; wektor ten niesie odwrócone powtórzenia pięciu małych fragmentów, po 70-80 bp każdy, genów syntezy aflatoksyn A. flavus oddzielonych intronem (Rycina 1). Do konstrukcji wykorzystano fragmenty AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07223 (aflS lub aflJ), AFL2G_05027 (pompa odpływowa aflatoksyny, aflep), AFL2G_07228 (aflC/pksA/pksL1) oraz AFL2G_07731 (pes1); numery na Rycynie 1 odpowiadają adnotacji genomu A. flavus w BROAD Institute, Cambridge, MA, oraz literaturze 42. Po procesie transformacji zregenerowano łącznie 99 linii arachidowca, z czego 50 było PCR-dodatnich w kierunku NPTII wykrytego za pomocą STN-PCR, a 33 linie były PCR-dodatnie i wytworzyły nasiona. Tylko siedem linii PCR-dodatnich rozmnożono klonalnie i poddano badaniu akumulacji aflatoksyn metodą opisaną w niniejszej pracy; wszystkie siedem wykazało o 60% do 100% mniejszą akumulację aflatoksyn niż kontrola. Tutaj przedstawiamy wyniki dla dwóch z tych siedmiu linii. Ponieważ poszczególne zdarzenia transgeniczne zazwyczaj dają niewielką liczbę nasion, opracowano metodę pozwalającą na wykorzystanie minimalnej liczby nasion przy jednoczesnej możliwości przeprowadzenia parametrycznej analizy statystycznej. Schemat blokowy przygotowania próbek i układu eksperymentalnego przedstawiono na Rycynie 5 oraz w Tabeli 1. Choć pierwsze pokolenie nasion transgenicznych jest zazwyczaj hemizygotyczne, oczekuje się, że ruch międzykomórkowy i systemiczny małych interferujących RNA (siRNA) generowanych poprzez interferencję RNA zapewni wyciszenie syntezy aflatoksyn w całej roślinie.

figure-results-1
Rysunek 5. Schematyczny wykres blokowy metody analizy skuteczności RNAi w wyciszaniu genów syntezy aflatoksyn grzyba Aspergillus w nasionach arakiidowy. Graficzna reprezentacja przebiegu prac podczas przetwarzania próbek arakiidowych w celu analizy ekspresji genów lub zawartości aflatoksyn. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Linie orzeszka ziemniaczanego RNAi 288-72 i 288-74 wykazały obecność markera selekcyjnego NPTII w teście STN-PCR; fragmenty żelu przedstawiono na Rysunku 6 (góra), oryginalne zdjęcia są dostępne u autorów na żądanie. Plazmid pCAPD nie został użyty jako kontrola transformacji, ponieważ koduje on odwrócone powtórzenia dwóch genów Cmr (oporność na chloramfenikol) i CcdB (toksyna) o nieznanym wpływie na rośliny. W charakterze kontroli negatywnej wykorzystano linię orzeszka ziemniaczanego 288-9, która była wynikiem negatywnym w teście PCR, oraz inne linie, które przeszły proces regeneracji i były hodowane w tych samych warunkach co linie RNAi.

figure-results-2
Rycina 6. Wykrywanie transgenicznych linii oraz analiza ekspresji w czasie rzeczywistym wstawki RNAi. Góra: Detekcja w jednej probówce metodą Nested PCR dla transgenicznych linii arakiis RNAi-288-72 i RNAi-288-74, rośliny pozytywne. Kontrole: W (woda), PP (roślina pozytywna), MM (master mix), p (plazmid p5XCAPD); frakcje 1/2  1/4 1/8 1/16 reprezentują 2-krotne rozcieńczenia DNA. Dół: Detekcja ekspresji wstawki RNAi metodą Real-Time PCR (zestawy starterów: RT_5X_1, RT_5X_2, jak w Rycini 1, na niedojrzałych (żółtych) i dojrzałych (brązowych) kotyledonach linii transgenicznych po 24 i 48 h inkubacji; szara linia: CT = 1. Histogramy przedstawiają średnie i słupki błędu standardowego (T) z trzech próbek biologicznych z trzema powtórzeniami technicznymi. Ilościowa analiza wstawki RNAi została znormalizowana względem genu gospodarza Actin jako kontroli wewnętrznej, a porównawkowy poziom ekspresji transgenu obliczono zgodnie z opisem w punktach 5.2.2 i 5.3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Aby przetestować skuteczność potencjalnej kontroli akumulacji aflatoksyn za pomocą RNAi pośredniczonej przez roślinę-gospodarza, świeżo zebrane konidia Aspergillus flavus NRRL 3357 naniesiono na powierzchnię cięcia połówek liścic lędźwiowych, z których usunięto embriony i łupiny (Ryc. 3, 4). Szczep A. flavus NRRL 3357, którego genom został zsekwencjonowany i posłużył jako podstawa do zaprojektowania p5XCAPD, został uprzejmie udostępniony przez dr. Horna z USDA-ARS-NPRL. Wynikową inwazję grzybową połówek liścic po 24, 48 i 72 h w 30 °C przedstawiono na Ryc. 4. Próbki inokulowanych połówek liścic pobierano po 24, 48, 72 i 96 h inkubacji i analizowano pod kątem czterech głównych aflatoksyn B1, B2, G1 oraz G2 przy użyciu UPLC, a następnie potwierdzono wyniki metodą LC-MS; wyniki przedstawiono na Ryc. 6. Stężenia aflatoksyn określono przy użyciu opublikowanej metody z modyfikacjami 36. Po 96 h inkubacji liścice zaczynają ulegać rozpadowi z powodu infekcji grzybiczej. Linia RNAi 288-72 wykazała znacznie niższe poziomy aflatoksyn niż kontrola we wszystkich terminach pobierania próbek w niedojrzałych liścicach oraz w większości terminów w liścicach dojrzałych. Linia RNAi 288-74 wykazała znacznie niższe poziomy aflatoksyn w większości terminów pobierania próbek. Poziomy istotności testu Tukeya zaznaczono gwiazdkami na wykresie na Ryc. 7.

figure-results-3
Rysunek 7. Aflatoksyny B1 i B2 w połowach kotyledonów orzeszków ziemnych po inkubacji (24, 48, 72 i 96 h) z Aspergillus flavus. Kontrola: nasiona linii nietransgenicznej 288-9; RNAi: nasiona z linii RNAi-288-72 i RNAi-288-74, transgeniczne dla RNAi p5XCAPD w celu wyciszenia pięciu genów syntezy aflatoksyn. (A) Aflatoksyna B1 w nasionach dojrzałych (brązowe); (B) aflatoksyna B2 w nasionach dojrzałych; (C) aflatoksyna B1 w nasionach niedojrzałych (żółte) i (D) aflatoksyna B2 w nasionach niedojrzałych. Przedstawiono wartości średnie wraz z odpowiednimi słupkami błędów standardowych (T) dla prób biologicznych wykonanych w dubletach. Różnice statystycznie istotne według testu Tukey'a *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Ogólnie rzecz biorąc, RNAi-288-72 wykazał w trakcie całego eksperymentu (inkubacja od 24 do 96 h) redukcję aflatoksyny B2 o 94%-100% oraz redukcję aflatoksyny B1 o 90%-100% w porównaniu z kontrolą. RNAi-288-74 wykazał redukcję aflatoksyny B2 o 63%-100% oraz redukcję aflatoksyny B1 o 60%-100%, Rycina 7.

Startery użyte do detekcji ekspresji insertu RNAi metodą Real-Time PCR przedstawiono na Rysunku 1. Analizie poddano kotyledony nasion ziemniaka bez embrionów, aby wyeliminować ich naturalne mechanizmy obronne i umożliwić wykrycie potencjalnego efektu RNAi w obszarze najbardziej narażonym na inwazję grzybów, czyli w kotyledonach. Ekspresja insertu RNAi wykryta w niedojrzałych kotyledonach (żółtych) linii 288-74 za pomocą zestawu starterów RT_5X_1 była czterokrotnie wyższa niż próg CT=1 kontroli negatywnej, a za pomocą zestawu starterów RT_5X_2 była 19-krotnie wyższa od progu, przy inkubacji przez 24 hr. Za pomocą RT-PCR wykryto co najmniej trzy z pięciu kolejnych fragmentów genów użytych w transformacji ziemniaka: 5027, 7223 i 7228 (odpowiednio aflep, aflS/aflJ oraz aflC/pksA) (Rysunek 1, 6). Ekspresji insertu RNAi nie wykryto w dojrzałych kotyledonach po 24 hr, ani w dojrzałych lub niedojrzałych kotyledonach po 48 hr inkubacji, Rysunek 6 (dół).

Linia arakidowaCzas pobierania próbekPróbki do RT-PCRPróbki do analizy aflatoksyn (inokulowane)Liczba nasion
(nieinokulowane)
Powt. 1Powt. 2Powt. 3Powt. 1Powt. 2Powt. 3
RNAi (żółta)24 hr1111114.5
48 hr111111
72 hr111111
Kontrola24 hr1111114.5
(żółta)48 hr111111
72 hr111111

Tabela 2. Przykład układu dla małej próby do analizy ekspresji genów i akumulacji aflatoksyn w nasionach arahisowej poddanych RNAi. Pełna analiza ekspresji i aflatoksyn dla jednej grupy dojrzałości (tj. żółtej), w trzech punktach czasowych pobierania próbek (24, 48 i 72 h), w trzech powtórzeniach, wymagałaby 4,5 nasiona; każda liczba w tabeli reprezentuje półtorej kotyledonu.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano wyciszanie genów w patogenach grzybowych za pośrednictwem RNAi gospodarza roślinnego 27,43, jednak nie ma publikacji wskazujących na wykonalność kontroli akumulacji mikotoksyn w roślinach za pośrednictwem RNAi. Jednym z czynników ograniczających te badania na orzeszkach ziemnych był brak metody oceny fenotypu akumulacji aflatoksyn w poszczególnych roślinach, ponieważ liście nie wykazują żadnych objawów po infekcji grzybiczej podziemnych strąków. Ponadto akumulacja aflatoksyn o innym rozkładzie nienormalnie oraz potrzeba pobierania dużych próbek do analizy chemicznej 15,16 utrudniły ilościowe określenie potencjalnego wpływu RNAi na pojedynczą roślinę. Przedstawiona tutaj metoda składa się z 72-godzinnych eksperymentów z wykorzystaniem pięciu nasion w celu wykonania trzech potrójnych próbek w odstępach 24-godzinnych (Tabela 1, Rysunek 7). W porównaniu z typową analizą aflatoksyny, która wymaga nie mniej niż 100 g nasion, nasza metoda jest szczególnie odpowiednia dla indywidualnych zdarzeń transgenicznych roślin orzeszków ziemnych, które początkowo wytwarzają nie więcej niż dwa lub trzy strąki.

Wyciszanie syntezy aflatoksyn za pośrednictwem RNA wykazano poprzez genetyczną transformację Aspergillus flavus i A. parasiticus. Ponieważ aflR jest głównym regulatorem produkcji aflatoksyn u A. flavus i A. parasiticus44,45, staje się interesującym celem wyciszania za pośrednictwem RNA w roślinach. Jednak genetyczne różnice w aflR wykazano wśród gatunków Aspergillus 46, a te warianty genetyczne mogą uniknąć wyciszenia, jeśli nie ma idealnej sekwencji pasującej do sygnału RNAi wytwarzanego w gospodarzu rośliny. Tak więc aflR był jednym z celów do wyciszenia w wektorze p5XCAPD, ale nie jedynym. Odwrócone powtórzenia genu aflR wprowadzone do A. flavus i A. parasiticus w drodze transformacji skutkowały wyciszeniem i minimalną lub żadną produkcją aflatoksyn 47 (McDonald i wsp., 2005b). Ponadto wyciszenie genu aflD zapobiegło wytwarzaniu aflatoksyn nawet o 98% u A. flavus i A. parasiticus w bezpośredniej transformacji 48. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo sukcesu w naszym systemie, orzeszki ziemne zostały przekształcone z odwróconymi powtórzeniami fragmentów pięciu genów zaangażowanych w produkcję aflatoksyny u A. flavus. Tutaj pokazano, że przy użyciu p5XCAPD, który ma na celu wyciszenie kilku genów w szlaku syntezy aflatoksyny, osiągnięto o 90%-100% niższe poziomy aflatoksyny B1 i B2 w linii 288-72 i o 60-100% niższe poziomy skumulowane w linii 288-74 w porównaniu z kontrolą, gdy półliścienie zostały zaszczepione A. flavus, Ryc. 4, 7. Co najważniejsze, metoda ta wykryła statystycznie istotne różnice w akumulacji aflatoksyny według linii 288-72, 288-74 w porównaniu z kontrolą w całym eksperymencie poprzez zastosowanie statystyki parametrycznej, Rysunek 7. Biorąc pod uwagę mały rozmiar próby, ważne jest, aby podkreślić potrzebę użycia potężnej metody wykrywania aflatoksyn, eksperymenty te zostały przeanalizowane przez UPLC, który ma wysoką rozdzielczość, pięciokrotnie wyższą wydajność i trzykrotnie wyższą czułość niż HPLC 49.

Ekspresję wstawki RNAi w 288-74 wykryto tylko w niedojrzałych liścieniach (żółtych) po 24 godzinach inkubacji. Inserta RNAi nie została wykryta przez RT-PCR na dojrzałych liścieniach 288-74 po 24 godzinach, ani w żadnej grupie dojrzałości po 48 godzinach, Figura 6. To samo zjawisko zaobserwowano w innych transgenicznych liniach RNAi orzeszków ziemnych (Arias, R.S., 2015 niepublikowane), gdzie zwykle transkrypty RNAi wykrywano tylko na niedojrzałych liścieniach po 24 godzinach. Próbki RNA traktowano DNAzą przed syntezą cDNA, dane znormalizowano do poziomu ekspresji aktyny i nie zaobserwowano dowodów na zanieczyszczenie DNA. Gdyby DNA było obecne w próbkach, powinno zostać wykryte również w próbkach z 48 godzin, ale konsekwentnie tak nie było. Ekspresja pod kontrolą promotora 35S nie zawsze jest jednolita; Wpływ na nią mogą mieć warunki środowiskowe 50, rodzaj tkanki i stadium rozwojowe 51,52. Jednocześnie, w szlaku interferencji RNA, szybkość rozpadu mRNA i szybkość rozpadu siRNA mogą się znacznie różnić 53. Możliwe, że szybka degradacja mRNA przez mechanizm interferencji RNA mogła zapobiec wykryciu mRNA po 48 godzinach inkubacji. To, czy brak ekspresji w 48 godzinach był spowodowany niską transkrypcją sterowaną promotorem 35S, czy szybką degradacją dsRNA przez Dicer, pozostaje bez odpowiedzi. W związku z tym wykrywanie małych RNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości dałoby lepszy wgląd w procesy zachodzące za pośrednictwem RNAi 54 w tych eksperymentach. Ponieważ jednak wyciszanie RNA rozprzestrzenia się ogólnoustrojowo, głównie przez łyko ze źródeł fotosyntezy do pochłaniaczy sacharozy (w tym przypadku nasion orzeszków ziemnych) 55, wyciszenie syntezy aflatoksyny może wystąpić w nasionach bez lokalnej ekspresji insertu RNAi. Pozostaje jeszcze wiele badań do wykonania, aby określić poziom progowy małych interferujących RNA (siRNA) niezbędnych do zapobiegania akumulacji aflatoksyn w nasionach. Ważne jest, aby podkreślić fakt, że zarówno ekspresja mRNA konstruktu RNAi (ryc. 6), jak i akumulacja aflatoksyn B1 i B2 (ryc. 7) wykazały różne wyniki dla niedojrzałych (żółtych) i innych. dojrzałe (brązowe) liścienie. Rośliny orzeszków ziemnych mają nieokreślony wzrost, to znaczy podczas zbiorów prezentują szereg strąków o dojrzałości, ryc. 2. Ponadto nasiona z różnych grup dojrzałości różnią się składem chemicznym, np. 2,4% sacharozy w nasionach niedojrzałych i 1,9% w nasionach dojrzałych w tych samych warunkach polowych 56,57. Dlatego, aby zrozumieć rzeczywistą skuteczność kontroli akumulacji aflatoksyny za pośrednictwem RNA, ważne jest, aby oddzielnie analizować grupy dojrzałości.

Naturalną obroną nasion orzeszków ziemnych jest produkcja fitoaleksyn, która różni się różnorodnością wytwarzanych związków i ich względnymi ilościami w zależności od dojrzałości nasion i warunków środowiskowych 58-61, a jest szczególnie wyższa w zarodkach w porównaniu z liścieniami 62. Zarodki mają również znacznie wyższe stężenia kwasów nukleinowych, zarówno DNA, jak i RNA, niż liścienie (Arias R.S., niepublikowane). W miarę dojrzewania nasion orzeszków ziemnych zachodzą zmiany w ich fizjologii i składzie chemicznym 63. Przeciwutleniacze fenolowe w testach orzeszków ziemnych tworzą skondensowane taniny o działaniu fungistatycznym 64; Jest to również widoczne w kolorze mezokarpu, który odzwierciedla etapy dojrzałości, od żółtego do czarnego 35, ponieważ zawartość garbników i związków fenolowych wzrasta wraz z dojrzałością 65. Tak więc obecność jąder lub zarodków w eksperymencie, biorąc pod uwagę ich właściwości przeciwdrobnoustrojowe, mogła ograniczyć wzrost grzybów, a tym samym przeszacować efekt wyciszenia RNAi, dlatego zostały one usunięte. Ponadto usunięcie jądra i zarodków pomaga ograniczyć źródła zmienności w analizie, ponieważ pół liścienia, która przenosi zarodek, będzie miała więcej fitoaleksyn i większą zawartość RNA.

Oprócz analizy według grup dojrzałości i usuwania jądra i zarodka w tych eksperymentach, ważne jest, aby zwrócić uwagę na kilka dodatkowych obserwacji: a) chociaż wyniki są wyświetlane dla inkubacji do 96 godzin, zaleca się użycie nie więcej niż 72 godzin, aby uzyskać spójne wyniki, ponieważ nasiona ulegają degradacji przez 96 godzin; oraz b) mając na uwadze, że połówki liścieni z tego samego nasiona, mimo że pobierane są losowo, nie stanowią całkowicie niezależnych próbek, akumulacja RT-PCR i aflatoksyny w obrębie zdarzeń transgenicznych wykazała minimalne różnice między nasionami. Ważne jest również, aby upewnić się, że kiełkujące zarodniki są wystawione na działanie tkanki roślinnej, objętość inokulum wynosząca 2 μl i nałożenie zarodników na powierzchnię cięcia liścieni, unikając kapania na boki. Woda/agar na płytkach powinna mieć temperaturę 1,5% (w/v), bardziej miękki agar powoduje spływ zarodników, jak pokazano na ostatniej ramce rysunku 4 (na dole). Jeśli dostępność nasion z danego zdarzenia transgenicznego jest ograniczona, pobieranie próbek można wykonać w dwóch egzemplarzach, a nie trzykrotnie, uzyskując podobne wyniki (tj. Ryc. 7); Jednak trzykrotne próbki pomogą zmniejszyć błąd standardowy. Jedynym ograniczeniem tej metody jest to, że wymaga ona wysoce czułego systemu (UPLC) do wykrywania/oznaczania ilościowego aflatoksyn, ale jednocześnie zmniejsza to prawdopodobieństwo przeszacowania wpływu RNAi, jeśli aflatoksyny nie zostaną wykryte mniej czułymi metodami.

Podsumowując, metoda ta po raz pierwszy oferuje wiarygodne podejście do badania wpływu RNAi na kontrolę aflatoksyn. Skracając czas eksperymentu z całego sezonu upraw do mniej niż jednego tygodnia, metoda ta ogromnie przyspieszy badania nad patosystemem RNAi-orzeszków ziemnych/Aspergillus w kierunku łagodzenia i/lub eliminacji aflatoksyn.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca otrzymała wsparcie finansowe od projektu USDA-ARS CRIS 6604-21000-004-00D, projektu CRIS 6604-42000-008-00D oraz umowy programu USAID Feed-the-Future numer 58-0210-3-012. Dziękujemy Valerie Orner, LaTanyi Johnson, Josephowi Powellowi i Kathy Gray za ich pomoc techniczną. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tym artykule służy wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa USA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Startery, oligonukleotydyDNA Technologies, Coralville, IA, USAn/a
Dneasy Plant Mini KitQiagen, Walencja, CA69106
Czapek Dox agar mediumOxoid, firmy Thermo Fisher Scientific, Waltham, MACM0095
AgarThermo Fisher Scientific, Waltham, MABP 1423
Zamrażarka -80  ° Cn/anie dotyczy
Tlenek glinu, Al2O3Fisher ScientificA941
SPE Zbiorniki 1,5 mlGrace Davison Discovery Scientific210011
Fryty do 1,5 ml SPEGrace Davison Discovery Scientific211401
Fiolki do automatycznego pobierania próbekWaters Corporation, Milford, Massachusetts
Przyrząd do ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) firmy Waters Acquity; UPLC-Klasa H Czwartorzędowy menedżer rozpuszczalników; Menedżer próbek UPLC; UPLC Detektor fluorescencyjny (FLR); UPLC BEH C18 2.1  mm x 50  mm, 1,7  kolumna mmWaters Corporation, Milford, MA
Spektrometr masowy pułapki jonowej Finnigan LCQ Advantage MAX, z oprogramowaniem Xcalibur w wersji 1.4Thermo Electron Corp., San Jose, CA
Standardy aflatoksyny, B1, B2, G1 oraz G2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOA6636; A9887; A0138; A0263
Systat Software 12.2SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA
Odczynnik TrizolInvitrogen, CA15596-018
SuperScript III Synteza pierwszej nici Super MixInvitrogen, CA11752-050
ABI 7500 Real-Time PCRLifetechnologies, Grand Island, Nowy Jork4406984
Luria Broth-MillerFisher ScientificR453642
pENTR1AInvitrogen, CAA10462
LR Clonase II Mieszanka enzymówInvitrogen, CA11791-020
T4 Ligaza DNANEB BiolabsM0202L
GelriteSigma-Aldrich, St. Louis, MOG1919
AcetosyringoneSigma-Aldrich, St. Louis, MOD134406
Stacja robocza robota QIAcubeQiagen, Walencja, CA9001292
Antybiotyki: kanamycyna, cefotaksym, gentamycyna; streptomycynaGoldbio, St. Louis, MOcef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; paciorkowce: S-150-50
Platinum Taq DNA Polymerase High FidelityInvitrogen, CA11304-029
186005221

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Williams, J. H., et al. Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions. The American Journal of Clinical Nutrition. 80, 1106-1122 (2004).
  2. American Association for Cancer Research: AACR. An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20. Cancer Research. 40, 1-12 (1980).
  3. Turner, P. C. The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth. Scientifica. , (2013).
  4. Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells. Toxins (Basel). 5, 1447-1461 (2013).
  5. Gong, Y. Y., et al. Determinants of aflatoxin exposure in young children from Benin and Togo, West Africa: the critical role of weaning. International Journal of Epidemiology. 32, 556-562 (2003).
  6. Eaton, D. L., Groopman, J. D. The toxicology of aflatoxins: human health, veterinary, and agricultural significance. , Academic Press. (1994).
  7. Murugavel, K. G., et al. Prevalence of aflatoxin B1 in liver biopsies of proven hepatocellular carcinoma in India determined by an in-house immunoperoxidase test. Journal of Medical Microbiology. 56, 1455-1459 (2007).
  8. Wang, J. S., et al. Hepatocellular carcinoma and aflatoxin exposure in Zhuqing Village, Fusui County, People's Republic of China. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 10, American Association for Cancer Research. 143-146 (2001).
  9. Azziz-Baumgartner, E., et al. Case-control study of an acute aflatoxicosis outbreak, Kenya, 2004. Environmental Health Perspectives. 113, 1779-1783 (2005).
  10. Lye, M. S., Ghazali, A. A., Mohan, J., Alwin, N., Nair, R. C. An outbreak of acute hepatic encephalopathy due to severe aflatoxicosis in Malaysia. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 53, 68-72 (1995).
  11. Villers, P. Aflatoxins and safe storage. Frontiers in Microbiology. 5, 158(2014).
  12. Kensler, T. W., Roebuck, B. D., Wogan, G. N., Groopman, J. D. Aflatoxin: A 50-year odyssey of mechanistic and translational toxicology. Toxicological Sciences. 120, S28-S48 (2011).
  13. Dorner, J. W., Cole, R. J., Wicklow, D. T. Aflatoxin reduction in corn through field application of competitive fungi. Journal of Food Protection. 62, 650-656 (1999).
  14. Cotty, P. J., Bhatnagar, D. Variability among atoxigenic Aspergillus flavus strains in ability to prevent aflatoxin contamination and production of aflatoxin biosynthetic-pathway enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2248-2251 (1994).
  15. Whitaker, T. B. Standardisation of mycotoxin sampling procedures: an urgent necessity. Food Control. 14, 233-237 (2003).
  16. Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots. Peanut Science. 31, 59-63 (2004).
  17. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  18. Rafael, D., et al. EMT blockage strategies: Targeting Akt dependent mechanisms for breast cancer metastatic behaviour modulation. Current Gene Therapy. , (2015).
  19. Li, G., Chang, H., Zhai, Y. P., Xu, W. Targeted silencing of inhibitors of apoptosis proteins with siRNAs: a potential anti-cancer strategy for hepatocellular carcinoma. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention: APJCP. 14, 4943-4952 (2013).
  20. Koldehoff, M. Targeting bcr-abl transcripts with siRNAs in an imatinib-resistant chronic myeloid leukemia patient: challenges and future directions. Methods in Molecular Biology. 1218, 277-292 (2015).
  21. Zhang, J., et al. Pest control. Full crop protection from an insect pest by expression of long double-stranded RNAs in plastids. Science. 347, 991-994 (2015).
  22. Ajjappala, H., Chung, H. Y., Sim, J. S., Choi, I., Hahn, B. S. Disruption of prefoldin-2 protein synthesis in root-knot nematodes via host-mediated gene silencing efficiently reduces nematode numbers and thus protects plants. Planta. 241, 773-787 (2015).
  23. Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annual Review of Genetics. 41, 305-330 (2007).
  24. Vazquez, F., Hohn, T. Biogenesis and biological activity of secondary siRNAs in plants. Scientifica. , Hindawi Publishing Corporation. (2013).
  25. Tinoco, M. L. P., Dias, B. B. A., Dall'Astta, R. C., Pamphile, J. A., Aragao, F. J. L. In vivo trans-specific gene silencing in fungal cells by in planta expression of a double-stranded RNA. BMC Biology. 8, (2010).
  26. Govindarajulu, M., Epstein, L., Wroblewski, T., Michelmore, R. W. Host-induced gene silencing inhibits the biotrophic pathogen causing downy mildew of lettuce. Plant Biotechnology Journal. , (2014).
  27. Yin, C., Jurgenson, J. E., Hulbert, S. H. Development of a host-induced RNAi system in the wheat stripe rust fungus Puccinia striiformis f. sp. tritici. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24, 554-561 (2011).
  28. Ghag, S. B., Shekhawat, U. K., Ganapathi, T. R. Host-induced post-transcriptional hairpin RNA-mediated gene silencing of vital fungal genes confers efficient resistance against Fusarium. wilt in banana. Plant Biotechnology Journal. 12, 541-553 (2014).
  29. Filichkin, S. A., et al. Efficiency of gene silencing repeats vs. transitive RNAi in Arabidopsis: direct inverted vectors. Plant Biotechnology Journal. 5, 615-626 (2007).
  30. Sciaky, D., Montoya, A. L., Chilton, M. D. Fingerprints of Agrobacterium Ti Plasmids. Plasmid. 1, 238-253 (1978).
  31. Clark, D. J., Maaloe, O. DNA Replication and Division Cycle in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 23, 99-112 (1967).
  32. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plantarum. 15, 473-497 (1962).
  33. Srinivasan, T., Kumar, K. R. R., Kirti, P. B. Establishment of efficient and rapid regeneration system for some diploid wild species of Arachis. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 101, 303-309 (2010).
  34. Gomes, A. L. V., et al. Single-tube nested PCR using immobilized internal primers for the identification of dengue virus serotypes. Journal of Virology Methods. 145, 76-79 (2007).
  35. Williams, E. J., Drexler, J. S. A non-destructive method for determining peanut pod maturity. Peanut Science. 8, 134-141 (1981).
  36. Sobolev, V. S., Dorner, J. W. Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography. Journal of AOAC International. 85, 642-645 (2002).
  37. Empower Software, Getting Started Guide. , Waters Corporation. Milford, MA. Available from: http://sites.chem.colostate.edu/diverdi/C431/experiments/high%20pressure%20liquid%20chromatography/references/Empower%20getting%20started%2071500031203rA.pdf (2002).
  38. Biselli, S., Hartig, L., Wegner, H., Hummert, C. Analysis of Fusarium. toxins using LC-MS-MS: Application to various food and feed matrices. LC GC North America. 23, 404-413 (2005).
  39. Arias, R. S., Sobolev, V. S., Orner, V. A., Dang, P. M., Lamb, M. C. Potential involvement of Aspergillus flavus laccases in peanut invasion at low water potential. Plant Pathology. 63, 353-363 (2014).
  40. Dang, P. M., Chen, C. Y., Holbrook, C. C. Evaluation of five peanut (Arachis hypogaea) genotypes to identify drought responsive mechanisms utilising candidate-gene approach. Functional Plant Biology. 40, 1323-1333 (2013).
  41. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C-T method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
  42. Amaike, S., Keller, N. P. Aspergillus flavus. Annual Review of Phytopathology. 49, 107-133 (2011).
  43. Nowara, D., et al. HIGS: Host-induced gene silencing in the obligate biotrophic fungal pathogen Blumeria graminis. Plant Cell. 22, 3130-3141 (2010).
  44. Woloshuk, C. P., et al. Molecular characterization of aflR, a regulatory locus for aflatoxin biosynthesis. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2408-2414 (1994).
  45. Price, M. S., et al. The aflatoxin pathway regulator AflR induces gene transcription inside and outside of the aflatoxin biosynthetic cluster. FEMS Microbiology Letters. 255, 275-279 (2006).
  46. Ehrlich, K. C., Montalbano, B. G., Cotty, P. J. Sequence comparison of aflR from different Aspergillus. species provides evidence for variability in regulation of aflatoxin production. Fungal Genetics and Biology. 38, 63-74 (2003).
  47. McDonald, T., Brown, D., Keller, N. P., Hammond, T. M. RNA silencing of mycotoxin production in Aspergillus and Fusarium species. Molecular Plant Microbe Interactions. 18, 539-545 (2005).
  48. Abdel-Hadi, A. M., Caley, D. P., Carter, D. R., Magan, N. Control of aflatoxin production of Aspergillus flavus. and Aspergillus parasiticus. using RNA silencing technology by targeting aflD. (nor-1) gene. Toxins (Basel). 3, 647-659 (2011).
  49. Swartz, M. E. Ultra performance liquid chromatography (UPLC): An introduction: Separation Science Redefined. LCGC North America. , Suppl ement 8. 8-14 (2005).
  50. Maghuly, F., Khan, M. A., Fernandez, E. B., Druart, P., Watillon, B., Laimer, M. Stress regulated expression of the GUS-marker gene (uidA) under the control of plant calmodulin and viral 35S promoters in a model fruit tree rootstock: Prunus incisa x serrula. Journal of Biotechnology. 135, 105-116 (2008).
  51. de Mesa, M. C., Santiago-Doménech, N., Pliego-Alfaro, F., Quesada, M. A., Mercado, J. A. The CaMV 35S promoter is highly active on floral organs and pollen of transgenic strawberry plants. Plant Cell Reports. 23, 32-38 (2004).
  52. Sunilkumar, G., Mohr, L., Lopata-Finch, E., Emani, C., Rathore, K. S. Developmental and tissue-specific expression of CaMV 35S promoter in cotton as revealed by GFP. Plant Molecular Biology. 50, 463-474 (2002).
  53. Groenenboom, M. A. C., Maree, A. F. M., Hogeweg, P. The RNA silencing pathway: The bits and pieces that matter. PLoS Computational Biology. 1, 155-165 (2005).
  54. Zhao, D., Song, G. Q. High-throughput sequencing as an effective approach in profiling small RNAs derived from a hairpin RNA expression vector in woody plants. Plant Science: an International Journal of Experimental Plant Biology. 228, 39-47 (2014).
  55. Kamthan, A., Chauduri, A., Kamthan, M., Datta, A. Small RNAs in plants: recent development and application for crop improvement. Frontiers in Plant Science. 6, 208(2015).
  56. Manda, A., Bodapati, P. N., Rachaputi, N. C., Wright, G., Fukai, S. Aflatoxins and their relationship with sugars in peanut (Arachis hypogaea L). 4th International Crop Science Congress, 2004, , Available from: http://www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/5/1/3/625_manda.htm (2004).
  57. Uppala, S. S. Factors affecting pre-harvest aflatoxin contamination of peanut (Arachis hypogaea L). , Auburn University. (2011).
  58. Sobolev, V. S. Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56, 1949-1954 (2008).
  59. Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55, 2195-2200 (2007).
  60. Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57, 62-68 (2009).
  61. Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts. Mycopathologia. 105, 117-128 (1989).
  62. Sobolev, V. S. Production of phytoalexins in peanut (Arachis hypogaea) seed elicited by selected microorganisms. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 1850-1858 (2013).
  63. Basha, S. M. M., Cherry, J. P., Young, C. T. Changes in free amino acids, carbohydrates, and proteins of maturing seeds from various peanut (Arachis hypogaea L.) cultivars. Cereal Chemistry. 53, 586-596 (1976).
  64. Lansden, J. A. Aflatoxin inhibition and fungistasis by peanut tannins. Peanut Science. 9, 17-20 (1982).
  65. Yen, G. C., Duh, P. D., Tsai, C. L. Relationships between antioxidant activity and maturity of peanut hulls. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 41, 67-70 (1993).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kontrola aflatoksyn za pomoc RNAioznaczanie ilo ciowe aflatoksyny B1transgeniczne nasiona arakiidoweinokulacja Aspergillus flavusultrawydajna chromatografia cieczowaanaliza Real time PCRsekwencjonowanie ma ych RNAsterylizacja powierzchni nasiontechnika usuwania zarodkaocena redukcji mikotoksyn

Powiązane artykuły