Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz

Podsumowanie

Przyczepienie się bakterii do komórek gospodarza jest kluczowym krokiem podczas kolonizacji i infekcji gospodarza. Protokół ten opisuje wytwarzanie rekombinowanych adhezyn sprzężonych z polimerami jako materiałów biomimetycznych, które umożliwiają analizę udziału poszczególnych adhezyn w tych procesach, niezależnie od innych czynników bakteryjnych.

Streszczenie

Przyczepienie się bakterii do komórek gospodarza jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń podczas kolonizacji bakteryjnej tkanek gospodarza, a tym samym kluczowym krokiem podczas infekcji. Biochemiczna i funkcjonalna charakterystyka adhezyn pośredniczących w tych początkowych interakcjach bakteria-gospodarz jest często zagrożona przez obecność innych czynników bakteryjnych, takich jak składniki ściany komórkowej lub wydzielane cząsteczki, które zakłócają analizę. Protokół ten opisuje produkcję i stosowanie materiałów biomimetycznych, składających się z czystych rekombinowanych adhezyn sprzężonych chemicznie z dostępnymi na rynku, funkcjonalizowanymi kulkami polistyrenu, które zostały z powodzeniem wykorzystane do analizy biochemicznych i funkcjonalnych interakcji między poszczególnymi adhezynami bakteryjnymi a receptorami komórek gospodarza. Omówiono również protokoły dla różnych substancji chemicznych sprzęgających, umożliwiające kierunkowe unieruchomienie rekombinowanych adhezyn na rusztowaniach polimerowych oraz do oceny skuteczności sprzęgania powstałych materiałów "bakteriomimetycznych". Dalej opisujemy, w jaki sposób materiały te mogą być wykorzystywane jako narzędzie do hamowania cytotoksyczności zależnej od patogenów oraz omawiamy zakres, ograniczenia i dalsze zastosowania tego podejścia w badaniu interakcji bakteria-gospodarz.

Wprowadzenie

Analiza interakcji między adhezynami bakteryjnymi a receptorami na powierzchni gospodarza na styku gospodarz-patogen jest niezbędnym krokiem w kierunku zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw adhezji bakteryjnej. Ostatecznie pomoże nam to zidentyfikować strategie zakłócania tych procesów podczas infekcji. Prowadząc takie badania, często stajemy przed dylematem: biochemiczna i biofizyczna analiza molekularnych mechanizmów wiązania adhezyny wymaga ich oddzielenia od innych składników ściany komórkowej, co może zakłócać zdarzenia adhezyjne. Z drugiej strony, zastosowanie rekombinowanych rozpuszczalnych białek nadmiernie upraszcza zdarzenie adhezji, pomijając zakotwiczenie białka w ścianie komórkowej bakterii i wielowartościowość wiązania osiągniętą poprzez wyświetlanie powierzchni bakteryjnej. Podobnie, z perspektywy komórki gospodarza, napotkanie i związanie się z pojedynczymi cząsteczkami adhezyny nie zawsze ma taki sam wpływ pod względem organizacji błony plazmatycznej, płynności błony i grupowania receptorów¹, co ostatecznie utrudnia ocenę wpływu adhezji na sygnalizację komórkową gospodarza i wynik interakcji bakteria-gospodarz.

Niedawno opracowano metodę, dzięki której rekombinowane oczyszczone adhezyny lub fragmenty adhezyny są kierunkowo i kowalencyjnie sprzężone z cząsteczkami polimeru o rozmiarach podobnych do bakterii, naśladując w ten sposób wyświetlanie powierzchni bakteryjnej. Podejście to zastosowano w przypadku szeregu różnych adhezyn, od Gram-ujemnych wielowartościowych cząsteczek adhezyjnych (MAM)^{2, 3} do adhezyn Gram-dodatnich, w tym białka wiążącego fibronektynę Staphylococcus aureus (FnBPA)^{4, 5} i Streptococcus pyogenes F1 ^{6, 7}. Metoda ta pozwoliła na rozbiór fragmentów adhezyny ważnych dla wiązania komórek gospodarza, identyfikację receptorów powierzchniowych gospodarza i określenie ich zachowania na powierzchni komórki gospodarza, biorąc pod uwagę zarówno powinowactwo wiązania, jak i awidność ^{1, 8}. Ponadto podejście to zostało wykorzystane do zbadania skuteczności unieruchomionych adhezyn i pochodnych jako inhibitorów interakcji gospodarz-patogen ^{8, 9}. Wykazano, że sprzężone powierzchniowo pochodne wielowartościowej cząsteczki adhezyjnej (MAM) 7 Vibrio parahaemolyticus mogą być stosowane do łagodzenia szeregu zakażeń bakteryjnych in vitro, w tym tych wywoływanych przez patogeny wielolekooporne, takie jak Acinetobacter baumannii i oporny na metycylinę S. aureus (MRSA) ^{7, 9}.

Tutaj opisujemy różne substancje chemiczne, które mogą być użyte do unieruchomienia adhezyn do dostępnych na rynku funkcjonalizowanych cząstek polistyrenu. Ze względu na szeroki wachlarz dostępnych funkcji powierzchniowych, etykiet i wielkości cząstek, są one użytecznym rusztowaniem do produkcji materiałów bakteriomimetycznych do badania interakcji adhezyna-gospodarz. Dalej opisujemy metody wstępnej charakterystyki reakcji sprzęgania oraz obliczania ważnych właściwości otrzymanych materiałów. Na koniec omówiono zastosowanie adhezyn sprzężonych z koralikami jako konkurencyjnych inhibitorów zakażeń bakteryjnych in vitro jako przykład ich zastosowania, a także przyszły zakres i ograniczenia tego podejścia.

Protokół

1. Chemiczne sprzężenie białek z kulkami polimerowymi

1. Kierunkowe sprzężenie tiolowo-aminowe
   Uwaga: Protokół ten jest odpowiedni do sprzęgania białek zawierających cysteinę z kulkami polimerowymi funkcjonalizowanymi aminami, przy użyciu 4-(p-maleimidofenylo)maślanu sulfosukcynimidylu (Sulfo-SMPB) jako środka sieciującego (Figura 1).
   
   Rysunek 1. Strategia sieciowania stosowana do kierunkowego sprzężenia tiolowo-aminowego białek z kulkami polimerowymi. Kulki polistyrenowe modyfikowane aminami są aktywowane Sulfo-SMPB. Maleimid reaguje z wolnymi cysteinami, aby kierunkowo sprzęgnąć białka z kulkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
   1. Przygotowanie odczynników:
      1. Przygotować PBS (100 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,0) i autoklaw.
      2. Przygotować 100-krotny zapas (0,5 M lub 287 mg/ml w PBS) TCEP (tris(2-karboksyetylo)fosfiny) bezpośrednio przed użyciem.
      3. Przygotować 5x zapas (10 mM lub 4,58 mg/ml w dH₂O) Sulfo-SMPB bezpośrednio przed użyciem.
      4. Przygotuj 10x zapas (500 mM lub 88 mg/ml w PBS, pH 7,0) cysteiny bezpośrednio przed użyciem.
   2. Aktywacja koralików:
      1. Wymieszać zawiesinę z granulkami, delikatnie odwracając i przenieść wymaganą ilość zawiesiny kulek (np. 12 ml) do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml sterylnego PBS o pH 7,0.
      2. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby umyć kulki i granulki przez odwirowanie w mikrowirówce (2 minuty przy 16 000 x g).
      3. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i wyrzucić. Zawiesić granulkę w 1 ml świeżego sterylnego PBS i powtórzyć etap mycia. Zawiesić granulkę w 0,8 ml PBS.
      4. Dodać 200 ml świeżo przygotowanych 10 mM Sulfo-SMPB, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM.
      5. Inkubować zawiesinę kulki przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C na obracającym się kole.
   3. Redukcja białka:
      1. W okresie inkubacji etapu aktywacji należy przygotować białko do następnego etapu sprzęgania, aby można je było natychmiast dodać do aktywowanych kulek.
         Uwaga: Chociaż ten etap redukcji nie zawsze jest wymagany w przypadku białek fuzyjnych GST (S-transferazy glutationowej), zaleca się zapewnienie wysokiej wydajności sprzężenia.
         1. Sprawdź stężenie białka i dostosuj je do końcowego stężenia wymaganego w reakcji sprzęgania. Uwaga: Zwykle stosuje się 6 mM białka w PBS i objętość 1 ml.
         2. Dodaj materiał TCEP, aby uzyskać końcowe stężenie 5 mM. Inkubować roztwór przez 30 minut w temperaturze RT.
            Uwaga: Mieszanina reakcyjna może być bezpośrednio użyta do następującej reakcji sprzęgania.
         3. Zachować niewielką ilość (kilka ml) roztworu białkowego w celu określenia stężenia białka i obliczenia skuteczności sprzęgania (patrz sekcja 2).
   4. Etap sprzężenia białek:
      1. Aktywowane kulki należy osadzać przez odwirowanie (2 min, 16 000 x g w mikrowirówce) i przemyć osad raz w 1 ml świeżego sterylnego PBS.
      2. Zawiesić osad w przygotowanym roztworze białkowym (np. 1 ml), aby uzyskać pożądane stężenie białka.
         Uwaga: Stężenie białka na etapie sprzęgania będzie zależało od średniej sprawności sprzęgania (zob. sekcja 2 w celu określenia sprawności sprzęgania) i pożądanej gęstości sprzęgania (obliczonej w ppkt 1.1.4.3). Wydajność wynosi około 85%, a pożądane stężenie końcowe 5 mM w zawiesinie 10x kulki, więc stężenie białka na etapie sprzęgania powinno wynosić około 6 mM.
      3. Obliczyć gęstość sprzężenia, korzystając z następującego wzoru:
         gdzie
         ρ_c gęstość sprzężenia [liczba cząsteczek białka/nm²],
         Stężenie białka CONC Stężenie białka [mg/ml],
         białko M_w masie cząsteczkowej białka [Da],
         stężenie kulek [liczba koralików/L],
         Średnica stopki d [nm²]
         Liczba Avogadro
      4. Użyj gęstości sprzężenia, aby obliczyć średni odstęp między ligandami:
         
      5. Zawiesinę kulek białkowych inkubować przez 2 godziny w temperaturze 25 °C na obracającym się kole.
         Uwaga: Niektóre białka mogą nie być stabilne w temperaturze pokojowej. W takich przypadkach reakcję można przeprowadzić w temperaturze 4 °C O/N.
      6. Dezaktywować pozostałe aktywowane grupy na kulkach poprzez dodanie zapasu cysteiny do końcowego stężenia 50 mM i inkubować zawiesinę przez 30 minut w temperaturze 25 °C na obracającym się kole. Granulki osadzać przez odwirowanie (2 min, 16 000 x g w mikrowirówce).
      7. Zachować supernatant w celu określenia stężenia białka i obliczenia skuteczności sprzęgania (patrz sekcja 2).
      8. Przemyć granulkę kulki dwukrotnie 1 ml PBS i ponownie zawiesić w 1 ml świeżej PBS, aby uzyskać produkt końcowy.
         Uwaga: Powyższy protokół zazwyczaj daje 1 ml sprzężonego białka o końcowym stężeniu 5 mM białka, które może być użyte jako 10-krotny zapas do kolejnych eksperymentów (patrz sekcja 3).
      9. Aby przejść do sekcji 3 protokołu, pracuj ze 100 ml/ml bulionu z kulek lub przy końcowym stężeniu białka 500 nM. Uwaga: Dobrym punktem wyjścia dla tej procedury będzie 2×10¹² kulek/ml, co daje średnią gęstość sprzężenia 3×^10-4 białka/nm² lub średni odstęp 57 nm na kulce o średnicy 2 mm.
2. Sprzęgło kierunkowe tiolowo-karboksylowe
   Uwaga: Ten protokół jest odpowiedni do sprzęgania białek zawierających cysteinę z kulkami polistyrenowymi funkcjonalizowanymi karboksylowo. Ugrupowanie karboksylowe jest najpierw aktywowane za pomocą 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) / N-hydroksysukcynimidu (NHS), modyfikowanego aminami, a następnie sieciowanego za pomocą sulfo-SMPB (ryc. 2).
   
   Rysunek 2. Strategia sieciowania stosowana do kierunkowego sprzężenia tiolowo-karboksylowego białek z kulkami polimerowymi. Karboksylowane kulki polistyrenowe są najpierw aktywowane EDC i modyfikowane NHS w celu utworzenia półstabilnego estru NHS. Późniejsze sprzężenie aminowe etylenodiaminy powoduje powstanie wolnej grupy aminowej, która reaguje z Sulfo-SMPB. Kulki aktywowane maleimidem mogą następnie reagować z wolnymi cysteinami, aby kierunkowo łączyć białka z kulkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
   1. Przygotowanie odczynników:
      1. Przygotować PBS (100 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,0) i autoklaw.
      2. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować 100-krotny zapas (0,5 M lub 287 mg/ml w PBS) TCEP.
      3. Przygotować 10x zapas (20 mM lub 4 mg/ml w PBS) EDC (1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu) bezpośrednio przed użyciem.
      4. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować 10 porcji (50 mM lub 6 mg/ml w PBS) NHS (N-hydroksysukcynimidu).
      5. Przygotować 5x zapas (10 mM lub 4,58 mg/ml w dH₂O) Sulfo-SMPB bezpośrednio przed użyciem.
      6. Przygotuj 10x zapas (500 mM lub 88 mg/ml w PBS, pH 7,0) cysteiny bezpośrednio przed użyciem.
   2. Aktywacja koralików:
      1. Wymieszać zawiesinę perełkową, delikatnie odwracając i przenieść wymaganą ilość zawiesiny kulek (np. 12 ml) do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml sterylnego PBS o pH 7,0.
      2. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby umyć kulki i granulki przez odwirowanie w mikrowirówce (2 minuty przy 16 000 x g).
      3. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i wyrzucić.
      4. Zawiesić granulkę w 1 ml świeżego sterylnego PBS i powtórzyć etap mycia.
      5. Zawiesić granulkę w 0,8 ml PBS.
      6. Dodać 100 ml 10 x wywaru EDC (2 mM stężenie końcowe) i natychmiast 100 ml 10 x roztworu podstawowego NHS (5 mM stężenie końcowe) do zawiesiny kulek.
      7. Inkubować zawiesinę ściegu przez 30 minut w temperaturze 25 °C na obracającym się kole.
      8. Umyć kulki raz w 1 ml PBS i ponownie zawiesić w 0,8 ml świeżego sterylnego PBS.
      9. Dodać 200 ml etylenodiaminy i inkubować zawiesinę kulek przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C na obracającym się kole.
      10. Umyć kulki raz 1 ml PBS i ponownie zawiesić je w 0,8 ml świeżego PBS.
      11. Postępować od ppkt 1.1.2.4 (aktywacja kulek za pomocą sulfo-SMPB) zgodnie z opisem w ppkt 1.1.2 i postępować zgodnie z pozostałą częścią protokołu opisanego w ppkt 1.1 (Kierunkowe sprzężenie tiolowo-aminowe). Wykonać etapy przygotowania białka i sprzęgania białka w sposób identyczny z opisanym w sekcji 1.1.
          Uwaga: Typowa wydajność sprzęgania przy użyciu tego protokołu jest nieco niższa (ok. 75%) w porównaniu z sekcją 1.1, dlatego należy odpowiednio dostosować początkowe stężenie białka, aby osiągnąć tę samą gęstość sprzężenia.

2. Wyznaczanie efektywności sprzężenia

Uwaga: Aby określić stężenie białka, użyj odczynnika Bradforda ¹⁰ i testów kolorymetrycznych w następujący sposób:

1. Delikatnie odwróć odczynnik Bradford, aby zapewnić jednorodność odczynnika.
2. Używając roztworu podstawowego BSA o stężeniu 10 mg/ml, przygotować wzorce białka o stężeniach od 0,1 do 1,5 mg/ml BSA w buforze.
3. Dodać 250 ml odczynnika Bradford do studzienek na płytce 96-dołkowej. Przygotować wystarczającą ilość studzienek dla wszystkich próbek, wzorców białkowych i kontroli ujemnych (tylko bufor).
4. Dodać 5 ml próbki białka (wzorce białkowe lub bufor do kontroli ujemnej) do odczynnika w płytce 96-dołkowej.
5. Inkubować płytkę na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
6. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 595 nm za pomocą czytnika płytek.
7. Wygenerowanie wzorcowej krzywej stężenia BSA w funkcji A595 nm i wykorzystanie jej do określenia stężeń białek w próbkach początkowych i supernatantowych.
8. Obliczyć stężenie sprzężonego białka w następujący sposób:
   
9. Oblicz sprawność sprzęgania jako:
   

3. Zastosowanie adhezyn sprzężonych z koralikami w testach konkurencji

1. preparat:
   1. Wysiewać 1 ml komórek Hela na studzienkę w stężeniu 150 000 komórek/ml na 24-dołkową płytkę na dzień przed testem konkurencji, aby umożliwić komórkom osiągnięcie około 80% zbiegu przed rozpoczęciem eksperymentu.
   2. Ustaw każdy warunek eksperymentalny w trzech egzemplarzach. Włączyć studzienki do kontroli ujemnych (brak dodawania bakterii podczas testów konkurencji), kontroli pozytywnych (kulki kontrolne sprzężone ze znacznikiem fuzyjnym dodawane tylko podczas testów zawodnościowych) i kontrole lizy (do doświadczeń cytotoksyczności).
   3. Zaszczepić 5 ml morskiej kultury LB (MLB) świeżą kolonią V. parahaemolyticus i wyhodować O/N w temperaturze 30 °C, wstrząsając.
   4. Przygotować wystarczającą ilość mamów sprzężonych z koralikami, jak opisano w rozdziale 1. (Sprzężenie). Pozostaw 100 ml 10x bulionu z koralików na dołek.
2. Test konkurencji:
   1. W dniu eksperymentu konkursowego zmierz OD₆₀₀ w kulturze bakteryjnej.
   2. Przygotować pożywkę infekcyjną, rozcieńczając kultury bakteryjne w bezbarwny DMEM bez dodatków, wstępnie podgrzany do 37 °C, zawierający 10% zawiesiny kulek v/v (kulki sprzężone z adhezyną lub kulki kontrolne), aby uzyskać MOI równy 10. Przygotować 1 ml/studzienkę i 10-20% nadmiaru objętości na próbkę. Uwaga: Dla wyżej wymienionych warunków (płytka 24-dołkowa, V. parahaemolyticus, MOI 10), niezbędną objętość kultury O/N, którą należy dodać na basenik (ml/ml) oblicza się jako 3/OD₆₀₀ kultury. Na przykład 1 ml pożywki infekcyjnej zwykle zawiera 100 ml zawiesiny perełek, kilka ml kultury bakteryjnej i jest uzupełniony do 1 ml bezbarwnym, niesuplementowanym DMEM.
   3. Usunąć starą pożywkę ze studzienek i przemyć wyhodowane komórki Hela, dodając do każdej studzienki 1 ml sterylnego PBS wstępnie podgrzanego do temperatury 37 °C.
   4. Usunąć PBS i dodać 1 ml pożywki infekcyjnej do dołka. Należy również skonfigurować kontrole, dodając roztwory zawierające kulki kontrolne i bakterie (kontrola pozytywna) lub kulki adhezynowe i brak bakterii (kontrole negatywne) lub DMEM zawierające 0,1% Triton X-100 (kontrola lizy, niezbędna tylko do pomiarów cytotoksyczności).
   5. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez żądany czas (np. 4 godziny w przypadku pomiarów cytotoksyczności lub 1 godzinę w przypadku pomiarów przyczepności).
      Uwaga: Zarówno adhezja bakteryjna, jak i cytotoksyczność na komórkach gospodarza mogą być wykorzystane jako odczyty skuteczności hamowania. Jeżeli punkty czasowe pomiarów cytotoksyczności i adhezji pokrywają się, oba badania można przeprowadzić przy użyciu próbek z tego samego dołka, ponieważ cytotoksyczność określa się przy użyciu supernatantu hodowli, a testy przyłączania wykorzystują próbki pochodzące z pozostałej warstwy komórkowej.
3. Pomiary cytotoksyczności:
   1. We wskazanych punktach czasowych (np. 4 godziny po zakażeniu) należy trzykrotnie pobrać po 200 ml z każdej 24-dołkowej płytki i przenieść na 96-dołkową płytkę.
   2. Odwirować 96-dołkowe płytki w temperaturze 1 500 x g, 5 minut i przenieść 100 ml z każdej studzienki do świeżej płytki 96-dołkowej. Dodać 100 ml pożywki użytej podczas eksperymentów z infekcją do świeżych studzienek płytki 96-dołkowej w trzech egzemplarzach (zostaną one użyte jako ślepe próby).
   3. Przeprowadzić test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) przy użyciu zestawu do wykrywania cytotoksyczności LDH i postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Pokrótce obliczyć potrzebną ilość odczynnika w krokach co 25 (np. jeśli mają być zmierzone 62 próbki, uzupełnić wystarczającą ilość mieszanki odczynników dla 75 itd.).
      2. Na przykład na 100 próbek zmieszaj 11,25 ml odczynnika A z 250 μl odczynnika B. Odwróć, nie wiruj, aby uniknąć pienienia.
      3. Umieścić mieszaninę w zbiorniku, aby można było pipetować za pomocą pipety wielokanałowej. Do każdej próbki dodać 100 μl mieszaniny odczynników.
      4. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej i odczytać absorbancję przy długości fali 490 nm na czytniku płytek po 10, 20, 30 minutach.
      5. Przeanalizuj zestaw danych, dla którego absorbancja próbki kontrolnej lizy jest wysoka, ale nadal mieści się w zakresie liniowym czytnika płytek (zazwyczaj 2-3 jednostki absorbancji).
      6. Wyrazić wyniki jako % cytotoksyczności, używając następującego wzoru do przeliczenia:
         
4. Pomiar adhezji bakterii:
   1. We wskazanych punktach czasowych (np. 1 godzinę po zakażeniu) usuń pożywkę z warstwy komórek.
   2. Dokładnie umyj warstwę komórek sterylnym, wstępnie podgrzanym PBS (co najmniej 3-4 płukania po 1 ml PBS każde), aby usunąć wszelkie nieprzyłączone komórki.
   3. Lizować komórki gospodarza przez dodanie 1 ml sterylnego 1% v/v roztworu Triton X-100 do PBS na studzienkę. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   4. Odpipetować każdą próbkę w górę i w dół kilka razy przed przeniesieniem zawartości każdej studzienki do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 ml. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia próbek do sterylnego PBS (np. użyć 100 ml próbki i 900 ml PBS).
   5. Umieścić 100 ml każdej próbki na agarze MLB i rozprowadzić za pomocą rozsiewacza komórek. Zoptymalizuj rozcieńczenia do płytki w zależności od szczepów bakteryjnych i punktu czasowego. Uwaga: Dla opisanego układu doświadczalnego, 10⁵ lub 10^6-krotne rozcieńczenia dają odpowiednią liczbę jtk.
   6. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C O/N i policzyć bakterie przez zliczanie kolonii.

Wyniki

Adhezyna V. parahaemolyticus MAM7 zawiera siedem tandemowych domen wejściowych do komórek ssaków (MCE) zaangażowanych w rozpoznawanie receptorów powierzchniowych gospodarza. Użyliśmy kulek polistyrenowych sprzężonych z rekombinowanymi, oczyszczonymi fragmentami obejmującymi wszystkie siedem tandemowych domen MCE (MAM7) lub tylko pierwszą domenę MCE (MAM1), aby przetestować zdolność tych materiałów do konkurowania z V. parahaemolyticus w wiązaniu komórek gospodarza i wynikającą z tego skuteczność tych materiałów jako inhibitorów adhezji. Komórki Hela zostały zakażone szczepem V. parahaemolyticus POR1, a cytotoksyczność wynikającą z zakażenia in vitro oceniano po 4 godzinach (ryc. 3). Leczenie komórek Hela 0,1% Triton X-100 (pozytywna kontrola lizy) spowodowało całkowitą lizę komórek, niezakażone komórki wykazywały bardzo niski poziom cytotoksyczności. Zakażenie in vitro nieleczonych komórek POR1 spowodowało bardzo wysoki poziom lizy komórek, który został zahamowany przez kulki sprzężone z MAM7, ale nie przez kulki kontrolne sprzężone z MAM1 lub GST (Figura 3).

Rysunek 3. Charakterystyka cytotoksyczności indukowanej przez Vibrio parahaemolyticus w komórkach nabłonka podczas testów konkursowych. Komórki traktowano V. parahaemolyticus (V.p), oznaczoną (+) lub brakiem bakterii (-) w obecności różnych konkurujących ze sobą jednostek (comp.), jak wskazano. Obejmowały one koraliki bez komp. (-), koraliki MAM7 (MAM7), koraliki MAM1 (MAM1) lub koraliki kontrolne GST (GST). Jako kontrola, komórki były traktowane albo Triton X-100 (tryton, kontrola lizy), albo pozostawione niezakażone (uninf). Uwalnianie LDH po 4 godzinach mierzono zgodnie z opisem w punkcie 3, a wyniki znormalizowano do kontroli Triton (100%) i ślepej próby (0%), jak opisano powyżej. Wyniki są średnimi ± s.e.m. z potrójnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyliczenie V. parahaemolyticus przyczepionych do nieleczonych komórek Hela lub komórek inkubowanych z koralikami kontrolnymi MAM7, MAM1 lub GST, ujawniło, że kulki kontrolne MAM7, ale nie MAM1 lub GST, przewyższają V. parahaemolyticus pod względem przyłączania do receptorów na powierzchni komórki gospodarza (Rysunek 4).

Rysunek 4. Charakterystyka przyczepu bakterii podczas eksperymentów konkursowych. Komórki Hela zostały zakażone V. parahaemolyticus POR2 (V.p. +), przy braku (-) lub obecności konkurencyjnych jednostek (comp.) w następujący sposób: kulki MAM7 (MAM7), kulki MAM1 (MAM1) lub kulki kontrolne GST (GST). Adhezja bakteryjna mierzono po 1 godzinie, jak opisano w punkcie 3. Wyniki są średnimi ± s.e.m. z potrójnych eksperymentów. Średnie (f.l.t.r. w jtk/ml) to 2,3010⁶, 1,5310⁵, 2,0510⁶, 2,1210⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Adhezyny sprzężone z kulkami znakowanymi fluoroforem powodują generowanie materiałów, które naśladują adhezję bakterii do komórek gospodarza i są potężnymi narzędziami do obrazowania komórkowego (Rysunek 5). Używając fluorescencyjnych niebieskich kulek sprzężonych z MAM7, scharakteryzowaliśmy proces przyczepiania się do komórek nabłonkowych za pośrednictwem MAM7. Przyłączenie MAM7 do komórek gospodarza spowodowało przegrupowanie aktyny i tworzenie włókien stresowych, które współwizualizowano za pomocą rodaminy-falloidyny do barwienia F-aktyny (Figura 5B).

Rysunek 5. Przygotowanie i stosowanie kulek biomimetycznych znakowanych fluoroforem do celów obrazowania.(A) Zawieszenie fluorescencyjnych niebieskich kulek biomimetycznych (prawa probówka, 10x kolba) i kontrola bufora (lewa rurka). (B) Przyłączenie kulek sprzężonych z MAM7 do komórek Hela powoduje przegrupowanie aktyny i tworzenie włókien stresowych. Przyczepienie fluorescencyjnych niebieskich kulek i powstałe w ten sposób włókna naprężeniowe aktyny (czerwone, barwione rodaminą-falloidyną) obrazowano za pomocą mikroskopii. Bar, 10 μm. Obrazy w panelu B zostały zaadaptowane z Lim et al.¹ i powielane na licencji Creative Commons Uznanie autorstwa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy dwa protokoły, które można wykorzystać do sprzężenia białek zawierających tiol odpowiednio z kulkami polistyrenowymi modyfikowanymi aminami lub karboksylanami. Ze względu na łatwość procedury, preferowane jest sprzężenie tiol-amina, ale w zależności od pożądanej specyfikacji kulki (średnica, właściwości fluorescencyjne), użycie kulek funkcjonalizowanych aminami może nie być możliwe, dlatego dołączyliśmy protokół, który przekształci karboksylan w ugrupowanie aminowe, aby dać badaczowi największą możliwą elastyczność w wyborze rusztowania. Chociaż zarówno sprzężenie tiol-amina, jak i tiol-karboksyl działają dla każdego białka zawierającego cysteinę, sprzężenie kierunkowe (tj. immobilizacja białka na jego N-końcu, naśladując wyświetlanie powierzchniowe) wymaga białka bez reszt cysteiny, które jest wytwarzane jako białko fuzyjne GST lub które zawiera pojedynczą końcową resztę cysteiny wprowadzoną przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce. Jeśli w białku znajduje się wiele reaktywnych cystein, doprowadzi to do losowego unieruchomienia, które może utrudnić funkcjonowanie białka. Wiele adhezyn bakteryjnych nie zawiera naturalnie cystein. W przypadku innych mogą one zostać usunięte przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, chociaż wymagałoby to szeroko zakrojonych testów, aby upewnić się, że natywna struktura i funkcja są zachowane w mutancie. W przypadku białek fuzyjnych GST jako odpowiednią kontrolę ujemną można zastosować oczyszczony znacznik GST sprzężony z kulkami. Należy unikać używania niesprzężonych kulek jako kontroli, ponieważ często mają one większą tendencję do zlepiania się lub niespecyficznego przylegania do komórek. Uproszczona wersja protokołu 1.2., wykorzystująca tylko EDC, może być użyta do sprzężenia białek z kulkami polimerowymi funkcjonalizowanymi karboksylowo, jednak w tym przypadku sprzężenie odbywa się za pośrednictwem amin pierwszorzędowych w białku i dlatego nie gwarantuje sprzężenia kierunkowego.

TCEP jako środek redukujący nie może być zastępowany innymi dostępnymi na rynku i powszechnie stosowanymi środkami redukującymi, takimi jak ditiotreitol (DTT) lub 2-merkaptoetanol (BME), ponieważ zawarte w nich tiole będą konkurować ze sprzężeniem białkowym na etapie sprzężenia tiol-maleimid. PBS można zastąpić innymi, ale z uwzględnieniem następujących kwestii: nie mogą zawierać amin pierwszorzędowych (więc zawierające Tris nie są odpowiednie). Stosowanie zawierających bardzo niskie (< 10 mM) stężenie soli prowadzi do zbrylania się kulek i należy również tego unikać. Czystość białka jest również ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę podczas tej procedury, a aby uzyskać wysokiej jakości dane, należy stosować czyste białka. Rutynowo oczyszczamy białka w wielu etapach, w tym co najmniej etap oczyszczania powinowactwa i filtracji żelowej, ale w niektórych przypadkach chromatografia jonowymienna jest wykonywana jako trzeci krok. W rezultacie czystość białek używanych do sprzęgania wynosi zwykle 90% lub więcej, zgodnie z oceną SDS-PAGE.

Zaleca się oznaczanie stężeń białek zarówno w mieszaninie wyjściowej reakcji, jak i w supernatancie po zakończeniu reakcji. Pomoże to określić pozorne stężenie białka sprzężonego z koralikami, a tym samym gęstość sprzężenia. Wyznaczenie obu wartości pozwoli również na obliczenie sprawności sprzężenia. Można to wziąć pod uwagę podczas przygotowywania początkowego roztworu białka w kolejnych reakcjach, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe i gęstość sprzężenia. Odczynnik Bradforda jest szczególnie odpowiedni do oznaczania stężenia białka przed i po reakcji sprzęgania, ponieważ żadna z substancji w reakcji nie zakłóca tworzenia kompleksu barwników przy stosowanych stężeniach. Jeżeli mają być stosowane niższe stężenia białka, metoda ta może wymagać zastąpienia bardziej czułą metodą wykrywania, jednak należy zwrócić uwagę na fakt, że musi ona być zgodna z substancjami zawartymi w reakcji sprzęgania. Zaleca się również używanie świeżo przygotowanych odczynników i ostrożne obchodzenie się z odczynnikami w proszku (np. przechowywanie w szczelnie zamkniętym pojemniku i używanie kulek krzemionkowych, aby odczynniki nie przyciągały wilgoci), ponieważ jakość odczynników będzie miała wpływ na skuteczność sprzężenia. Jeśli wydajność sprzężenia jest niższa niż oczekiwano, możliwe środki zaradcze obejmują zwiększenie początkowych stężeń kulek i białka. Jeżeli stosowane są wyższe stężenia, stężenie odczynników sprzęgających musi być proporcjonalnie zwiększone, aby zapewnić wystarczający nadmiar molowy. Modyfikacja stężeń kulek/białek jest zwykle lepszym krokiem w kierunku optymalizacji niż wydłużanie czasu reakcji. Ponieważ protokoły łączenia ściegów są długie, zwykle przygotowujemy dużą partię materiału. Podwielokrotności zawiesiny można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy. Rozmrożonych podwielokrotności nie należy ponownie zamrażać, należy je przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1-2 dni. Będzie się to jednak różnić w zależności od charakteru i stabilności użytego białka, ponieważ powinno być początkowo testowane na małej partii.

Adhezyny sprzężone z koralikami mogą być używane do wielu zastosowań, jak omówiono poniżej. W protokole tym opisano test, który jest powszechnie stosowany do pomiaru hamowania wiązania się bakterii i cytotoksyczności za pośrednictwem patogenów na komórkach gospodarza. Test jest powszechnie wykonywany w celu zmierzenia zdolności MAM sprzężonych z kulkami do konkurencyjnego hamowania infekcji komórek nabłonka Hela patogenem przenoszonym przez owoce morza Vibrio parahaemolyticus, wykorzystując albo zmniejszenie przyczepiania się bakterii do komórek gospodarza, albo zmniejszoną cytotoksyczność jako odczyt. W obu przypadkach przygotowanie i testy konkursowe przebiegają zgodnie z tym samym protokołem. W zależności od odczytu stosuje się różne szczepy V. parahaemolyticus : szczep cytotoksyczny POR1 jest używany do pomiarów cytotoksyczności, podczas gdy niecytotoksyczny szczep POR2 jest używany do pomiaru adhezji bakterii, ponieważ śmierć komórki i oderwanie komórki utrudniają procedurę ilościowego oznaczania przyłączonych bakterii.

Początkowo eksperymenty konkursowe zostały opracowane jako protokół etapowy, w którym komórki gospodarza były najpierw wstępnie inkubowane z koralikami przed dodaniem bakterii. W przypadku V. parahaemolyticus i zastosowanych specyfikacji kulek (kulki 2 μm sprzężone z MAM7) zarówno kulki, jak i bakterie mogą być dodawane w tym samym czasie bez zmian w wynikającej cytotoksyczności. Oznacza to, że w tej eksperymentalnej konfiguracji kulki konkurują z bakteriami o wiązanie komórek gospodarza. W zależności od gatunku bakterii i zastosowanej geometrii ściegu, mogą istnieć dobre powody, aby utrzymać adhezję ściegu i infekcję bakteryjną jako dwa oddzielne kroki. Na przykład, aby zainfekować komórki nieruchliwymi bakteriami, płytki są zwykle odwirowywane po dodaniu pożywki infekcyjnej. Należy jednak unikać wirowania płytek zawierających zawiesiny kulek, ponieważ prowadzi to do bardzo nierównomiernego rozmieszczenia kulek na warstwie komórkowej. Jeśli używane są cząstki o mniejszych rozmiarach, kulki będą potrzebowały więcej czasu, aby osiąść na powierzchni komórki, w takim przypadku należy przewidzieć wystarczająco dużo czasu na przyczepienie się koralików przed infekcją. Gdy adhezja bakteryjna jest używana jako odczyt, próbki powinny być pobierane w punktach czasowych, w których komórki gospodarza nie są znacząco uszkodzone przez infekujący szczep, ponieważ oderwanie i liza komórek mogą zagrozić ilościowi przyłączonych bakterii.

Zamiast wyliczać adhezję bakteryjną przez rozcieńczanie galwaniczne, próbki można alternatywnie przetworzyć do obrazowania (ryc. 5). W takim przypadku komórki hodowli tkankowej należy wysiać na szkiełka nakrywkowe, a nie bezpośrednio do studzienek. Dodatkowo można stosować kulki fluorescencyjne i bakterie wyrażające białko fluorescencyjne, a także markery komórek gospodarza specyficzne dla infekcji. Na przykład eksperymenty konkursowe są zwykle obrazowane przy użyciu fluorescencyjnej czerwonej rodaminy-falloidyny do barwienia cytoszkieletu aktynowego komórek gospodarza i oceny zmian morfologicznych wynikających z infekcji, wraz z fluorescencyjnymi niebieskimi kulkami i fluorescencyjnymi zielonymi bakteriami (wyrażającymi GFP lub barwionymi SYTO18).

Szereg adhezyn sprzężonych z koralikami, w tym Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD i Vibrio parahaemolyticus MAM, zastosowano jako materiały biomimetyczne do badania adhezji, hamowania adhezji i udziału adhezji w cytotoksyczności za pośrednictwem patogenów ^{1, 7, 8}. Jedną z zalet stosowania tego podejścia jest łatwość wizualizacji zdarzeń mocowania, ponieważ koraliki polimerowe używane jako rusztowania są dostępne w szerokiej gamie kolorów (np. niebieski, fluorescencyjny czerwony, niebieski, zielony, pomarańczowy). W ten sposób można uniknąć bezpośredniego znakowania białek, które może zakłócać działanie. Dodatkowo, sprzężenie powierzchniowe naśladuje wielowartościowe wyświetlanie adhezyn na powierzchni bakterii, odzwierciedlając w ten sposób bardziej fizjologicznie istotną konformację w porównaniu z rozpuszczalnymi białkami.

W porównaniu z badaniami z wykorzystaniem nienaruszonych bakterii lub mutantów bakteryjnych, podejście perełkowe pozwala uniknąć problemów związanych ze wzrostem bakterii. Na przykład długoterminowe (np. O/N) badania adhezji bakterii do komórek gospodarza przy użyciu nienaruszonych bakterii są często zagrożone przez zjawiska towarzyszące wzrostowi bakterii – zakwaszenie pożywki wzrostowej i wyczerpanie składników odżywczych negatywnie wpływają na komórki gospodarza, a replikacja bakterii ostatecznie pogarsza jakość obrazowania.

Ostatnio zastosowanie adhezyn sprzężonych z koralikami zostało rozszerzone o ich zastosowanie jako narzędzi do oczyszczania powinowactwa czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w procesy sygnalizacyjne po przyczepieniu się bakterii. V. parahaemolyticus MAM7, poprzez wiązanie się z kwasami fosfatydowymi w błonie komórkowej gospodarza, wyzwala aktywację RhoA i rearanżacje aktyny ^{1, 3}. Kulki sprzężone z MAM są wykorzystywane do oczyszczania i identyfikacji białek zaangażowanych w platformy sygnalizacyjne powstałe w wyniku wiązania komórek gospodarza MAM. Ponieważ kulki można łatwo oddzielić od supernatantu za pomocą krótkiego etapu wirowania, a białko będące przedmiotem zainteresowania jest kowalencyjnie sprzężone, jest to dobra metoda uzyskania separacji od białek zanieczyszczających i wzbogacenia odpowiednich kompleksów białkowych, które można wykorzystać do dalszych zastosowań, takich jak proteomika lub Western Blotting.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
Tris(2-karboksetylo)fosfina (TCEP)	Sigma	646547	Niebezpieczeństwo; można kupić jako roztwór lub świeżo przygotowany
4-(p-maleimidofenylo)maślan sulfosuccinimidylu (Sulfo-SMPB)	Fisher	PN22317	Niebezpieczeństwo; toksyczny
L-cysteina	Sigma	30089	Niebezpieczeństwo; toksyczny
Koraliki lateksowe, polistyren modyfikowany aminami, niebieski fluorescencyjny - zawiesina wodna, 2,0  μ m średnia wielkość cząstek	Sigma	L0280	szkodliwe; dostępny jest szereg alternatywnych rozmiarów i kolorów cząstek
1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimid (EDC)	Thermo scientific	22980
N-hydroksysukcynimid (NHS)	Thermo scientific	24500
Koraliki polistyrenowe modyfikowane karboksylanem	Sigma	CLB9	szkodliwe; Dostępny jest szereg alternatywnych rozmiarów i kolorów cząstek
Etylenodiamina	Sigma	E26266	Niebezpieczeństwo; łatwopalne,, toksyczne, uczulające
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Odczynnik Bradford Promega	W3841
	Sigma	B6916	Niebezpieczeństwo; i toksyczne
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średnia - wysoka glukoza - Z 4 500 mg/L glukozy i wodorowęglanem sodu, bez  L-glutamina, pirogronian sodu i czerwień fenolowa, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych	Sigma	D1145	do eksperymentów z infekcjami
DMEM	Sigma	D6429	do utrzymania hodowanych komórek gospodarza
Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie	Sigma	F9665	suplement do pożywki
do hodowli tkankowychPenicylina-Streptomycyna - Roztwór stabilizowany, z 10 000 jednostek penicyliny i 10  mg streptomycyny/ml, sterylnie przefiltrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych	Sigma	F9665	suplement do pożywki do hodowli tkankowych
PBS	Sigma	D8537
LDH Zestaw do wykrywania cytotoksyczności	Takara	MK401
z tworzywa sztucznego
(25 ml)	SLS	F267660
płytki 24-dołkowe	Greiner	662160
96-dołkowe płytki	Greiner	655182
Sprzęt
hemocytometru
			czytnik
płytek
urządzenia do hodowli tkankowych
Pipeta