Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz

Daniel H. Stones; Fitua Al-Saedi; Diana Vaz; Nicolas Perez-Soto; Anne M. Krachler

doi:10.3791/53400

Artykuł metodologiczny

Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz

12.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53400

⸱

16 listopada 2015

Daniel H. Stones^*¹ , Fitua Al-Saedi^*¹ , Diana Vaz¹ , Nicolas Perez-Soto¹ , Anne M. Krachler¹

¹Institute of Microbiology and Infection, School of Biosciences, University of Birmingham

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przyczepienie się bakterii do komórek gospodarza jest kluczowym krokiem podczas kolonizacji i infekcji gospodarza. Protokół ten opisuje wytwarzanie rekombinowanych adhezyn sprzężonych z polimerami jako materiałów biomimetycznych, które umożliwiają analizę udziału poszczególnych adhezyn w tych procesach, niezależnie od innych czynników bakteryjnych.

Streszczenie

Przyczepienie się bakterii do komórek gospodarza jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń podczas kolonizacji bakteryjnej tkanek gospodarza, a tym samym kluczowym krokiem podczas infekcji. Biochemiczna i funkcjonalna charakterystyka adhezyn pośredniczących w tych początkowych interakcjach bakteria-gospodarz jest często zagrożona przez obecność innych czynników bakteryjnych, takich jak składniki ściany komórkowej lub wydzielane cząsteczki, które zakłócają analizę. Protokół ten opisuje produkcję i stosowanie materiałów biomimetycznych, składających się z czystych rekombinowanych adhezyn sprzężonych chemicznie z dostępnymi na rynku, funkcjonalizowanymi kulkami polistyrenu, które zostały z powodzeniem wykorzystane do analizy biochemicznych i funkcjonalnych interakcji między poszczególnymi adhezynami bakteryjnymi a receptorami komórek gospodarza. Omówiono również protokoły dla różnych substancji chemicznych sprzęgających, umożliwiające kierunkowe unieruchomienie rekombinowanych adhezyn na rusztowaniach polimerowych oraz do oceny skuteczności sprzęgania powstałych materiałów "bakteriomimetycznych". Dalej opisujemy, w jaki sposób materiały te mogą być wykorzystywane jako narzędzie do hamowania cytotoksyczności zależnej od patogenów oraz omawiamy zakres, ograniczenia i dalsze zastosowania tego podejścia w badaniu interakcji bakteria-gospodarz.

Wprowadzenie

Analiza interakcji między adhezynami bakteryjnymi a receptorami na powierzchni gospodarza na styku gospodarz-patogen jest niezbędnym krokiem w kierunku zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw adhezji bakteryjnej. Ostatecznie pomoże nam to zidentyfikować strategie zakłócania tych procesów podczas infekcji. Prowadząc takie badania, często stajemy przed dylematem: biochemiczna i biofizyczna analiza molekularnych mechanizmów wiązania adhezyny wymaga ich oddzielenia od innych składników ściany komórkowej, co może zakłócać zdarzenia adhezyjne. Z drugiej strony, zastosowanie rekombinowanych rozpuszczalnych białek nadmiernie upraszcza zdarzenie adhezji, pomijając zakotwiczenie białka w ścianie komórkowej bakterii i wielowartościowość wiązania osiągniętą poprzez wyświetlanie powierzchni bakteryjnej. Podobnie, z perspektywy komórki gospodarza, napotkanie i związanie się z pojedynczymi cząsteczkami adhezyny nie zawsze ma taki sam wpływ pod względem organizacji błony plazmatycznej, płynności błony i grupowania receptorów¹, co ostatecznie utrudnia ocenę wpływu adhezji na sygnalizację komórkową gospodarza i wynik interakcji bakteria-gospodarz.

Niedawno opracowano metodę, dzięki której rekombinowane oczyszczone adhezyny lub fragmenty adhezyny są kierunkowo i kowalencyjnie sprzężone z cząsteczkami polimeru o rozmiarach podobnych do bakterii, naśladując w ten sposób wyświetlanie powierzchni bakteryjnej. Podejście to zastosowano w przypadku szeregu różnych adhezyn, od Gram-ujemnych wielowartościowych cząsteczek adhezyjnych (MAM)^{2, 3} do adhezyn Gram-dodatnich, w tym białka wiążącego fibronektynę Staphylococcus aureus (FnBPA)^{4, 5} i Streptococcus pyogenes F1 ^{6, 7}. Metoda ta pozwoliła na rozbiór fragmentów adhezyny ważnych dla wiązania komórek gospodarza, identyfikację receptorów powierzchniowych gospodarza i określenie ich zachowania na powierzchni komórki gospodarza, biorąc pod uwagę zarówno powinowactwo wiązania, jak i awidność ^{1, 8}. Ponadto podejście to zostało wykorzystane do zbadania skuteczności unieruchomionych adhezyn i pochodnych jako inhibitorów interakcji gospodarz-patogen ^{8, 9}. Wykazano, że sprzężone powierzchniowo pochodne wielowartościowej cząsteczki adhezyjnej (MAM) 7 Vibrio parahaemolyticus mogą być stosowane do łagodzenia szeregu zakażeń bakteryjnych in vitro, w tym tych wywoływanych przez patogeny wielolekooporne, takie jak Acinetobacter baumannii i oporny na metycylinę S. aureus (MRSA) ^{7, 9}.

Tutaj opisujemy różne substancje chemiczne, które mogą być użyte do unieruchomienia adhezyn do dostępnych na rynku funkcjonalizowanych cząstek polistyrenu. Ze względu na szeroki wachlarz dostępnych funkcji powierzchniowych, etykiet i wielkości cząstek, są one użytecznym rusztowaniem do produkcji materiałów bakteriomimetycznych do badania interakcji adhezyna-gospodarz. Dalej opisujemy metody wstępnej charakterystyki reakcji sprzęgania oraz obliczania ważnych właściwości otrzymanych materiałów. Na koniec omówiono zastosowanie adhezyn sprzężonych z koralikami jako konkurencyjnych inhibitorów zakażeń bakteryjnych in vitro jako przykład ich zastosowania, a także przyszły zakres i ograniczenia tego podejścia.

Protokół

1. Chemiczne sprzęganie białek z koralikami polimerowymi

Kierunkowe sprzęganie tiol-amina
Uwaga: Niniejszy protokół jest odpowiedni do sprzęgania białek zawierających cysteinę z polimerowymi kuleczkami funkcjonalizowanymi grupami aminowymi, przy użyciu sulfosukcynimidylo-4-(p-maleimidylofenylo)maślanu (Sulfo-SMPB) jako czynnika sieciującego (Rysunek 1).

Rysunek 1. Strategia sieciowania stosowana do kierunkowego sprzęgania tiol-amina białek z polimerowymi kuleczkami. Kuleczki polistyrenowe modyfikowane aminami są aktywowane za pomocą Sulfo-SMPB. Maleimid reaguje z wolnymi cysteinami, aby kierunkowo sprzęgać białka z kuleczkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
1. Przygotowanie odczynników:
  1. Przygotować PBS (100 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,0) i wysterylizować w autoklawie.
  2. Przygotować stok 100x (0,5 M lub 287 mg/ml w PBS) TCEP (tris(2-karboksyetyl)fosfiny) bezpośrednio przed użyciem.
  3. Przygotować stok 5x (10 mM lub 4,58 mg/ml w dH₂O) Sulfo-SMPB bezpośrednio przed użyciem.
  4. Przygotować stok 10x (500 mM lub 88 mg/ml w PBS, pH 7,0) cysteiny bezpośrednio przed użyciem.
2. Aktywacja kuleczek:
  1. Wymieszać zawiesinę kuleczek poprzez delikatne odwracanie i przenieść wymaganą ilość zawiesiny (np. 12 ml) do sterylnej probówki 1,5 ml zawierającej 1 ml sterylnego PBS, pH 7,0.
  2. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wypłukać kuleczki, a następnie osadzić je przez wirowanie w mikrowirówce (2 min przy 16 000 x g).
  3. Ostrożnie usunąć nadsącz pipetą i odrzucić. Ponownie zawiesić osad z kuleczek w 1 ml świeżego sterylnego PBS i powtórzyć etap płukania. Zawiesić osad z kuleczek w 0,8 ml PBS.
  4. Dodać 200 ml świeżo przygotowanego 10 mM Sulfo-SMPB, aby uzyskać stężenie końcowe 2 mM.
  5. Inkubować zawiesinę kuleczek przez 1 h w 25 °C na rotatorze.
3. Redukcja białka:
  1. Podczas inkubacji w etapie aktywacji przygotować białko do następnego etapu sprzęgania, aby można było je natychmiast dodać do aktywowanych kuleczek.
    Uwaga: Chociaż ten etap redukcji nie zawsze jest wymagany dla białek fuzyjnych GST (glutation S-transferazy), jest on zalecany w celu zapewnienia wysokiej wydajności sprzęgania.
    1. Sprawdzić stężenie białka i dostosować je do stężenia końcowego wymaganego dla reakcji sprzęgania. Uwaga: Zazwyczaj stosuje się białko w stężeniu 6 mM w PBS i objętość 1 ml.
    2. Dodać stok TCEP, aby uzyskać stężenie końcowe 5 mM. Inkubować roztwór przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT).
      Uwaga: Mieszanina reakcyjna może zostać bezpośrednio wykorzystana w następnej reakcji sprzęgania.
    3. Zachować niewielką ilość (kilka ml) roztworu białka do oznaczenia stężenia białka i obliczenia wydajności sprzęgania (patrz sekcja 2).
4. Etap sprzęgania białka:
  1. Osadzić aktywowane kuleczki przez wirowanie (2 min, 16 000 x g w mikrowirówce) i wypłukać osad raz w 1 ml świeżego sterylnego PBS.
  2. Ponownie zawiesić osad w przygotowanym roztworze białka (np. 1 ml), aby uzyskać pożądane stężenie białka.
    Uwaga: Stężenie białka podczas etapu sprzęgania będzie zależeć od średniej wydajności sprzęgania (patrz sekcja 2 w celu oznaczenia wydajności sprzęgania) oraz pożądanej gęstości sprzęgania (obliczonej w 1.1.4.3). Wydajność wynosi około 85%, a pożądane stężenie końcowe to 5 mM w 10-krotnej zawiesinie kuleczek, zatem stężenie białka podczas etapu sprzęgania powinno wynosić około 6 mM.
  3. Obliczyć gęstość sprzęgania za pomocą następującego wzoru:
    gdzie
    ρ_c                     gęstość sprzęgania [liczba cząsteczek białka/nm²],
    protein conc   stężenie białka [mg/ml],
    protein M_w     masa cząsteczkowa białka [Da],
    bead conc       stężenie kuleczek [liczba kuleczek/L],
    d                      średnica kuleczki [nm²]
               liczba Avogadra
  4. Wykorzystać gęstość sprzęgania do obliczenia średniego odstępu między ligandami:
  5. Inkubować zawiesinę białko-kuleczki przez 2 h w 25 °C na rotatorze.
    Uwaga: Niektóre białka mogą być niestabilne w temperaturze pokojowej. W takich przypadkach reakcję można przeprowadzić w 4 °C przez noc (O/N).
  6. Zneutralizować pozostałe aktywne grupy na kuleczkach, dodając stok cysteiny do stężenia końcowego 50 mM, i inkubować zawiesinę przez 30 min w 25 °C na rotatorze. Osadzić kuleczki przez wirowanie (2 min, 16 000 x g w mikrowirówce).
  7. Zachować nadsącz do oznaczenia stężenia białka i obliczenia wydajności sprzęgania (patrz sekcja 2).
  8. Wypłukać osad z kuleczek dwukrotnie 1 ml PBS i zawiesić w 1 ml świeżego PBS, aby otrzymać produkt końcowy.
    Uwaga: Powyższy protokół zazwyczaj daje 1 ml sprzęganego białka o stężeniu końcowym 5 mM, które może być używane jako stok 10x do dalszych eksperymentów (patrz sekcja 3).
  9. Aby przejść do sekcji 3 protokołu, pracować ze stężeniem 100 ml/ml stoku kuleczek lub przy stężeniu końcowym białka 500 nM. Uwaga: Dobrym punktem wyjścia dla tej procedury będzie 2×10¹² kuleczek/ml, co skutkuje średnią gęstością sprzęgania 3×10^-4 białek/nm² lub średnim odstępem 57 nm na kuleczce o średnicy 2 mm.
Kierunkowe sprzęganie tiol-karboksylo
Uwaga: Niniejszy protokół jest odpowiedni do sprzęgania białek zawierających cysteinę z polistyrenowymi kuleczkami funkcjonalizowanymi grupami karboksylowymi. Część karboksylowa jest najpierw aktywowana za pomocą 1-etylo-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu (EDC)/N-hydroksysukcynimidu (NHS), modyfikowana aminą, a następnie sieciowana za pomocą Sulfo-SMPB (Rysunek 2).

Rysunek 2. Strategia sieciowania stosowana do kierunkowego sprzęgania tiol-karboksylo białek z polimerowymi kuleczkami. Karboksylowane kuleczki polistyrenowe są najpierw aktywowane EDC i modyfikowane NHS w celu utworzenia półstabilnego estru NHS. Następne sprzęganie aminowe etylenodiaminą prowadzi do powstania wolnej grupy aminowej, która reaguje z Sulfo-SMPB. Aktywowane maleimidem kuleczki mogą następnie reagować z wolnymi cysteinami, aby kierunkowo sprzęgać białka z kuleczkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
1. Przygotowanie odczynników:
  1. Przygotować PBS (100 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,0) i wysterylizować w autoklawie.
  2. Przygotować stok 100x (0,5 M lub 287 mg/ml w PBS) TCEP bezpośrednio przed użyciem.
  3. Przygotować stok 10x (20 mM lub 4 mg/ml w PBS) EDC (1-etylo-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu) bezpośrednio przed użyciem.
  4. Przygotować stok 10x (50 mM lub 6 mg/ml w PBS) NHS (N-hydroksysukcynimidu) bezpośrednio przed użyciem.
  5. Przygotować stok 5x (10 mM lub 4,58 mg/ml w dH₂O) Sulfo-SMPB bezpośrednio przed użyciem.
  6. Przygotować stok 10x (500 mM lub 88 mg/ml w PBS, pH 7,0) cysteiny bezpośrednio przed użyciem.
2. Aktywacja kuleczek:
  1. Wymieszać zawiesinę kuleczek poprzez delikatne odwracanie i przenieść wymaganą ilość zawiesiny (np. 12 ml) do sterylnej probówki 1,5 ml zawierającej 1 ml sterylnego PBS, pH 7,0.
  2. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wypłukać kuleczki, a następnie osadzić je przez wirowanie w mikrowirówce (2 min przy 16 000 x g).
  3. Ostrożnie usunąć nadsącz pipetą i odrzucić.
  4. Ponownie zawiesić osad z kuleczek w 1 ml świeżego sterylnego PBS i powtórzyć etap płukania.
  5. Zawiesić osad z kuleczek w 0,8 ml PBS.
  6. Dodać do zawiesiny kuleczek 100 ml stoku EDC 10x (stężenie końcowe 2 mM) i natychmiast 100 ml roztworu stoku NHS 10x (stężenie końcowe 5 mM).
  7. Inkubować zawiesinę kuleczek przez 30 min w 25 °C na rotatorze.
  8. Wypłukać kuleczki raz w 1 ml PBS i zawiesić w 0,8 ml świeżego sterylnego PBS.
  9. Dodać 200 ml etylenodiaminy i inkubować zawiesinę kuleczek przez 1 h w 25 °C na rotatorze.
  10. Wypłukać kuleczki raz 1 ml PBS i zawiesić kuleczki w 0,8 ml świeżego PBS.
  11. Kontynuować od punktu 1.1.2.4 (aktywacja kuleczek za pomocą Sulfo-SMPB) zgodnie z opisem w sekcji 1.1.2 i postępować zgodnie z resztą protokołu opisanego w sekcji 1.1 (Kierunkowe sprzęganie tiol-amina). Wykonać etapy przygotowania białka i sprzęgania białka w sposób identyczny z opisanym w sekcji 1.1.
    Uwaga: Typowa wydajność sprzęgania przy użyciu tego protokołu jest nieco niższa (ok. 75%) w porównaniu do sekcji 1.1, dlatego należy odpowiednio dostosować początkowe stężenie białka, aby uzyskać taką samą gęstość sprzęgania.

2. Wyznaczenie wydajności sprzęgania

Uwaga: Aby określić stężenie białka, należy zastosować odczynnik Bradforda ¹⁰ oraz analizy kolorymetryczne w następujący sposób:

Delikatnie odwróć probówkę z odczynnikiem Bradforda, aby zapewnić jednorodność roztworu.
Korzystając ze stoku BSA o stężeniu 10 mg/ml, przygotuj standardy białkowe o stężeniach od 0.1 do 1.5 mg/ml BSA w buforze.
Dodaj 250 ml odczynnika Bradforda do dołków płytki 96-dołkowej. Przygotuj odpowiednią liczbę dołków dla wszystkich próbek, standardów białkowych oraz kontroli negatywnych (sam bufor).
Dodaj 5 ml próbki białka (standardy białkowe lub bufor w przypadku kontroli negatywnej) do odczynnika w płytce 96-dołkowej.
Inkubuj płytkę na wytrząsarce orbitalnej w RT przez 10 min.
Zmierz absorbancję przy 595 nm za pomocą czytnika płytek.
Wyznacz krzywą wzorcową stężenia BSA względem A595 nm i wykorzystaj ją do określenia stężeń białka w próbkach początkowych oraz w naddatkach.
Oblicz stężenie sprzężonego białka zgodnie z poniższym wzorem:
Oblicz wydajność sprzęgania według wzoru:

3. Zastosowanie adhezyn sprzężonych z koralikami w testach konkurencji

Przygotowanie:
1. Dzień przed testem konkurencji wysiać komórki HeLa w ilości 1 ml na dołek przy stężeniu 150 000 komórek/ml na płytkę 24-dołkową, aby umożliwić komórkom osiągnięcie około 80% konfluencji przed rozpoczęciem eksperymentu.
2. Przygotować każdą warunek eksperymentalny w trzech powtórzeniach. Uwzględnić dołki dla kontroli negatywnych (brak dodanych bakterii podczas testów konkurencji), kontroli pozytywnych (dołki z samymi kulkami sprzężonymi z tagiem fuzyjnym dodanymi podczas testów konkurencji) oraz kontroli lizy (do eksperymentów z cytotoksycznością).
3. Zaszczepić 5 ml hodowli morskiej LB (MLB) świeżą kolonią V. parahaemolyticus i inkubować O/N w temperaturze 30 °C przy wstrząsaniu.
4. Przygotować odpowiednią ilość MAM sprzężonego z kulkami, zgodnie z opisem w sekcji 1. (Sprzęganie). Przewidzieć 100 ml 10-krotnego zapasu kulek na dołek.
Test konkurencji:
1. W dniu eksperymentu z konkurencją zmierzyć OD₆₀₀ hodowli bakteryjnej.
2. Przygotować pożywkę do infekcji poprzez rozcieńczenie hodowli bakteryjnych w bezbarwnym DMEM bez dodatków, wstępnie ogrzanym do 37 °C, zawierającym 10% v/v zawiesiny kulek (kulek sprzężonych z adhezyną lub kulek kontrolnych), aby uzyskać MOI wynoszące 10. Przygotować 1 ml/dołek oraz 10-20% nadmiaru objętości na próbkę. Uwaga: Dla wspomnianych warunków (płytka 24-dołkowa, V. parahaemolyticus, MOI 10), niezbędna objętość hodowli O/N dodawana na dołek (ml/ml) jest obliczana jako 3/OD₆₀₀ hodowli. Na przykład 1 ml pożywki do infekcji będzie zazwyczaj zawierać 100 ml zawiesiny kulek, kilka ml hodowli bakteryjnej i zostanie uzupełniony do 1 ml bezbarwnym, nieuzupełnionym DMEM.
3. Usunąć starą pożywkę z dołków i wypłukać hodowane komórki HeLa, dodając 1 ml sterylnego PBS wstępnie ogrzanego do 37 °C do każdego dołka.
4. Usunąć PBS i dodać 1 ml pożywki do infekcji na dołek. Przygotować również kontrole, dodając roztwory zawierające kulki kontrolne i bakterie (kontrola pozytywna), kulki z adhezyną bez bakterii (kontrole negatywne) lub DMEM zawierający 0,1% Triton X-100 (kontrola lizy, niezbędna tylko do pomiarów cytotoksyczności).
5. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C przez wymagany czas (np. 4 h dla pomiarów cytotoksyczności lub 1 h dla pomiarów adhezji).
  Uwaga: Zarówno adhezja bakteryjna, jak i cytotoksyczność komórek gospodarza mogą służyć jako wskaźniki skuteczności inhibicji. Jeśli punkty czasowe pomiarów cytotoksyczności i adhezji pokrywają się, oba testy można przeprowadzić na próbkach z tego samego dołka, ponieważ cytotoksyczność określa się przy użyciu supernatantu hodowli, a testy przylegania wykorzystują próbki pochodzące z pozostałej warstwy komórek.
Pomiary cytotoksyczności:
1. W wyznaczonych punktach czasowych (np. 4 h po infekcji) pobrać trzykrotnie po 200 ml z każdego dołka płytki 24-dołkowej i przenieść do płytki 96-dołkowej.
2. Wirować płytki 96-dołkowe przy 1 500 x g przez 5 min i przenieść 100 ml z każdego dołka do nowej płytki 96-dołkowej. Do świeżych dołków płytki 96-dołkowej dodać w trzech powtórzeniach 100 ml pożywki użytej podczas eksperymentów z infekcją (będą one służyć jako próbki ślepe).
3. Przeprowadzić test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) przy użyciu zestawu do wykrywania cytotoksyczności LDH zgodnie z instrukcjami producenta.
  1. Krótko: obliczyć ilość potrzebnego odczynnika w przyrostach po 25 (np. jeśli do pomiaru jest 62 próbek, przygotować mieszankę odczynników dla 75 itd.).
  2. Na przykład dla 100 próbek zmieszać 11,25 ml odczynnika A z 250 µl odczynnika B. Odwrócić naczynie, nie mieszać w wibratorze (vortex), aby uniknąć pienienia.
  3. Przenieść mieszaninę do rezerwuaru, aby móc pipetować za pomocą pipety wielokanałowej. Dodać 100 µl mieszanki odczynników do każdej próbki.
  4. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej i odczytać absorbancję przy 490 nm na czytniku płytek w 10, 20 i 30 min.
  5. Przeanalizować zestaw danych, dla którego absorbancja próbki kontroli lizy jest wysoka, ale wciąż mieści się w zakresie liniowym czytnika płytek (zazwyczaj 2-3 jednostki absorbancji).
  6. Wyniki wyrazić jako % cytotoksyczności, stosując następujący wzór przeliczeniowy:
Pomiar adhezji bakteryjnej:
1. W wyznaczonych punktach czasowych (np. 1 h po infekcji) usunąć pożywkę z warstwy komórek.
2. Dokładnie wypłukać warstwę komórek sterylnym, wstępnie ogrzanym PBS (co najmniej 3-4 płukania po 1 ml PBS każde), aby usunąć wszystkie nieprzywierające komórki.
3. Zlizować komórki gospodarza, dodając 1 ml sterylnego 1% v/v roztworu Triton X-100 w PBS na dołek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 min.
4. Kilkakrotnie pipetować każdą próbkę w górę i w dół przed przeniesieniem zawartości każdego dołka do osobnych probótek 1,5 ml. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne próbek w sterylnym PBS (np. użyć 100 ml próbki i 900 ml PBS).
5. Wysiać 100 ml każdej próbki na agar MLB i rozprowadzić za pomocą rozsyłacza do komórek. Zoptymalizować wybór rozcieńczeń do wysiania w zależności od szczepów bakteryjnych i punktu czasowego. Uwaga: Dla opisanego układu eksperymentalnego rozcieńczenia 10⁵ lub 10⁶ dają odpowiednią liczbę CFU.
6. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C O/N i zliczyć bakterie poprzez liczenie kolonii.

Wyniki

Adhezyna MAM7 bakterii V. parahaemolyticus zawiera siedem tandemowych domen wejścia do komórek ssaków (MCE), które biorą udział w rozpoznawaniu receptorów powierzchniowych gospodarza. Wykorzystaliśmy kuleczki polistyrenowe sprzężone z rekombinowanymi, oczyszczonymi fragmentami obejmującymi albo wszystkie siedem tandemowych domen MCE (MAM7), albo tylko pierwszą domenę MCE (MAM1), aby przetestować zdolność tych materiałów do konkurowania z V. parahaemolyticus o wiązanie do komórek gospodarza oraz wynikającą z tego skuteczność tych materiałów jako inhibitorów adhezji. Komórki HeLa zainfekowano szczepem POR1 V. parahaemolyticus, a cytotoksyczność wynikającą z infekcji in vitro oceniono po 4 h (Rysunek 3). Traktowanie komórek HeLa 0,1% Triton X-100 (pozytywna kontrola lizy) doprowadziło do całkowitej lizy komórek; komórki niezinfekowane wykazywały bardzo niski poziom cytotoksyczności. Infekcja in vitro nieleczonych komórek szczepem POR1 spowodowała bardzo wysoki poziom lizy komórek, co zostało zahamowane przez kuleczki sprzężone z MAM7, ale nie przez kuleczki sprzężone z MAM1 ani kuleczki kontrolne sprzężone z GST (Rysunek 3).

Wykres słupkowy testu cytotoksyczności porównujący poziomy lizy dla różnych składów białkowych i warunków.
Rycina 3. Charakterystyka cytotoksyczności indukowanej przez Vibrio parahaemolyticus w komórkach nabłonkowych podczas testów konkurencji. Komórki traktowano V. parahaemolyticus (V.p), oznaczonym symbolem (+), lub nie traktowano bakteriami (-) w obecności różnych czynników konkurujących (comp.) zgodnie z oznaczeniem. Obejmowały one: brak konkurencji (-), kuleczki MAM7 (MAM7), kuleczki MAM1 (MAM1) lub kontrolne kuleczki GST (GST). W ramach kontroli komórki traktowano Tritonem X-100 (triton, kontrola lizy) lub pozostawiono niezinfekowane (uninf). Uwalnianie LDH po 4 hr zmierzono zgodnie z opisem w sekcji 3, a wyniki znormalizowano względem kontroli Triton (100 %) i prób ślepych (0 %) zgodnie z powyższym opisem. Wyniki przedstawiono jako średnie ± s.e.m z trzech niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyliczenie liczby bakterii V. parahaemolyticus przytwierdzonych do niepoddanych działaniu czynników komórek HeLa lub komórek inkubowanych z koralikami MAM7-, MAM1- lub kontrolnymi koralikami GST wykazało, że koraliki MAM7, a nie koraliki kontrolne MAM1- lub GST, wypierają V. parahaemolyticus w konkurencji o przytwierdzenie do receptorów powierzchniowych komórek gospodarza (Rycina 4).

Wykres przylegania bakterii, CFU/mL; konkurencja V.p.: MAM7, MAM1, GST; przedstawiono słupki błędów.
Rycina 4. Charakterystyka przylegania bakterii podczas eksperymentów konkurencji. Komórki HeLa zainfekowano szczepem V. parahaemolyticus POR2 (V.p. +), w obecności (-) lub nie (-) konkurujących czynników (comp.) w następujący sposób: kuleczki MAM7 (MAM7), kuleczki MAM1 (MAM1) lub kontrolne kuleczki GST (GST). Adhezję bakteryjną zmierzono po 1 hr, zgodnie z opisem w sekcji 3. Wyniki stanowią średnie ± s.e.m. z trzech powtórzeń eksperymentu. Średnie (od lewej do prawej w CFU/ml) wynoszą 2,3010⁶, 1,5310⁵, 2,0510⁶, 2,1210⁶. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Adhezyny sprzężone z koralikami znakowanymi fluoroforami pozwalają na wytworzenie materiałów naśladujących adhezję bakteryjną do komórek gospodarza, które stanowią potężne narzędzia w obrazowaniu komórkowym (Rysunek 5). Wykorzystując fluorescencyjne niebieskie koraliki sprzężone z MAM7, scharakteryzowaliśmy proces przylegania do komórek nabłonkowych zapośredniczonego przez MAM7. Przytwierdzenie MAM7 do komórek gospodarza doprowadziło do reorganizacji aktyny i powstania włókien stresowych, co zobrazowano za pomocą rodaminy-falloidyny do barwienia F-aktyny (Rysunek 5B).

Obrazowanie F-aktyny w komórkach; obraz z mikroskopu fluorescencyjnego wizualizujący filamenty aktynowe i DNA w cytoszkielecie.
Rysunek 5. Przygotowanie i zastosowanie biomimetycznych kulek znakowanych fluoroforami do celów obrazowania.(A) Zawiesina fluorescencyjnych niebieskich kulek biomimetycznych (prawa probówka, roztwór stokowy 10x) oraz kontrola z buforem (lewa probówka). (B) Przyłączenie kulek sprzężonych z MAM7 do komórek HeLa powoduje reorganizację aktyny i tworzenie włókien stresowych. Przyłączenie fluorescencyjnych niebieskich kulek oraz powstałe włókna stresowe aktyny (czerwone, barwione rodaminą-faloidyną) zostały zobrazowane za pomocą mikroskopii. Pasek skali, 10 μm. Obrazy w panelu B zostały zaadaptowane z Lim et al.¹ i powielone na podstawie licencji Creative Commons Attribution. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy dwa protokoły, które można wykorzystać do sprzężenia białek zawierających tiol odpowiednio z kulkami polistyrenowymi modyfikowanymi aminami lub karboksylanami. Ze względu na łatwość procedury, preferowane jest sprzężenie tiol-amina, ale w zależności od pożądanej specyfikacji kulki (średnica, właściwości fluorescencyjne), użycie kulek funkcjonalizowanych aminami może nie być możliwe, dlatego dołączyliśmy protokół, który przekształci karboksylan w ugrupowanie aminowe, aby dać badaczowi największą możliwą elastyczność w wyborze rusztowania. Chociaż zarówno sprzężenie tiol-amina, jak i tiol-karboksyl działają dla każdego białka zawierającego cysteinę, sprzężenie kierunkowe (tj. immobilizacja białka na jego N-końcu, naśladując wyświetlanie powierzchniowe) wymaga białka bez reszt cysteiny, które jest wytwarzane jako białko fuzyjne GST lub które zawiera pojedynczą końcową resztę cysteiny wprowadzoną przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce. Jeśli w białku znajduje się wiele reaktywnych cystein, doprowadzi to do losowego unieruchomienia, które może utrudnić funkcjonowanie białka. Wiele adhezyn bakteryjnych nie zawiera naturalnie cystein. W przypadku innych mogą one zostać usunięte przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, chociaż wymagałoby to szeroko zakrojonych testów, aby upewnić się, że natywna struktura i funkcja są zachowane w mutancie. W przypadku białek fuzyjnych GST jako odpowiednią kontrolę ujemną można zastosować oczyszczony znacznik GST sprzężony z kulkami. Należy unikać używania niesprzężonych kulek jako kontroli, ponieważ często mają one większą tendencję do zlepiania się lub niespecyficznego przylegania do komórek. Uproszczona wersja protokołu 1.2., wykorzystująca tylko EDC, może być użyta do sprzężenia białek z kulkami polimerowymi funkcjonalizowanymi karboksylowo, jednak w tym przypadku sprzężenie odbywa się za pośrednictwem amin pierwszorzędowych w białku i dlatego nie gwarantuje sprzężenia kierunkowego.

TCEP jako środek redukujący nie może być zastępowany innymi dostępnymi na rynku i powszechnie stosowanymi środkami redukującymi, takimi jak ditiotreitol (DTT) lub 2-merkaptoetanol (BME), ponieważ zawarte w nich tiole będą konkurować ze sprzężeniem białkowym na etapie sprzężenia tiol-maleimid. PBS można zastąpić innymi, ale z uwzględnieniem następujących kwestii: nie mogą zawierać amin pierwszorzędowych (więc zawierające Tris nie są odpowiednie). Stosowanie zawierających bardzo niskie (< 10 mM) stężenie soli prowadzi do zbrylania się kulek i należy również tego unikać. Czystość białka jest również ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę podczas tej procedury, a aby uzyskać wysokiej jakości dane, należy stosować czyste białka. Rutynowo oczyszczamy białka w wielu etapach, w tym co najmniej etap oczyszczania powinowactwa i filtracji żelowej, ale w niektórych przypadkach chromatografia jonowymienna jest wykonywana jako trzeci krok. W rezultacie czystość białek używanych do sprzęgania wynosi zwykle 90% lub więcej, zgodnie z oceną SDS-PAGE.

Zaleca się oznaczanie stężeń białek zarówno w mieszaninie wyjściowej reakcji, jak i w supernatancie po zakończeniu reakcji. Pomoże to określić pozorne stężenie białka sprzężonego z koralikami, a tym samym gęstość sprzężenia. Wyznaczenie obu wartości pozwoli również na obliczenie sprawności sprzężenia. Można to wziąć pod uwagę podczas przygotowywania początkowego roztworu białka w kolejnych reakcjach, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe i gęstość sprzężenia. Odczynnik Bradforda jest szczególnie odpowiedni do oznaczania stężenia białka przed i po reakcji sprzęgania, ponieważ żadna z substancji w reakcji nie zakłóca tworzenia kompleksu barwników przy stosowanych stężeniach. Jeżeli mają być stosowane niższe stężenia białka, metoda ta może wymagać zastąpienia bardziej czułą metodą wykrywania, jednak należy zwrócić uwagę na fakt, że musi ona być zgodna z substancjami zawartymi w reakcji sprzęgania. Zaleca się również używanie świeżo przygotowanych odczynników i ostrożne obchodzenie się z odczynnikami w proszku (np. przechowywanie w szczelnie zamkniętym pojemniku i używanie kulek krzemionkowych, aby odczynniki nie przyciągały wilgoci), ponieważ jakość odczynników będzie miała wpływ na skuteczność sprzężenia. Jeśli wydajność sprzężenia jest niższa niż oczekiwano, możliwe środki zaradcze obejmują zwiększenie początkowych stężeń kulek i białka. Jeżeli stosowane są wyższe stężenia, stężenie odczynników sprzęgających musi być proporcjonalnie zwiększone, aby zapewnić wystarczający nadmiar molowy. Modyfikacja stężeń kulek/białek jest zwykle lepszym krokiem w kierunku optymalizacji niż wydłużanie czasu reakcji. Ponieważ protokoły łączenia ściegów są długie, zwykle przygotowujemy dużą partię materiału. Podwielokrotności zawiesiny można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy. Rozmrożonych podwielokrotności nie należy ponownie zamrażać, należy je przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1-2 dni. Będzie się to jednak różnić w zależności od charakteru i stabilności użytego białka, ponieważ powinno być początkowo testowane na małej partii.

Adhezyny sprzężone z koralikami mogą być używane do wielu zastosowań, jak omówiono poniżej. W protokole tym opisano test, który jest powszechnie stosowany do pomiaru hamowania wiązania się bakterii i cytotoksyczności za pośrednictwem patogenów na komórkach gospodarza. Test jest powszechnie wykonywany w celu zmierzenia zdolności MAM sprzężonych z kulkami do konkurencyjnego hamowania infekcji komórek nabłonka Hela patogenem przenoszonym przez owoce morza Vibrio parahaemolyticus, wykorzystując albo zmniejszenie przyczepiania się bakterii do komórek gospodarza, albo zmniejszoną cytotoksyczność jako odczyt. W obu przypadkach przygotowanie i testy konkursowe przebiegają zgodnie z tym samym protokołem. W zależności od odczytu stosuje się różne szczepy V. parahaemolyticus : szczep cytotoksyczny POR1 jest używany do pomiarów cytotoksyczności, podczas gdy niecytotoksyczny szczep POR2 jest używany do pomiaru adhezji bakterii, ponieważ śmierć komórki i oderwanie komórki utrudniają procedurę ilościowego oznaczania przyłączonych bakterii.

Początkowo eksperymenty konkursowe zostały opracowane jako protokół etapowy, w którym komórki gospodarza były najpierw wstępnie inkubowane z koralikami przed dodaniem bakterii. W przypadku V. parahaemolyticus i zastosowanych specyfikacji kulek (kulki 2 μm sprzężone z MAM7) zarówno kulki, jak i bakterie mogą być dodawane w tym samym czasie bez zmian w wynikającej cytotoksyczności. Oznacza to, że w tej eksperymentalnej konfiguracji kulki konkurują z bakteriami o wiązanie komórek gospodarza. W zależności od gatunku bakterii i zastosowanej geometrii ściegu, mogą istnieć dobre powody, aby utrzymać adhezję ściegu i infekcję bakteryjną jako dwa oddzielne kroki. Na przykład, aby zainfekować komórki nieruchliwymi bakteriami, płytki są zwykle odwirowywane po dodaniu pożywki infekcyjnej. Należy jednak unikać wirowania płytek zawierających zawiesiny kulek, ponieważ prowadzi to do bardzo nierównomiernego rozmieszczenia kulek na warstwie komórkowej. Jeśli używane są cząstki o mniejszych rozmiarach, kulki będą potrzebowały więcej czasu, aby osiąść na powierzchni komórki, w takim przypadku należy przewidzieć wystarczająco dużo czasu na przyczepienie się koralików przed infekcją. Gdy adhezja bakteryjna jest używana jako odczyt, próbki powinny być pobierane w punktach czasowych, w których komórki gospodarza nie są znacząco uszkodzone przez infekujący szczep, ponieważ oderwanie i liza komórek mogą zagrozić ilościowi przyłączonych bakterii.

Zamiast wyliczać adhezję bakteryjną przez rozcieńczanie galwaniczne, próbki można alternatywnie przetworzyć do obrazowania (ryc. 5). W takim przypadku komórki hodowli tkankowej należy wysiać na szkiełka nakrywkowe, a nie bezpośrednio do studzienek. Dodatkowo można stosować kulki fluorescencyjne i bakterie wyrażające białko fluorescencyjne, a także markery komórek gospodarza specyficzne dla infekcji. Na przykład eksperymenty konkursowe są zwykle obrazowane przy użyciu fluorescencyjnej czerwonej rodaminy-falloidyny do barwienia cytoszkieletu aktynowego komórek gospodarza i oceny zmian morfologicznych wynikających z infekcji, wraz z fluorescencyjnymi niebieskimi kulkami i fluorescencyjnymi zielonymi bakteriami (wyrażającymi GFP lub barwionymi SYTO18).

Szereg adhezyn sprzężonych z koralikami, w tym Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD i Vibrio parahaemolyticus MAM, zastosowano jako materiały biomimetyczne do badania adhezji, hamowania adhezji i udziału adhezji w cytotoksyczności za pośrednictwem patogenów ^{1, 7, 8}. Jedną z zalet stosowania tego podejścia jest łatwość wizualizacji zdarzeń mocowania, ponieważ koraliki polimerowe używane jako rusztowania są dostępne w szerokiej gamie kolorów (np. niebieski, fluorescencyjny czerwony, niebieski, zielony, pomarańczowy). W ten sposób można uniknąć bezpośredniego znakowania białek, które może zakłócać działanie. Dodatkowo, sprzężenie powierzchniowe naśladuje wielowartościowe wyświetlanie adhezyn na powierzchni bakterii, odzwierciedlając w ten sposób bardziej fizjologicznie istotną konformację w porównaniu z rozpuszczalnymi białkami.

W porównaniu z badaniami z wykorzystaniem nienaruszonych bakterii lub mutantów bakteryjnych, podejście perełkowe pozwala uniknąć problemów związanych ze wzrostem bakterii. Na przykład długoterminowe (np. O/N) badania adhezji bakterii do komórek gospodarza przy użyciu nienaruszonych bakterii są często zagrożone przez zjawiska towarzyszące wzrostowi bakterii – zakwaszenie pożywki wzrostowej i wyczerpanie składników odżywczych negatywnie wpływają na komórki gospodarza, a replikacja bakterii ostatecznie pogarsza jakość obrazowania.

Ostatnio zastosowanie adhezyn sprzężonych z koralikami zostało rozszerzone o ich zastosowanie jako narzędzi do oczyszczania powinowactwa czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w procesy sygnalizacyjne po przyczepieniu się bakterii. V. parahaemolyticus MAM7, poprzez wiązanie się z kwasami fosfatydowymi w błonie komórkowej gospodarza, wyzwala aktywację RhoA i rearanżacje aktyny ^{1, 3}. Kulki sprzężone z MAM są wykorzystywane do oczyszczania i identyfikacji białek zaangażowanych w platformy sygnalizacyjne powstałe w wyniku wiązania komórek gospodarza MAM. Ponieważ kulki można łatwo oddzielić od supernatantu za pomocą krótkiego etapu wirowania, a białko będące przedmiotem zainteresowania jest kowalencyjnie sprzężone, jest to dobra metoda uzyskania separacji od białek zanieczyszczających i wzbogacenia odpowiednich kompleksów białkowych, które można wykorzystać do dalszych zastosowań, takich jak proteomika lub Western Blotting.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować członkom grupy Krachler za krytyczną lekturę manuskryptu. DHS, DV i AMK były finansowane przez Radę ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BB/L007916/1), FA było finansowane przez Stypendium Ministerstwa Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych Republiki Iraku, a NPS było finansowane przez Stypendium CONICYT.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
Tris(2-karboksetylo)fosfina (TCEP)	Sigma	646547	Niebezpieczeństwo; można kupić jako roztwór lub świeżo przygotowany
4-(p-maleimidofenylo)maślan sulfosuccinimidylu (Sulfo-SMPB)	Fisher	PN22317	Niebezpieczeństwo; toksyczny
L-cysteina	Sigma	30089	Niebezpieczeństwo; toksyczny
Koraliki lateksowe, polistyren modyfikowany aminami, niebieski fluorescencyjny - zawiesina wodna, 2,0 μ m średnia wielkość cząstek	Sigma	L0280	szkodliwe; dostępny jest szereg alternatywnych rozmiarów i kolorów cząstek
1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimid (EDC)	Thermo scientific	22980
N-hydroksysukcynimid (NHS)	Thermo scientific	24500
Koraliki polistyrenowe modyfikowane karboksylanem	Sigma	CLB9	szkodliwe; Dostępny jest szereg alternatywnych rozmiarów i kolorów cząstek
Etylenodiamina	Sigma	E26266	Niebezpieczeństwo; łatwopalne,, toksyczne, uczulające
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Odczynnik Bradford Promega	W3841
	Sigma	B6916	Niebezpieczeństwo; i toksyczne
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średnia - wysoka glukoza - Z 4 500 mg/L glukozy i wodorowęglanem sodu, bez L-glutamina, pirogronian sodu i czerwień fenolowa, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych	Sigma	D1145	do eksperymentów z infekcjami
DMEM	Sigma	D6429	do utrzymania hodowanych komórek gospodarza
Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie	Sigma	F9665	suplement do pożywki
do hodowli tkankowychPenicylina-Streptomycyna - Roztwór stabilizowany, z 10 000 jednostek penicyliny i 10 mg streptomycyny/ml, sterylnie przefiltrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych	Sigma	F9665	suplement do pożywki do hodowli tkankowych
PBS	Sigma	D8537
LDH Zestaw do wykrywania cytotoksyczności	Takara	MK401
z tworzywa sztucznego
(25 ml)	SLS	F267660
płytki 24-dołkowe	Greiner	662160
96-dołkowe płytki	Greiner	655182

Sprzęt
hemocytometru
			czytnik
płytek
urządzenia do hodowli tkankowych
Pipeta

: Zbiorniki na odczynniki do mikrowirówek wielokanałowa

Bibliografia

Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421(2014).
Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules. Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).
Bingham, R. J., et al. Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).
Ensenberger, M. G., et al. Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin. J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).
Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function. PLoS One. 8 (11), e81216(2013).
Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel. Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).
Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Adhezyny bakteryjne kuleczki polistyrenowe sprzęganie kierunkowe sprzęganie białek test cytotoksyczności receptory komórek gospodarza pomiar adhezji kuleczki fluorescencyjne dehydrogenaza mleczanowa

Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz